随着水产养殖业迅猛发展，养殖过程产生的大量残饵、代谢产物造成池塘水体富营养化日益加剧，导致蓝藻大量繁殖，蓝藻水华高频率爆发^[1-2]。蓝藻会大量耗氧且能释放蓝藻毒素、羟胺及硫化氢等有毒有害物质，严重败坏养殖水体，造成养殖对象的中毒死亡，对水体生态环境和养殖效益造成巨大影响^[2]。目前生产上多使用铜制剂、除草剂等化学药品杀灭有害藻类，但其杀藻专一性差，不利于养殖水体优良菌藻环境的养护，并且还易造成药物残留，影响水产品质量安全^[3]。有研究表明，利用溶藻菌(algicidal bacteria)可特异性地抑制有害微藻，达到优化水体微藻群落的效果^[4-6]。当前该领域的研究热点主要集中于海洋赤潮和湖沼水华的有害微藻种类的特性与治理等方面，YANG等^[7]筛选了溶解赤潮中肋骨条藻(Skeletonema ostatum)的溶藻菌SK-5，THEERASAK等^[8]筛选了杀灭引起蓝藻水华的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的放线菌，但有关运用溶藻菌抑制池塘水体有害微藻的研究少见报道^[9-10]。池塘环境与上述水体环境差异巨大，在微藻优势种群结构、水体营养水平、人工技术措施等方面的差别致使针对开放性水域的相关研究无法直接借鉴到养殖生产应用中。对此，实验选用曹煜成等^[11]筛得的一株池塘蓝藻溶藻菌——蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CZBC1。蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，广泛存在于环境中，有研究表明其非毒性菌株可用以调节生物消化道菌群，净化养殖水质，促进养殖生物健康生长，目前已被应用于医药、农业生产等领域^[12-14]。阳钢^[15]通过向水体泼洒蜡样芽孢杆菌BC-1有效提高了刺参(Apostichopus japonicus)的生长速度；何鉴尧等^[16]筛得两株蜡样芽孢杆菌L7和L8对螺旋鞘丝藻(Lyngbya contarta)均有显著的控制效果。该实验选用的蜡样芽孢杆菌CZBC1具有适应广温、广盐、耐高pH和低耗氧的特性，可以通过直接或间接机制溶解浮游颤藻、绿色颤藻、小颤藻等有害蓝藻^[17]，对养殖对虾也无不良影响^[18]。但关于该菌对养殖水体微藻群落的影响效果还未见报道。该实验将CZBC1加入对虾养殖水体，研究不同微藻优势种的变化情况，以期从微藻群落水平分析CZBC1对优势种演替的影响效应，摸清菌株对养殖水体蓝藻优势度的调控效果，初步明确该菌株使用浓度、起效时间、使用方法等相关技术参数，为今后建立系统的应用技术体系、实现菌剂的产业应用与推广提供基础参考。

1.   材料与方法

1.1   材料

溶藻细菌CZBC1和绿色颤藻由中国水产科学研究院南海水产研究所对虾健康养殖实验室提供。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和实验水体取自中山大学珠海海洋生物技术研究开发中心对虾养殖高位池，实验对虾体长和体质量分别为(6.74±1.14)cm和(2.82±1.17)g，对虾暂养于200 L的PVC桶中，每日投喂3次人工配合饵料，连续充气，7 d后开始实验。

1.2   方法

1.2.1   菌液制备

无菌条件下接种CZBC1至500 mL已灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃ 200 r · min^-1恒温震荡培养48 h，4 ℃下7 000 g离心5 min收集菌体，菌体沉淀用灭菌PBS(磷酸盐缓冲液)重悬备用。菌液加入实验水体前以稀释涂布平板法确定菌量^[17]。

1.2.2   藻液制备

接纯种绿色颤藻于600 mL已灭菌BG11培养液中扩大培养。培养温度为28 ℃，光照强度为2 500 lx，光暗周期为12 h : 12 h，间或振荡防止藻细胞贴壁。待微藻生长至10⁶个·mL^-1时，4 ℃下5 000 g离心5 min收集藻细胞，藻细胞沉淀用灭菌PBS缓冲液重悬备用。藻液加入实验水体前用血球计数板精确计数^[17]。

1.2.3   实验设置

彭聪聪等^[19]报道养殖后期虾池有害蓝藻优势度可达70%以上。据此，在20 L小型水族箱注入对虾养殖池塘水体，通过添加培养的绿色颤藻藻液提高绿色颤藻优势度。起始实验水体共检出微藻36种，分别属于蓝藻门、绿藻门、硅藻门、甲藻门和裸藻门(表 1)，微藻总数量为8.60×10⁵个· mL^-1。其中优势种有绿色颤藻和波吉卵囊藻，其优势度分别为64.14%和16.42%，数量分别为5.63×10⁵ 个· mL^-1和1.41×10⁵个·mL^-1。各实验水体分别放养凡纳滨对虾15尾。根据CZBC1施菌量分为J0组(不施菌)、J3组(用菌量3.00 × 10³ CFU · mL^-1)和J5组(用菌量3.00 × 10⁵ CFU · mL^-1)。各组均设3个平行，实验周期15 d，实验期间不换水。

表  1  起始实验水体浮游微藻种类及丰富度

Table  1.  Species and richness of microalgae in initial experimental water

种类 species	丰富度 richness	种类 species	丰富度 richness
蓝藻门(Cyanophyta)		狭形纤维藻(A.angustus)	+
绿色颤藻(Oscillatoria chlorine)	+++	多芒藻(Golenkinia radiata)	+
铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)	+	中华螺翼藻(Scotiella fristch)	+
水华微囊藻(M.floslutea)	+	微芒藻(Micractinium pusillum)	+
点形平裂藻(Merismopedia punctata)	+	斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)	+
细小平裂藻(M.minina)	+	棘球藻(Echinosphaerella limnetica)	+
微小色球藻(Chroococcus minutus)	+	针形纤维藻(A.acicularis)	+
立方藻(Eucapsis sp.)	+	湖生卵囊藻(O.lacustris)	+
微小隐球藻(Aphanocapsa delicatissima)	+	硅藻门(Bacillariophyta)
大螺旋藻(Spirulina major)	+	线形菱形藻(Nitzschia linearis)	+
绿藻门(Chlorophyta)		新月菱形藻(N.closterium)	+
波吉卵囊藻(Oocystis borgei)	+++	奥尔韦舟形藻(Navicula bacillum)	+
蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidesa)	++	谷皮菱形藻(N.palea)	+
二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)	+	牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)	+
四尾栅藻(S.quadricauda)	++	条纹小环藻(Cyclotella striata)	+
奥波莱栅藻(S.opoliensis)	+	披针形桥弯藻( Cymbella lanceolata)	+
卷曲纤维藻(Ankistrodesmus convolutus)	+	甲藻门(Dinophyta)
三角四角藻(Tetra dron trigonum)	+	二角多甲藻(Peridinium bipes)	+
螺带鼓藻(Spirotaenia condensata)	+	裸藻门(Euglenophyta)
双对栅藻交错变种(Scenedesmus bijuga)	+	绿色裸藻(Euglena viridia)	+
四角十字藻(Crucigenia quadrata)	+
注:+代表稀有种；+ +代表常见种；+ + +代表优势种 Note：“+” indicates dominant species；“+ +” indicates common species；“+ + +” indicates rare species

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每天9：00定时测定实验水体温度、pH(氢离子浓度指数)、溶解氧、光照强度。实验期间水温为20.0~25.6 ℃，pH为6.4~8.1，溶解氧质量浓度为6.56~8.36 mg · L^-1，水体盐度为4.5~6.0，光照强度为400~3 800 lx，各组之间无显著性差异(P>0.05)。

1.2.4   样品采集与分析

实验过程每天实时统计对虾存活情况，计算死亡率。于第0、第2、第4、第6、第9、第12、第15天时采集水样，以4%甲醛固定后用浮游植物计数框在显微镜下进行微藻种属鉴定、细胞计数；同时，水样以甘露醇多粘菌素卵黄培养基平板法(GB/T 4789.14—2003)^[20]于37 ℃培养24 h，计算蜡样芽孢杆菌数量。

1.3   微藻鉴定、计数与优势度计算

参考胡鸿钧和魏印心^[21]、郭玉洁和钱树本^[22]对样品进行微藻种属鉴定并计数，分析优势微藻的优势度、数量及微藻总数量变动。

Simpson优势度指数：Y=(n_i/N)×f_i

N为微藻细胞总数量，n_i为第i种的微藻数量，f_i为第i种微藻在各个视野出现的频率；当Y>10%认为该微藻为群落中的优势种，1%<Y<10%为常见种，Y<1%时为稀有种^[23-24]。

1.4   数据处理与统计分析

采用SPSS 16.0对微藻总数量，绿色颤藻和波吉卵囊藻的优势度、数量，对虾死亡率进行t检验(P<0.05)。

2.   结果

2.1   微藻总数量的变动

各组的微藻总数量初始值均为8.60×10⁵ 个·mL^-1。实验期间，J0组的微藻总数量呈持续上升趋势，第9天时略有下降，第15天时达到最高(4.56×10⁶ 个· mL^-1)。J3组和J5组的微藻总数量呈现先升高后降低的趋势，J3组第9天时升至最大值(3.32×10⁶ 个· mL^-1)，然后下降，第15天时为1.28×10⁶ 个· mL^-1。J5组第9天时达到最大值(2.04×10⁶ 个· mL^-1)，第15天时降至1.48×10⁶ 个· mL^-1(图 1)。

图  1  各组微藻总数量的变动

Figure  1.  Variation of total quantity of microalgae

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2.2   几种主要微藻优势度的变动

在实验水体微藻群落中，优势度相对较高(优势度>1%)的微藻种类主要有：绿色颤藻、波吉卵囊藻、奥博莱栅藻、细小平裂藻、二形栅藻、蛋白核小球藻、四尾栅藻、立方藻等，其中绿色颤藻、波吉卵囊藻、奥博莱栅藻、细小平裂藻等几种微藻的优势度高于其他种类。

与实验初始相比较，实验结束时J0组绿色颤藻、奥博莱栅藻的优势度分别提高了17.72%和0.52%，波吉卵囊藻和细小平裂藻则分别降低了13.29%和0.21%；J3组绿色颤藻的优势度降低了47.44%，而波吉卵囊藻、奥博莱栅藻和细小平裂藻分别提高了16.00%、4.04%和1.56%；J5组绿色颤藻的优势度降低了50.08%，波吉卵囊藻、奥博莱栅藻和细小平裂藻则分别提高了24.32%、6.15%和0.95%(图 2)。至于蛋白核小球藻和四尾栅藻的优势度在各组均有一定程度下降，但组间差异不显著(P>0.05)，各组的立方藻和二形栅藻优势度则略有上升，组间差异同样未达到显著性水平(P>0.05)。

图  2  几种主要微藻优势度的变动

Figure  2.  Dynamic variation of dominance of several important microalgae

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2.3   绿色颤藻和波吉卵囊藻优势度、数量的动态变化

绿色颤藻和波吉卵囊藻的初始优势度分别为64.14%和16.42%，初始数量分别为5.63×10⁵ 个· mL^-1和1.41×10⁵ 个· mL^-1。实验中，J0组绿色颤藻优势度第2天时略有下降，其后持续升高，第15天时达到81.86%；J3组、J5组绿色颤藻优势度则持续下降，第15天时分别大幅降低至16.7%和14.6%，显著低于J0组(P<0.01)。J0组绿色颤藻数量略有减少后持续增加，第15天时达到最高值(4.05×10⁶ 个· mL^-1)；J3组、J5组绿色颤藻数量均在第9天时达到最大值，分别为1.32×10⁶ 个· mL^-1和9.07×10⁵ 个· mL^-1，而后减少，第15天时分别为4.21×10⁵ 个· mL^-1和3.44×10⁵ 个·mL^-1，显著低于J0组(P<0.01)(图 3-a)。

图  3  各组绿色颤藻(a)和波吉卵囊藻(b)数量和优势度的变动

Figure  3.  Dynamic variation of dominance and quantity of O.chlorine and O.borgei

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J0组波吉卵囊藻优势度持续下降，第15天时降至3.13%；J3组和J5组波吉卵囊藻优势度总体呈上升趋势，第15天时分别升高至32.42%和47.14%，显著高于J0组(P<0.01)。J0组波吉卵囊藻数量变化不显著，第15天时为1.42×10⁵ 个·mL^-1；J3组和J5组波吉卵囊藻数量先增加后减少，第9天时达到最高值(6.91×10⁵ 个· mL^-1和4.93×10⁵ 个· mL^-1)，第15天时分别为4.11×10⁵ 个· mL^-1和5.48×10⁵ 个· mL^-1，显著高于J0组(P<0.01)(图 3-b)。

2.4   蜡样芽孢杆菌数量的动态变动

对照组也有一定数量的蜡样芽孢杆菌，初始值为2.00×10 CFU · mL^-1，波动范围(3.30~3.32×10)CFU · mL^-1(图 4)。用菌组蜡样芽孢杆菌的数量总体呈下降趋势，J3组和J5组蜡样芽孢杆菌的数量在第2天时均有小幅减少，第4天时基本回升到初始水平，其后逐渐减少。其中J3组蜡样芽孢杆菌变化范围为(2.00×10~3.00×10³)CFU · mL^-1，在第5天之前一直维持在10² CFU ·mL^-1以上；而J5组蜡样芽孢杆菌变化范围为(6.73×10²~3.00×10⁵)CFU · mL^-1，一直到第9天时依然维持在10⁴ CFU · mL^-1的数量水平，第15天时还有6.73×10² CFU · mL^-1。

图  4  各组蜡样芽孢杆菌数量的变动

Figure  4.  Dynamic variation of quantity of B.cereus

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2.5   对虾死亡率的变动

实验中，J0组对虾最早出现死亡，且死亡速率最大，死亡率最高。第4天J0组对虾死亡率为35.6%，J3组和J5组分别为6.7%和4.4%；第6天，J0组对虾死亡率已经达到82.2%，而J3、J5组分别为46.7%和31.1%，远低于J0组(P<0.05)。由于第7天突然降温，导致48 h内水温下降4 ℃，水温的变动以及实验系统封闭产生的胁迫影响了各组对虾死亡率，导致各组死亡率之间的差别逐渐缩小，第15天J0组、J3组和J5组的对虾死亡率分别为100%、91.1%和80%。

3.   讨论

3.1   溶藻菌的溶藻专一性

溶藻菌可以通过直接接触或者释放某些特异或非特异性的胞外物质溶解藻细胞，还可以通过竞争氮(N)、磷(P)营养盐的方式抑制微藻生长达到控藻的效果。贾雯等^[10]筛选了一株侧孢短芽孢杆菌，其代谢产物对颤藻有良好的溶解效果；TEEYAPORN等^[9]筛选了一株海杆菌BS2，对虾池夜光藻(Noctiluca scintillans)也有明显的抑制作用。目前大多数研究仍为针对溶藻菌对某一特定湖沼水华和沿海赤潮的有害微藻种类的溶解特性研究^[25-26]，并未同时分析菌株对非水华或非赤潮微藻种类的影响，这在一定程度上回避了环境中的微藻多以群落形式出现的客观存在。如果所筛选的菌株缺乏溶藻专一性，那在应用过程中就有可能会造成水体微藻群落的瞬间急剧崩溃，同样不利于水体生态环境的稳定与维护。因此，基于微藻群落水平探讨溶藻菌的溶藻专一性尤为重要。

该研究充分考虑了养殖池塘水体微藻群落多样性的特征，将颤藻溶藻菌CZBC1添加至对虾养殖水体中。结果显示，对照组中绿色颤藻优势度由64.14%提高到81.86%，波吉卵囊藻优势度由16.42%降至3.13%；而实验组绿色颤藻优势度分别降低至16.7%和14.6%，波吉卵囊藻优势度提高到32.42%和47.14%。这表明：1)CZBC1对微藻群落中的蓝藻优势种——绿色颤藻具有良好的溶藻专一性，而对绿藻优势种——波吉卵囊藻无杀灭作用；2)推动实验水体微藻群落优势种更替的外在动力，源自颤藻数量在CZBC1的干预下大幅下降，使得其生态竞争力有所减弱，让出了原本占有的强势生态位，这为原来处于次优势地位的卵囊藻提供了充分的营养与生态空间，进而促进了卵囊藻的大量生长，占有了微藻群落中的强势生态位。何鉴尧等^[16]将蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等3株溶藻细菌投入富营养化的景观湖水体，结果显示，水体微藻优势种由螺旋鞘丝藻向小球藻(Chlorella vulgaris)、四尾栅藻和膨胀新月藻(Closterium tumidum)演替，对照组螺旋鞘丝藻优势度仍高达81%。王丽花^[17]研究发现CZBC1可明显抑制绿色颤藻的生长，对小球藻无抑制作用，且能促进栅藻细胞增殖；曹煜成^[18]研究指出将CZBC1投入微囊藻、颤藻与小球藻的混合培养系统中，菌株只对铜绿微囊藻、绿色颤藻等产生溶解效应，对小球藻不仅没有不良影响，还可在CZBC1的干预下取得藻藻竞争优势，藻细胞数量提高30倍以上，有效防控混合培养系统中的微囊藻和颤藻再次形成优势种群，均与该研究结果类似。然而，以上研究均为基于单种或两种微藻的实验室水平的菌藻生物学实验探讨，而并未针对养殖水体自然微藻群落结构实际，从微藻优势种群演替的角度进行系统的分析。因此，该实验结果可成为以上研究的系统性补充与完善，同时也为将菌株CZBC1进一步推向养殖生产的产业应用提供了更为客观和有借鉴意义的数据参考。

总体而言，只有经过针对性筛选的溶藻菌菌株才能对单一种属的蓝藻或甲藻具有良好的溶解杀灭功效，并且还能有效地定向控制水环境中微藻优势种的演替，在保证不影响微藻群落生态功能的前提下达到群落结构优化的目标。相较而言，使用化学杀藻剂或非溶藻专一性的溶藻菌制剂，无选择性地杀灭水体中的所有微藻，这并不利于微藻环境的稳定，也达不到调控微藻群落优化水体环境的效果。

3.2   利用溶藻菌与普通有益菌制剂调控水体微藻群落的区别

另有学者报道，在养殖过程中定期投放地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)有利于促进虾池微藻平稳繁殖，抑制蓝藻和甲藻的生长，促进绿藻形成优势，维持养殖水体微生态稳定^[27]，而研究所选用的地衣芽孢杆菌对蓝藻和甲藻并不具有溶藻特性，但仍可实现调控微藻群落结构的效果。这可能是因为蓝藻通常在富营养化的环境中更具竞争优势^[28-29]，而对虾养殖池塘水体一般前期多为贫营养状态，微藻群落多形成以绿藻、硅藻为优势的种群结构^[30-32]，随着生产过程中残余饲料和养殖代谢产物的不断积累，水体营养水平不断升高，为蓝藻或甲藻等喜污性微藻种类提供了充足的营养供给，从而促使它们在养殖中后期逐渐形成明显的生态优势^{[1, 33]}。通过定期使用非溶藻性质的芽孢杆菌制剂，可在养殖前中期就及时降解水体中的有机质，由此转化形成的营养盐又为绿藻和硅藻等优势种群所利用，并促使其始终占据优势生态位^[33-34]，通过微藻种群间的竞争进而有效抑制蓝藻的生长。通过“异养菌-环境营养-微藻群落”的途径，实现间接的非定向调控微藻群落。而溶藻菌主要通过胞外酶的化感作用溶藻或直接进入藻细胞内杀灭特定的有害微藻^{[25, 35]}，实现定向调控微藻群落结构的效果。可见，利用溶藻菌与普通有益菌制剂调控水体微藻群落的的作用机制存在根本性的差别。

所以，在养殖生产应用前应该进行系统研究，明确不同菌株的功能特性，根据养殖水体微藻群落结构和水体环境营养水平的具体情况，在不同的阶段合理选用溶藻菌制剂和普通有益菌制剂调控水体藻菌生态，协同运用以上2种技术方案，双管齐下更有利于达到稳定养护水体优良藻菌生态环境、优化水质、促进养殖动物健康生长的效果。

4.   结论

溶藻细菌CZBC1可有效抑杀对虾养殖水体优势蓝藻——绿色颤藻，为波吉卵囊藻(绿藻)占据生态优势提供有利空间，起到优化微藻群落的效果，为养殖对虾提供良好的水生态环境。将溶藻细菌CZBC1应用于养殖生产时，可按10³ CFU · mL^-1浓度，每5 d定期施用于养殖水体，可抑制有害蓝藻优势，为养殖生产提供良好的微藻环境。