罗非鱼属鲈形目、丽鱼科，是世界上最重要的水产养殖对象之一^[1]，也是中国主要的出口水产品品种^[2]。不同罗非鱼种类的养殖性能不同，其中，尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长速度快，但耐盐性较差^[3]；萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)耐盐能力强，但生长极其缓慢^[4]。为培育耐盐罗非鱼养殖品种，上海海洋大学通过人工授精方式成功获得了尼罗罗非鱼(♀)×萨罗罗非鱼(♂)远缘杂交F₁^[5]。远缘杂交是不同种的杂交，包括科间、亚科间、属间及种间杂交，主要以种间、属间杂交为主，目间杂交较少^[6]。目前淡水鱼类远缘杂交主要以罗非鱼种间杂交种为主^[7]，后代一般在生长速度、性别比例、耐寒、体色、耐盐等方面具有杂种优势^[8]。尼萨罗非鱼杂交为属间杂交，制种难度大，而尼萨杂交一代雌、雄鱼性腺均能正常成熟，自然繁殖即可获得杂交F₂(吉丽罗非鱼：GS-02-002-2009)，吉丽罗非鱼生长速度和耐盐性均介于2个亲本之间^[9]。适于15~25盐度下养殖，且易于批量生产^[5]。

对尼萨杂交后代的染色体与遗传特征研究表明，尼萨杂交后代F₁、F₂均为二倍体，F₁各位点为尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼等位基因组合的杂合基因型，F₂较好地继承了F₁的遗传杂合性，但也存在一定程度的分离现象^[10]。远缘杂交不仅是鱼类杂交育种的重要手段，还是产生多倍性等的重要途径^[11]，如红鲫(Carassius auratus red variety)(♀)(2n=100)与团头鲂(Megalobrama amblycephala)(♂)(2n=48)间远缘杂交，后代F₁中有不育的三倍体鲫鲂(3n=124)和两性可育的四倍体鲫鲂(4n=148)；红鲫(♀)(2n=100)×鲤(Cyprinus carpio)(♂)(2n=100)远缘杂交获得的F₁和F₂为二倍体，而F₃中有少部分两性可育的四倍体鲤鲫(4n=200)^[12]；草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(♀)(2n=48)与鳙(Aristichthys nobilis)(♂)(2n=48)杂交也得到三倍体杂交后代^[13]。为此，笔者利用部分尼萨杂交F₂成熟个体配组自繁生产，获得了尼萨杂交F₃，对其后代倍性及遗传特征进行分析研究。

微卫星标记具有数量大、分布广且均匀、多态信息含量(PIC)高、共显性遗传、分析方便等优点，在遗传多样性、亲子鉴定、标记辅助选择等方面得到广泛应用^[14-16]。文章通过筛选罗非鱼遗传图谱中的微卫星分子标记，对尼罗罗非鱼(♀)×萨罗罗非鱼(♂)杂交后代F₂、F₃群体遗传特征进行比较分析，研究其不同杂交世代的遗传与变异规律，以期为尼萨罗非鱼远缘杂交利用提供参考。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

尼罗罗非鱼(♀)×萨罗罗非鱼(♂)杂交F₂、F₃均取自广东国家级罗非鱼良种场。尼萨杂交F₁为2012年7月通过人工授精获得，170余尾；杂交F₂为该杂交F₁的2013年6月自繁后代；杂交F₃为杂交F₂的2014年6月自繁后代。从F₂、F₃群体中各随机抽取30尾，分别剪取鳍条，于无水乙醇中保存。

1.2   实验方法

1.2.1   DNA提取

使用动物基因组DNA提取试剂盒，提取所采鳍条DNA；用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，用紫外分光光度计测出浓度，用ddH₂O稀释至50 ng · μL^-1，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2   引物筛选

参考尼罗罗非鱼第二代遗传连锁图谱及文献[17]，选取28个微卫星位点，并从GenBank中下载这些微卫星位点的序列，利用Primer Premier 5.0进行引物设计，由上海捷瑞生物工程技术服务有限公司合成。表 1为筛选后得到的7对在杂交F₂、F₃均扩增出差异条带的微卫星引物。

表  1  7对微卫星引物信息

Table  1  Information of seven pairs of microsatellite primers

位点 locus	GenBank登录号 GenBank No.	引物序列(5′→3′) primer sequence	重复序列 repeat unit	退火温度/℃ annealing temperature
GM258	BV005380	F：CCTTCACCTCCACCACTTTCT R：AGATCGAACGTCGTCCTCTG	(CA)n	64
GNH990	G69270	F：GCCACAGGTGACCATGTTAG R：GGTGTCTGATTGCACTGACG	(TG)n	62
GM222	BV005366	F：AACGGTGACATCTTCGCAACT R：GATTTGGCTATCTGGCGTGTG	(CA)n	62
UNH906	G68220	F：AACATGCTTTCAGCCTTCGT R：TGAGCAAATCCCGTCCATA	(AC)n	56
GM021	BV005272	F：CTGGCTGTGCACAACA R：TTTGTAAGCAGTCAACACATT	(CA)n	59
GM017	BV005269	F：CCCTCTGTTTCCATCTCA R：GATACCTGTCCATACCTCCTC	(CA)n	56
GM145	BV005330	F：AGCCATCCCCGTCTTTCT R：TATTTTCTGTGAGCCCGTTTG	(AC)n	58
注：F.正向引物；R.反向引物 Note：F. the forward primer；R.the reverse primer

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1.2.3   PCR扩增与电泳检测

反应总体积25 μL，包括1 μL基因组DNA，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix(含1 U Taq酶；0.5 mmol · L^-1 dNTP；20 mmol · L^-1 Tris-HCl，pH=8；100 mmol · L^-1 KCl；3 mmol · L^-1 MgCl₂)，正、反向引物各1 μL，9.5 μL ddH₂O。在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR仪上扩增，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，56~64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染检测，在观察灯下观察并用数码相机拍照。

1.2.4   数据分析

为了减少误差，只统计清晰的条带。根据电泳扩增条带数目、泳动距离来判断个体基因型，电泳扩增条带若为1条带，则认为该基因座为纯合；若表现为2条带，则认为该基因座为杂合。

应用Quantity One软件进行电泳条带分析，并经过人工校对，估算条带(等位基因)的大小。利用Popgen 32软件计算等位基因数(N_a)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)；Cervus 3.0软件计算多态信息含量。

2.   结果

2.1   微卫星标记筛选

利用28对微卫星引物对尼萨F₂、F₃群体进行PCR扩增，22对引物能同时在尼萨F₂、F₃中稳定扩增出条带，从中筛选出在尼萨F₂、F₃中扩增条带差异的位点7个，分别为GM258、GNH990、GM222、UNH906、GM021、GM017和GM145(表 1)，各位点的等位基因大小为110~280 bp。在GM222和UNH906位点上，F₂出现杂合型条带，而在F₃中所检测个体均出现单一条带，这些位点可作为F₂与F₃群体遗传鉴别的重要依据。图 1为GM021、UNH906和GM222引物在F₂与F₃群体中的部分扩增图谱。

图  1  尼萨杂交F₂、F₃群体GM021(a)、UNH906(b)和GM222(c)位点扩增结果

M. DNA标记；1~20. F₂；21~33. F₃

Fig. 1  Amplification results of GM021(a), UNH906(b) and GM222(c) in F₂ and F₃ hybrid populations of O.niloticus♀×S.melanotheron♂

M. molecular marker; 1~20. F₂; 21~33. F₃

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2.2   尼萨杂交F₂、F₃遗传多样性

根据7对特异性引物扩增结果，获得了尼萨杂交F₂、F₃群体N_a、有效N_a、H_o、H_e和PIC(表 2)。杂交F₂群体中共检测到等位基因19个，平均N_a为2.71，平均H_o为0.632，平均PIC为0.466；杂交F₃群体中共检测到等位基因15个，平均N_a为2.14，平均H_o为0.432，平均PIC为0.370。

表  2  尼萨杂交F₂、F₃微卫星位点的多态性

Table  2  Polymorphism of microsatellite loci of hybrid populations F₂ and F₃

位点 locus	等位基因数(Na) number of alleles		有效等位基因数(Ne) effective number of alleles		观测杂合度(Ho) observed heterozygosity		期望杂合度(He) expected heterozygosiy		多态信息含量(PIC) polymorphim information
	F2	F3	F2	F3	F2	F3	F2	F3	F2	F3
GM258	3	3	2.32	2.17	0.672	0.831	0.592	0.643	0.547	0.498
GNH990	3	3	2.41	2.17	0.439	0.389	0.563	0.334	0.553	0.271
GM017	3	3	2.22	2.06	0.673	0.608	0.557	0.519	0.451	0.501
GM222	2	1	1.97	1.46	0.669	0	0.509	0	0.370	0
UNH906	3	1	2.34	1.00	0.560	0	0.589	0	0.507	0
GM021	3	2	2.66	2.00	0.779	0.611	0.641	0.509	0.542	0.367
GM145	2	2	1.92	1.87	0.613	0.558	0.468	0.413	0.460	0.369
平均mean	2.71	2.14	2.26	1.82	0.632	0.432	0.561	0.340	0.466	0.370

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2.3   尼萨杂交F₂、F₃基因型及等位基因比较

尼萨杂交F₂、F₃ 7个微卫星位点的基因型、等位基因分布见表 3和表 4。从基因型数目上看，F₃基因型在3个位点(GNH990、GM017和GM145)上与F₂完全相等，位点GM222、UNH906、GM258和UNH906上F₃基因型数目少于F₂，其中位点GM222和UNH906出现纯合型。

表  3  尼萨杂交F₂、F₃中微卫星位点的基因型分布

Table  3  Genotype distribution of seven microsatellite loci of hybrid populations F₂ and F₃

位点 locus	F2 基因型(数目) F2 Genotype (number)	F3 基因型(数目) F3 Genotype (number)
GM258	AA(2)、AB(9)、AC(5)、BC(6)	AA(5)、AB(6)、AC(11)、
GNH990	AA(10)、AB(4)、BC(8)	AA(10)、AB(7)、AC(5)
GM017	AA(4)、AB(11)、BC(3)、BB(4)	AA(6)、AB(8)、BC(6)、BB(2)
GM222	AA(6)、AB(14)、BB(2)	AA(22)
UNH906	AA(6)、AB(8)、AC(4)、CC(4)	AA(22)
GM021	AA(6)、AB(10)、BC(6)	AB(22)
GM145	AA(11)、AB(11)	AA(12)、AB(10)

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表  4  尼萨杂交F₂、F₃中微卫星位点的等位基因频率

Table  4  Allele frequency in seven microsatellite loci of hybrid populations F₂ and F₃

位点 locus	F2等位基因频率F2 allele frequency				F3等位基因频率F3 allele frequency
	A	B	C		A	B	C
GM258	0.409	0.341	0.250		0.523	0.227	0.250
GNH990	0.545	0.273	0.182		0.727	0.159	0.114
GM017	0.432	0.500	0.068		0.455	0.409	0.136
GM222	0.591	0.409	-		1.000	-	-
UNH906	0.545	0.182	0.273		1.000	-	-
GM021	0.500	0.364	0.136		0.500	0.500	-
GM145	0.750	0.250	-		0.773	0.227	-

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位点GNH990和GM145上F₂、F₃纯合基因型与杂合基因型的比例均接近为1 : 1；位点GM017上F₂、F₃纯合基因型与杂合基因型的比例为1 : 2；位点GM021上F₂纯合基因型与杂合基因型的比例为1 : 3，F₃中全部为杂合基因型；位点GM222和UNH906上F₃中全部为纯合基因型，F₂纯合基因型与杂合基因型比例分别为1 : 3和1 : 2；位点GM258上F₂、F₃中出现纯合基因型比例较低。

在7个位点等位基因频率(A)分布上，F₃中优势等位基因频率较F₂都有一定程度提高(位点GM021保持不变)，F₃中B等位基因频率较F₂都有一定程度降低；位点GM222和UNH906上F₃中B等位基因消失。位点GM258上F₃中C等位基因频率与F₂一致，位点GNH990上F₃中C等位基因频率较F₂有一定程度降低；位点GM222、GM145、UNH906和GM021上F₃中C等位基因消失。

3.   讨论

由于亲本间存在明显的遗传差异，远缘杂交往往会出现偏孟德尔遗传分离现象，主要表现在产生多倍体、诱导雌核或雄核发育以及后代的遗传分化^[18]。由于微卫星具有高多态性，随机分布于核基因组中，且遵循孟德尔遗传方式等特点，因此，可以通过观察不同位点的扩增条带数目来估计个体的倍性。张小敏等^[19]利用微卫星位点扩增条带数目，观察到76.92%的达氏鳇(Huso dauricus)个体显示为六倍体，15.38%的个体显示为八倍体，7.79%的个体显示为四倍体；程磊等^[20]用微卫星标记研究鲤×三倍体鲫(Carassius auratus)杂种家系的基因型，证明三倍体鲫起源于二倍体鲫的同源加倍，而非二倍体鲫和鲤的种间杂交。此研究所检尼萨杂交F₂、F₃个体中，各位点均表现为1~2条带，未发现有多倍体。笔者将继续扩大尼萨F₃群体的遗传检测范围，并辅以细胞遗传学检测。

此研究从28对微卫星标记中筛选获得了在尼萨杂交F₂、F₃群体之间存在差异的7个微卫星标记：GM258、GNH990、GM017、GM222、UNH906、GM021和GM145；其中GM258、GNH990、UNH906和GM021位点为高度多态性(PIC＞0.5)，其他3个位点表现为中度多态性(0.25＜PIC＜0.5)，这些多态性位点可以作为尼萨杂交F₂和F₃群体鉴别的遗传标记。此研究显示，尼萨杂交F₃群体的平均H_o为0.432，平均PIC为0.370，低于F₂(H_o=0.632，PIC=0.466)，表明F₃群体遗传杂合性较F₂群体下降。杂种优势一般表现在杂交一代中，由于亲本基因重组，基因杂合性最高，从而表现出明显的杂种优势。已有研究表明，尼萨杂交F₁所有位点上均呈现杂合型，F₂较好地继承了F₁的遗传杂合性，但也存在一定程度的降低^[21]。此研究中，F₃中平均杂合度、PIC均小于F₂，由此可见，随杂交世代增加，由于亲本中杂合态等位基因的分离与重组，引起遗传杂合性下降。

尼萨杂交F₂自繁F₃过程中，在基因型与等位基因频率上均表现出一定的纯合，表明优势等位基因频率在F₃中上升，非优势等位基因频率下降。基因型数目方面，位点GNH990、GM017和GM145上，F₂、F₃基因型数目相同，位点GM258、GM222、UNH906和GM021上F₃基因型数目少于F₂；基因型类型方面，F₃中纯合基因型所占比例有明显提高，如在位点UNH906，F₂纯合基因型与杂合基因型的比例为1 : 1，在F₃中则全部出现纯合。N_a方面，位点GM258、GNH990、GM017和GM145上N_a不变；位点GM222、UNH906和GM021上F₂ N_a多于F₃，且在位点GM222和UNH906上F₃出现所有个体纯合的现象(部分位点N_a不一致可能与分析样品数目较少或非随机交配有关)。从等位基因频率上看，与F₂相比，F₃优势等位基因频率都有一定的提高，非优势等位基因频率都有所下降，如位点GM258上F₂中的A基因频率40.9%、B基因频率34.1%，F₃中A基因频率52.3%、B基因频率22.7%。随着杂交世代增加，后代中发生了基因型纯合比例增大，优势等位基因频率提高的变化趋势。