广谱抗生素氟甲砜霉素属于第二代氯霉素类动物专用药物，是甲砜霉素的氟化衍生物。氟甲砜霉素不仅体外抗菌活性良好，抑菌效果非常显著，而且使用安全，不会引起人类的再生障碍性贫血。因此，目前氟甲砜霉素已广泛应用于水产养殖业。

在氟甲砜霉素残留检测方面，Nagata等^[1]报道了动物肌肉和养殖鱼类肌肉中的氟甲砜霉素残留的HPLC法。虽然该方法灵敏度高，但是耗时多，处理样品过程中化学试剂用量大。Hormazabal等^[2]报道了虹鳟组织内氟甲砜霉素的HPLC法，方法亦相当繁琐。在血浆中的药物残留分析方面，Martinsen等^[3]报道了大西洋鲑鱼血浆内氟甲砜霉素的液相色谱测定方法。方法耗时，繁琐，进样量为500 μL。van de Riet等^[4]应用液相色谱-质谱联用方法对多种鱼类中的氯霉素类药物进行多残留分析，可用于多种水产动物中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素及氟甲砜霉素胺的检测。除HPLC法外，Lavy等^[5]曾采用微生物法检测了山羊乳汁和血清中的氟甲砜霉素。

根据前人研究并结合本实验室条件，本研究旨在建立一种准确简便而经济的分析方法，以测定罗非鱼血浆、肌肉和肝脏内氟甲砜霉素残留，以便为水生动物药物动力学和残留研究提供分析手段，进一步为水产养殖合理用药提供依据，并确保水产品食用安全。

1.   材料与方法

1.1   实验动物

健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)由广东省罗非鱼良种场提供，平均体重125 g。实验前，在实验室驯养1周。实验水温27℃，所用玻璃水族箱为50 cm×30 cm×30 cm(45 L)。

1.2   药品、试剂及配制方法

氟甲砜霉素标准品，Sigma公司；氯霉素标准品，99.6%，中国生物制品检定所；乙腈，色谱纯，Dikma公司；乙酸乙脂，分析纯；正己烷，分析纯；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)，为分析纯；氟甲砜霉素水溶性粉，华南农业大学实验兽药厂提供。

标准液配制方法: 准确称取0.050 g干燥恒重的氟甲砜霉素标准品，置于50 mL烧杯中，用适量乙醇溶解后，转移到50 mL容量瓶中，用流动相乙腈-水(27:73，v/v)稀释至刻度，即成1 000 μg·mL^-1母液，-20℃避光保存备用。准确称取0.050 g氯霉素标准品，于100 mL烧杯中用流动相溶解，转移到100 mL容量瓶中，配制成500 μg·mL^-1溶液，-20℃保存。

磷酸盐缓冲液(pH 7.0)配制: 准确称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)71.64 g和磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)27.6 g，分别溶于1 L蒸馏水中配成0.2 mol·L^-1的溶液，然后按61:39的比例混合即成。

1.3   药饵配制及给药方法

首先将水溶性粉用蒸馏水溶解，搅拌均匀，配制成5 mg·mL^-1的水溶性粉悬浊液。将1 mL注射器输出端切除，抛光，装入0.2~0.3 g空白颗粒饲料(Φ3 mm)，然后用定量加液器将配制好的水溶性粉悬浊液加入注射器，每g鱼体重2 μL，相当于剂量10 mg·kg^-1鱼体重，使药液充分浸入饲料。小心地将注射器插入食道推动活塞强制灌胃给药，注意观察注射器插入食道的长度，以免将鱼胃捅破。给药后将鱼单独放入一个水盆中观察5 min，将反胃回吐药饵的鱼弃去。

1.4   样品的采集与制备

每尾鱼用2.5 mL静脉注射器(肝素钠抗凝剂处理)，尾静脉采血，以3 000 r·min^-1离心10 min，分离血浆。将鱼处死，取肝和肌肉(背脊两侧肌肉)。将同一类组织的各样品合并，-20℃保存至分析。

1.5   仪器及色谱条件

日本日立LC-6200高效液相色谱仪，包括紫外检测器，智能泵，反应泵，微处理机，积分仪等；KL512型氮吹仪(配备数控恒温水浴装置)；活动砂心过滤装置(包括0.45 μm微孔滤膜)；FJ-200高速分散均质机；QL-901涡旋混合器；-20℃低温冰箱；TGL-16 C离心机，74B-4000型电动离心沉淀器；往返振荡器等。

流动相乙腈-水(27:73，v/v)，经0.45 μm滤膜过滤后，置于棕色试剂瓶中，超声波脱气10 min，备用；流速1.0 mL·min^-1；Waters Spherisorb^Ⓡ ODS2色谱柱(4.6×150 mm，粒度5 μm)，柱温25℃；紫外检测波长223 nm。

1.6   样品处理

1.6.1   血浆样品处理方法

精确量取1 mL血浆样品于25 mL试管(具塞)中，加入10 μL氯霉素(500 μg·mL^-1)作为内标和1 mL的磷酸缓冲液(pH 7.0)，用旋涡混合器涡动混匀1 min。然后加入4 mL乙酸乙酯，用摇床水平机械振荡20 min，静置10 min后吸取上层乙酸乙酯于10 mL离心管中。加入4 mL乙酸乙酯，同样方法重复提取一次，合并乙酸乙酯提取液。60℃水浴氮气蒸干，加入1 mL流动相，再加入0.5 mL正己烷，涡动2 min溶解残留物。16 000 r·min^-1离心20 min，弃去正己烷层，过滤，20 μL进样检测。

1.6.2   组织样品处理方法

称取1 g组织(肌、肝预先剪碎)于20 mL玻璃管中，加入10 μL氯霉素(500 μg·mL^-1)，加入1 mL的磷酸缓冲液(pH 7.0)，加入4 mL乙酸乙酯，16 000 r·min^-1匀浆10 s，转入10 mL离心管中，于旋涡振荡器上振荡1 min，4 000 r·min^-1离心20 min，吸取全部上清液于10 mL具塞离心管中；再用4 mL乙酸乙酯于20 mL玻璃离心管中清洗残留，提取液转移转入10 mL离心管中，再震荡离心合并上清液；其余同“血浆样品处理方法”。

1.7   标准曲线制备

配制系列标准液(含5 μg·mL^-1的氯霉素)，浓度为16~0.03 μg·mL^-1(n=8)。进样量20 μL，依色谱条件，HPLC测定，以氟甲砜霉素的峰高与氯霉素内标的峰高之比值H，对相应的氟甲砜霉素浓度Ci作线性回归，求标准曲线回归方程以及回归系数。

1.8   工作曲线制备

准确量取1 mL血浆或称取1 g组织(肌、肝)于10 mL玻璃管中，加入浓度为800~1.56 μg·mL^-1的标准液系列(n=8)，使样品中的药物浓度为16~0.03 μ·mL^-1，其余同“样品处理”。进样量20 μL，HPLC测定，以氟甲砜霉素的峰高与氯霉素内标的峰高之比值H，对相应的氟甲砜霉素浓度Ci作线性回归，求工作曲线回归方程以及回归系数。

1.9   回收率

求绝对回收率，按下式计算:

绝对回收率=预处理后的加标样品药物峰高/溶于流动相的药物峰高100%。

准确量取1 mL血浆或称取1g组织(肌、肝)，分别加入浓度为6.25, 50和400 μg·mL^-1的氟甲砜霉素标准液20 μL，其浓度分别为0.125，1和8 μg·mL^-1，其余同“样品处理”。HPLC测定氟甲砜霉素浓度，每个浓度平行测定5次，同批测定0.125、1和8 μg·mL^-1标准液中的药物峰高，计算绝对回收率。

1.10   精密度

准确量取1 mL血浆或称取1 g组织(肌、肝)，分别加入浓度为6.25、50和400 μg·mL^-1的氟甲砜霉素标准液20 μL(见表 1)，其浓度分别为0.125，1和8 μg·mL^-1，其余同“样品处理”。同一批内平行测定5次，记录氟甲砜霉素和氯霉素峰高，计算峰高比值及批内精密度即各变异系数(RSD)。批间精密度: 测定2个批次，各浓度样品平行测定3次，计算批间精密度(RSD)。

表  1  血浆、肌肉和肝脏样品工作曲线

Table  1.  The calibration curves for florfenicol in plasma, muscle and liver samples

样品 sample	线性范围/μg·mL-1 concentration range	标准曲线回归方程 calibration equation	相关系数 R
血浆 plasma	0.03~16	C血=2.729 H-0.06	0.9998
肌肉 muscle	0.03~16	C肌=2.939 H-0.1121	0.9995
肝脏 liver	0.03~16	C肝=2.8336 H-0.1326	0.9986

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1.11   药物稳定性

将浓度分别为8和1 μg·mL^-1的工作标准液保存在0~5℃冰箱中，在48 d内对其进行4次测定。0.125 μg·mL^-1的标准液在2 d内2次测定。

将添加浓度为1 μg·mL^-1的罗非鱼血浆、肌肉和肝脏样品提取液放置在实验台上，分别于第2天和第11天测定。记录峰高值，计算实测浓度，比较药物的浓度变化情况。

2.   结果

2.1   氟甲砜霉素的色谱行为

在上述色谱条件下，基线走动平稳，血浆、肌肉和肝脏样品中虽有杂质峰出现，但无干扰峰，并且与药物分离良好(见图 1)。

图  1  标准品和血浆提取物的色谱图FF为氟甲砜霉素色谱峰，CAP为内标物氯霉素色谱峰

Figure  1.  Liquid chromatograms of standards and extracts from plasma, muscle and liver for determination of florfenicol(FF) with chloramphenicol(CAP) as internal standard(I.S.)

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2.2   标准曲线和灵敏度

基线峰高(噪音)最大值为0.0193 mAU，按信噪比(S/N)为2计算，得出仪器检出限为0.0146 μg·mL^-1。标准曲线为C_i=2.797H-0.0339，相关系数R=0.9999，线性范围为0.03~16 μg·mL^-1。根据线性范围，确定本方法的检出限为0.03 μg·mL^-1。

2.3   样品工作曲线(药物HPLC定量标准曲线)

各样品工作曲线测定结果见表 1，线性范围为0.03~16 μg·mL^-1，相关系数范围为0.9986~0.9998，线性关系满足分析要求。

2.4   回收率

各样品在3个浓度水平的平均回收率结果见表 2，其中血浆的平均回收率为92.86%~96.13%，肌肉的平均回收率为91.70%~96.09%，肝脏的的平均回收率为89.16%~89.52%，结果能够满足分析要求。

表  2  不同组织样品在3个浓度水平的平均回收率(平均值±标准差%)

Table  2.  The recovery of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia

浓度/μg·mL-1 concentration	血浆 plasma	肌肉 muscle	肝脏 liver
0.125	94.79±2.81	91.70±5.41	89.52±4.32
1	96.13±2.35	96.09±1.91	89.17±3.97
8	92.86±1.22	92.72±2.59	89.16±3.71

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2.5   精密度

各样品在3个浓度水平的批内精密度和批间结果分别见表 3和表 4，批内和批间精密度最大均不超过7.7%，符合分析要求。

表  3  不同组织样品中药物在3个浓度水平的批内精密度(RSD%)

Table  3.  The intra-batch precision of a liquid chromatographic method to determine florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia

浓度/μg·mL-1 concentration	血浆 plasma	肌肉 muscle	肝脏 liver
0.125	3.75	6.45	5.61
1	2.21	3.07	6.55
8	2.37	2.65	4.71

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图  2  氟甲砜霉素标准品曲线

(浓度为0.03~16 μg·mL^-1)

Figure  2.  The standard curve of florfenicol

(concentration range: 0.03~16 μg·mL^-1)

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表  4  不同组织样品中药物在3个浓度水平的批间精密度(RSD %)

Table  4.  The inter-batch precision of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples of tilapia

浓度/μg·mL-1 concentration	血浆 plasma	肌肉 muscle	肝脏 liver
0.125	6.27	6.26	2.92
1	2.11	4.39	7.71
8	2.39	4.46	3.72

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2.6   药品稳定性

对于标准液，在评价期内，以第1天测定结果为标准，其他各次测定结果与之相比较，计算出药物的浓度变化，结果在0.5%~1.9%之间。对于血浆、肌肉和肝脏样品，药物浓度的变化率分别为1.4%、0.8%和5.8%。

表  5  工作标准液中氟甲砜霉素的稳定性

Table  5.  Stability of florfenicol in the working standard solutions(0~5℃)

浓度/μg·mL-1 concentration	变化率/% change percent
	第2天	第46天	第48天
8	1.3	1.2	1.2
1	1.0	1.9	0.5
0.125	1.5

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表  6  罗非鱼样品中氟甲砜霉素的稳定性

Table  6.  Stability of florfenicol in the plasma, muscle and liver samples fortified at nominal concentrations of 1 μg·mL^-1 florfenicol

样品 sample	浓度/μg·mL-1 concentration		变化率/% change percent
	第2天	第11天
血浆	1.006	1.020	1.4
肌肉	1.049	1.107	5.8
肝脏	1.056	1.064	0.8

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3.   讨论

水产动物体内药物含量的分析测定方法有微生物测定法、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法、薄层色谱法、分光光度法、比色法和同位素法等。目前，HPLC法应用最多。如Tyrpenou等^[6]，Meinertz等^[7]和Samuelsen等^[8]学者分别在研究盐酸沙拉沙星，OTC和Romet³⁰在金头鲷、银大麻哈鱼和大西洋鲑体内的分布和消除规律或药物动力学时，均采用了HPLC法。

本研究建立的HPLC法具有进样量(20μL)少，所需样品量(1g)少，试剂消耗少和样品预处理简便的特点，结果是满意的。

(1) 内标法定量准确。在HPLC法分析过程中，由于样品和内标是混合在一起注入色谱柱的，因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，进样量的变化不会影响定量结果。用外标法虽然操作简便，但是要求满足的条件较高，要求进样量(每次应一致)准确及实验条件恒定。而内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器等条件的影响，因此比外标法精确。

(2) 方法灵敏度较高，相关系数较高，线性范围较宽。本方法的检出限为0.03 μg·mL^-1。标准曲线相关系数R为0.9999，各样品工作曲线相关系数在0.9986~0.9998之间，线性范围均为0.03~16 μg·mL^-1。标准曲线以及各样品工作曲线相关系数较高。线性范围较宽，其高低浓度相差达2个数量级，表明该方法具有较宽的测定范围。

色谱法一般要求相关系数大于0.99，药物动力学实验方法要求线性范围为10^-2。本方法标准曲线和各样品工作曲线的相关系数在0.9986~0.9999之间，线性范围为0.03~16 μg·mL^-1，完全满足分析要求。

(3) 方法回收率高。Vue等^[12]对多种淡水鱼血浆研究发现，药物的回收率为84%~104%。在鸡、猪、牛和五条鰤鱼肌肉中，氟甲砜霉素的回收率为74.5%~81.5%^[1]。Hormazabol等^[2]的结果为，肌肉和肝脏药物的回收率分别为99%~105%和100%~107%。van de Riet等^[4]应用液相色谱-质谱连用多残留检测多种鱼类中的氯霉素类残留，鲑组织中氟甲砜霉素胺与氟甲砜霉素回收率分别为71%和107%。

本实验各样品在3个浓度水平的平均回收率为(89.16±3.71)%~(96.13±2.35)%，说明方法准确度良好。与血浆和肌肉相比，肝脏中的回收率相对稍低，原因在于作为代谢器官，肝脏中的成分比较复杂，药物的回收率受杂质峰的影响比较大。这与王群等^[9]的报道结果一致。

(4) 精密度良好。Vue等^[12]多种淡水鱼血浆氟甲砜霉素精密度1.4%~8.1%。鸡血浆氟甲砜霉素含量为0.125、1和8 μg·mL^-1，日内变异系数分别为5.1%、2.1%和3.5%；日间变异系数分别为6.2%、4.1%和3.4%^[10]。鲤血浆中诺氟沙星的绝对回收率85.96%，日内和日间精密度均小于10%^[11]。

药物动力学实验要求精密度在10%以内(检测限为μg·mL^-1水平时)。本实验的批内和批间精密度均在8%以下，为2.11%~7.71%，说明方法可靠性较高，完全满足分析要求。

(5) 药物稳定性良好。在一定的保存时间内，对配制好的标准液进行测定，其结果变化不大。在本次实验期内，药物在标准液中浓度变化范围为0.5%~1.9%。Vue等^[1]报道，14 d内，工作标准液(浓度为0.1、1和10 μg·mL^-1)中药物的浓度变化不大于1.9%。与本研究结果一致。

本实验罗非鱼血浆、背肌和肝脏样品中药物浓度在10 d后均稍有升高，其范围在0.8%~5.8%之间。Vue等^[1]在研究中发现，7 d内，添加浓度为1 μg·mL^-1的血浆样品药物的回收率升高幅度小于8%，其原因是样品存放时间长，血浆内的(一些)未知化合物会发生分解，产生杂峰干扰。并且指出，利用HPLC法分析血浆样品，最好在提取后12 h以内进样分析。结果与本实验一致。