Tissue distribution of grouper iridovirus genus Ranavirus in infected farmed juvenile giant grouper (Epinephelus lanceolatus)
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摘要:
石斑鱼蛙病毒能够感染多种石斑鱼并造成严重死亡。研究利用原位杂交和荧光定量PCR技术对蛙病毒三亚株GIV-R-SY1301在人工感染发病的鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)不同组织中的分布进行定位、定量研究。原位杂交结果显示GIV-R-SY1301广泛存在于发病鱼的多个组织中, 脾脏和肾脏中杂交信号最强, 其次是肠道、胃、鳃、肝, 心脏中也有少量的杂交信号, 而脑和眼组织中没有杂交信号存在。荧光定量PCR检测结果显示GIV-R-SY1301在不同组织中的病毒含量为4.5×104~6.85×107拷贝·μg-1 DNA, 其中脾脏、心脏和肾脏中最多。组织原位杂交和荧光定量PCR结果基本一致。
Abstract:Grouper ranavirus infected many grouper species and caused severe mortality. We isolated a grouper iridovirus (genus Ranavirus) named GIV-R-SY1301 in Sanya by using cell culture, to study the tissue distribution of GIV-R-SY1301 in experimentally infected farmed Epinephelus lanceolatus by in situ hybridization and real-time PCR. The GIV-R-SY1301 was widespread in all tissues from infected fish.Strong hybridization signals were obtained from kidney and spleen, while intermediate intensity signals were observed in stomach, gill and liver. The weakest signals were obtained from heart and no signal was found in brain and eye. The real-time PCR results show that there were most viruses copies in spleen, kidney and heart (4.5×104~6.85×107 copies·μg-1) DNA in different tissues, which was similar with the result of in situ hybridization.
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Keywords:
- Ranavirus /
- Epinephelus lanceolatus /
- in situ hybridization /
- real-time PCR
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牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中国重要的海水经济鱼类品种之一，属冷温性底栖鱼类，在分类学上属于硬骨鱼纲，鲽形目，鲽亚目，鲆科，牙鲆属，俗称偏口鱼、比目鱼、左口鱼、牙片等[1]。牙鲆个体较大、肉质细嫩、味道鲜美，富含各种维生素，为制作生鱼片的上等材料，拥有较高的经济和社会价值，深受消费者的青睐。自“十一五”开始，针对不同的目标经济性状牙鲆系统性的选择育种工作就已经展开，并取得了一系列的研究进展与成果。其中，生长性状是牙鲆育种研究中首选的经济性状，其遗传改良研究的核心手段是估计方差组分和遗传参数，这不仅是基因型选种的基础，更是制定育种规划和进行个体遗传评定的重要参数[2]。传统进行牙鲆生长性状的遗传参数估计多采用单性状动物模型[3-7]；当考虑不同性状之间的相关性时，多性状动物模型又被引入分析当中[7]。单性状分析方法是逐个性状进行遗传分析，而所谓的多性状分析也是两两性状之间进行遗传相关的计算，并未能探讨单个性状与多个性状之间的整体作用。以体质量和形态性状为例，作为衡量生长的常用指标，两者之间存在典型的相互影响，为了量化这种互作效应，可以引入异速生长的概念来进行分析。
异速生长关系反映了体质量和某些生物学特征之间的关系，常用幂函数形式来表示。最早的异速生长方程由HUXLEY提出，之后许多生物学家研究了生理、形态、发育、组织、生态和进化因素与身体大小之间的异速生长[8-11]。实际上异速生长主要分为3种形式：静态异速生长、发育异速生长和进化异速生长[12-16]。静态异速生长表示在成年或某一个特定发育阶段2个不同性状之间的相对生长速度之比；发育异速生长是指在生命过程中一个性状相对其他性状的生长轨迹差异；而进化异速生长则为不同物种间同一性状的相对大小关系。异速生长关系在自然界中几乎无处不在，是公认的形态进化驱动力[17]。早期的异速生长研究主要集中于特定发育阶段的静态异速生长和不同物种间的进化异速生长。最近20年，伴随着个体不同形态结构数据的获得，发育异速生长才逐渐受到人们的重视。已有的鱼类发育异速生长研究发现决定个体发育的是部分体成分而非全部体成分。MCGUIGAN等[18]利用随机回归模型估计了成对形态性状间异速生长的遗传差异，并利用主成分分析方法探讨不同形态性状异速生长的遗传贡献，但其只考虑了单个形态性状相对整体的关系，没有分析全部形态性状与整体之间的联系。
鉴于已有文献报道的不足之处，该研究采用逐步回归分析方法，从多个形态性状中选择与体质量具有显著异速生长指数的部分形态性状，构建表型联合异速生长模型。在固定时间点，将联合异速生长模型镶嵌到简单动物模型的固定和加性遗传效应中，建立多个形态性状与体质量的静态异速生长模型；发育异速生长模型的构建则是在带有重复记录的动物模型基础上，将联合异速生长模型镶嵌到固定和加性遗传效应，将Legendre多项式镶嵌到永久环境效应，估计多个形态性状与体质量之间异速生长的遗传参数。该研究结果能够揭示牙鲆体质量与多个形态性状之间的异速生长规律，以期为其他鱼类品种的遗传改良研究工作提供新思路和新方法。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
所有实验均在中国水产科学研究院北戴河中心实验站牙鲆良种场完成。实验亲鱼选自站内牙鲆选育基础群体，亲本选取原则是性状优良、体表健康、无外伤、性腺发育良好。2013年5月选取雌雄亲本各19尾，人工采集雌、雄个体的生殖细胞进行授精，采用1 : 1配组的方式建立全同胞家系19个。家系制备完成后，每个家系分别在独立的圆形玻璃钢水槽中进行培育。整个饲养过程按照常规牙鲆苗种培育方式进行，开口饵料为轮虫、之后依次投喂卤虫和人工配合饲料，为保持鱼体生存环境健康，每个选育家系均采用流水方式进行养殖，水体温度随自然海水温度改变而变化。待每个家系生长至180日龄时进行个体电子标记，每个家系标记个体数量约150尾，总计标记个体数量为2 675尾，标记完成后所有个体混养在一个大的水泥池当中。
1.2 性状测量
性状测量从180日龄开始，约间隔60 d进行1次，总计测量4次，测定时间点依次为240日龄、300日龄和360日龄。180日龄为牙鲆可承受物理电子标记的时间点，240和300日龄为牙鲆快速生长时间点，360日龄为牙鲆上市时间点。现场称质量时每尾鱼置于溶解乙二醇苯醚的水中进行麻醉(体积分数为200~300 μL · L-1)，以避免鱼体由于应激反应造成机械损伤。麻醉后将鱼体置于包含比例尺的浅水托盘中拍照，利用Motic Images Plus 3.2软件测量每尾鱼的照片，通过比例尺校正获得形态性状实际数据，体质量通过称质量直接记录。测量的性状包括体质量与7个形态性状，形态性状的测量位置如图 1所示。形态性状分别为全长(x1)、体长(x2)、眶前长(x3)、头长(x4)、尾柄长(x5)、体高(x6)和尾柄高(x7)。
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图 1 牙鲆形态性状测量位置图全长(x1：A-D)；体长(x2：A-C)；眶前长(x3：A-G)；头长(x4：A-B)；尾柄长(x5：J-C)；体高(x6：E-F)；尾柄高(x7：H-I).Figure 1. Position for measuring morphological traits of Japanese floundertotal length (x1: A-D); body length (x2: A-C); pre-orbital length (x3: A-G); head length (x4: A-B); caudal peduncle length (x5: J-C); body depth (x6: E-F); caudal peduncle depth (x7: H-I)1.3 遗传分析模型
1.3.1 联合异速生长模型
分析m个部分相对于整体的异速生长，可以构造如下联合异速生长模型[9]：
$$ \boldsymbol{y}=a \boldsymbol{x}_1^{b_1} \boldsymbol{X}_2^{b_2} \cdots \boldsymbol{X}_m^{b_m} $$ (1) 该模型不但可以用来联合估计m个部分相对于整体的异速生长系数，而且考虑了m个部分之间的相互关系，实际应用中通常对联合异速生长模型两边同时取自然对数，变为：
$$ \ln y=b_0+b_1 \ln x_1+b_c \ln x_2 \cdots+b_m \ln x_m $$ (2) 这样采用多元线性模型最小二乘法便可估计模型的参数。在进行牙鲆异速生长的遗传分析之前，应通过表型联合异速生长模型回归系数的显著性检验，去掉其中异速生长系数不显著的形态性状，建立最优联合异速生长指数模型。
1.3.2 静态异速生长模型
静态异速生长的遗传分析是基于某个特定生长时间点，每个个体的性状观测值只有1次，所以遗传分析的目标应该是多个形态性状相对体质量的静态异速生长。将m个形态性状的最优联合静态异速生长模型镶嵌到体质量动物模型的每个遗传效应中，建立以下随机回归模型：
$$ \ln y_{i j k}=T_j+\sum\limits_{l=0}^m f_{k l} \ln x_{li}+\sum\limits_{l=0}^m g_{i l} \ln x_{i l}+\mathbf{e}_{i j k} $$ (3) 这里xi0=1，对应着联合异速生长模型的常数项；fkl为在第k养育场—年—缸(池)组第l个体成分的固定异速生长效应；gil是第i个体第l个体成分的加性育种值异速生长效应，eijk为随机测量误差。
1.3.3 动态异速生长模型
动态异速生长的遗传分析是基于多个生长时间点内重复观察的多个部分和整体之间的关系，每个个体的性状观测值有多次。已有文献表明，动态异速生长指数不随时间改变而变化[19-20]。因此，与静态异速生长遗传分析一样，可以将最优联合动态异速生长指数模型镶嵌到动物模型中的固定效应项和加性遗传效应项，建立一个包含永久环境效应依赖于时间变化的随机回归模型，相应的分析模型表达式为：
$$ \begin{aligned} & \quad \ln y_{i j k}(t)=T_j+\sum\limits_{l=0}^m f_{k l} \ln x_{li}(t)+\sum\limits_{l=0}^m g_{i l} \ln x_{i l}(t)+\sum\limits_{l=0}^m \\ & p_{i l} \Psi_l(t)+\mathbf{e}_{i j k} \end{aligned} $$ (4) 模型中的y为体质量，x是部分形态性状；各参数的含义与上面的模型(3)相同。这个模型既考虑了多个形态性状相对体质量的异速生长关系，又考虑了体质量在重复测量所产生的永久环境效应，用Legendre多项式拟合永久环境效应随时间的变化。
1.4 统计分析
所有的遗传分析过程利用DMU软件(V6)执行AI-REML(Average Information Restricted Maximum Likelihood)来完成。迭代REML过程中选择不同的方差初始值重复计算，以保证达到整体而不是局部的最大化。收敛标准为2次迭代所得估计值的方差小于1. D-6。采用AIC信息准则(Akaike information criterion)决定最佳的Legendre多项式阶数，通常情况下，AIC可以表示为AICk=－2log(MLk)+2pk，式中log(MLk)是似然函数对数值，pk是模型k中自由参数的个数。对于模型选择来讲，AIC值越小越好。
2. 结果与分析
2.1 静态异速生长分析
选择240日龄时，2 033个个体的体质量与7个形态性状进行静态异速生长遗传分析。采用逐步回归方法估计每个形态性状对体质量的异速生长指数，结果中5个形态性状与体质量具有显著的异速生长关系，性状分别为全长(x1)、体长(x2)、尾柄长(x5)、体高(x6)和尾柄高(x7)；剩余3个形态性状与体质量之间不存在显著的异速生长关系(P>0.05)，据此建立最优的联合静态异速生长模型如下：
$$ \hat{y}=0.0754 x_1^{1.4155} x_2^{0.3711} x_5^{0.0615} x_6^{0.7180} x_7^{0.4713} $$ (5) 式(5)中可见，最大的异速生长指数存在于全长与体质量之间，数值1.415 5，表现为正异速生长，说明从相对生长速度来讲，全长略快；剩余形态性状与体质量之间的异速生长指数为0.061 5~0.718 0，皆表现为负异速生长，说明从相对生长速度来讲，体质量略快。
加性遗传协方差矩阵结果为：
$$ G=\begin{array}{rrrrrr} 1.8858 & -0.2555 & -0.5046 & 0.0406 & 0.2558 & -0.1140 \\ -0.2555 & 2.0342 & -2.0215 & -0.1754 & -0.3003 & 0.6615 \\ -0.5046 & -2.0215 & 2.3823 & 0.1756 & 0.1236 & -0.6494 \\ 0.0406 & -0.1754 & 0.1756 & 0.0169 & 0.0172 &-0.0611\\ -0.2558 & -0.3003 & 0.1236 & 0.0172 & 0.1925 & -0.1117 \\ -0.1140 & 0.6615 & -0.6494 & -0.0611 & -0.1117&0.2610 \\ \end{array} $$ 各形态性状与体质量异速生长指数的遗传方差中，全长(x1)和体长(x2)的遗传方差相对较高且排序在前，尾柄长(x5)、体高(x6)和尾柄高(x7)的遗传方差相对较低，但与异速生长指数的大小排序完全相同。
根据5个具有显著异速生长指数形态性状的加性遗传协方差矩阵，获得5个异速生长指数之间的遗传相关，结果为：
$$ R=\begin{array}{rrrrrr} 1.0000 & -0.1304 & -0.2381 & 0.2278 & 0.4246 & -0.1625 \\ -0.1304 & 1.0000 & -0.9183 & -0.9468 & -0.4799 & 0.9078 \\ -0.2381 & -0.9183 & 1.0000 & 0.8759 & 0.1825 & -0.8235 \\ 0.2278 & -0.9468 & 0.8759 & 1.0000 & 0.3010 &-0.9211\\ 0.4246 & -0.4799 & 0.1825 & 0.3010 & 1.0000 & -0.4986 \\ -0.1625 & 0.9078 & -0.8235 & -0.9211 & -0.4986 & 1.0000 \end{array} $$ 任意2个形态性状异速生长指数之间均存在正负遗传相关。各性状异速生长指数之间，最大的正遗传相关存在于全长(x1)和尾柄高(x7)之间，相关为0.907 8，其次为体长(x2)和尾柄长(x5)之间，相关为0.875 9；最大的负遗传相关存在于全长(x1)和尾柄长(x5)之间，相关为-0.946 8，其次为尾柄长(x5)和尾柄高(x7)之间，相关为-0.921 1。
2.2 动态异速生长分析
利用4个时间点的生长性状表型值，进行全长(x1)、体长(x2)、尾柄长(x5)、体高(x6)和尾柄高(x7)5个形态性状对体质量的动态异速生长遗传分析，将最优联合动态异速生长指数模型镶嵌到动物模型中固定效应和加性遗传效应项，用0~4阶Legendre多项式拟合永久环境效应随时间的变化，由此建立随机回归模型，用模型Ⅰ表示镶嵌0阶多项式的随机回归模型，以此类推依次建立模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。用-2log(MLk)和AIC信息准则比较镶嵌不同阶次多项式的随机回归模型。分析结果见表 1，模型Ⅰ的-2log(MLk)和AIC信息准则均表现出最小值，由此证实此模型为进行5个形态性状对体质量动态异速生长分析的最优随机回归模型。由模型Ⅰ估计体质量与全长(x1)、体长(x2)、尾柄长(x5)、体高(x6)和尾柄高(x7)的加性遗传方差依次为0.417、0.589、0.005、0.148和0.048。
表 1 不同模型的统计指标Table 1. Statistical criteria of different models模型
model参数个数
number of parameter-2log(MLk) AIC信息准则
Akaike information criterionⅠ 23 -27 838.64 -27 792.64 Ⅱ 25 -27 891.52 -27 841.52 Ⅲ 28 -33 747.06 -33 691.06 Ⅳ 32 -27 877.11 -27 813.11 Ⅴ 37 -27 996.36 -27 922.36 3. 讨论
生长性状是一个随时间增长呈现连续变化的动态性状，在不同时间点的性状表型值拥有不同的意义。以牙鲆为例，鱼体可承受电子标记时间点、快速生长时间点、上市日龄时间点、性成熟时间点，这些时间点分别代表了实际育种过程中的重要阶段，准确解析性状在这些时间点的遗传变化规律，对于进行性状的遗传改良工作具有重要意义。传统生长性状遗传分析，多是采用单性状或两性状动物模型逐个或两两进行性状的遗传力或遗传相关的估计，实际上除了这种表型生长之外，异速生长也广泛存在于水产领域，且有多个物种已经开展了此项研究。体质量和形态性状是水产动物遗传育种的常规选育性状，对于这些性状的选择多是单一进行或者利用性状之间的相关间接进行。异速生长有别于传统遗传改良，它将目标性状作为一个整体分析，充分考虑了所有性状之间的关联性。以体质量和形态性状为例，异速生长有利于同步开展两者的共同选育，避免了分开选择的缺点，这在实际育种过程中具有一定的应用意义。而作为一种揭示体质量与形态性状异速生长遗传规律及其生长模式的方法，也可以为其他鱼类数量遗传育种提供新的参考。
在已有的文献报道中，有近90种鱼类先后开展了全长、体长等形态性状与体质量的异速生长分析。以不同海域鱼类为例，爱琴海海域40种鱼类体质量与全长之间的异速生长指数为2.235~3.704[21]，葡萄牙西海岸46种鱼类体质量与体长之间的异速生长指数为2.171~3.873[22]，渤海湾渔业资源调查的22种主要渔获物体长与体质量异速生长指数介于1.271~3.316，主要集中在2.979附近[23]。该研究中7个形态性状中有5个性状与体质量存在显著的异速生长指数，其中全长与体质量的异速生长指数最高(1.415 5)，其次为体高与体质量之间(0.718)，剩余3个形态性状与体质量之间的异速生长指数均在0.48以下。这些性状异速生长指数的数值低于已有文献报道，分析其中存在的缘由有如下几点：1)该研究考虑多个形态性状间的相互作用关系，建立了联合分析多个形态性状相对体质量的异速生长数学模型来计算各性状的异速生长指数；而已有报道则是单独分析全长或体长与体质量之间的异速生长情况，两者所采用的统计分析模型存在显著的差异性。当采用相同统计模型时，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)5个形态性状与体质量的异速生长指数为0.081 7~1.638 8[24]，这与该研究结果相类似。2)性状所处生长时间点不同，已有文献中的性状记录时间点多为生长发育的早期过程，而该研究中性状记录时间点已达6月龄以后。3)分析的目标鱼类品种不同，不同品种之间每个形态性状与体质量之间的异速生长指数必然存在差异，而且容易受到所处地理区域和养殖环境等因素的共同影响。
除了不同鱼类品种之间每个形态性状与体质量的异速生长指数不同之外，同一品种不同形态性状与体质量之间的异速生长指数同样也存在一定的差异性，此研究中除全长与体质量之间存在正异速生长之外，其余性状与体质量均表现出负异速生长，而且，这些性状与体质量之间的异速生长指数也存在较大程度差异，表明性状在不同生长发育阶段呈现不同的生长速度或者说性状生长拐点的出现时间点并不相同，从而促进重要功能器官在特定生长阶段的完全发育，适应多变的自然环境。在施氏鲟(Acipenser schrenckii)[25]、鲇(Corydoras aeneus)[26]、西伯利亚鲟(A.baeri)[27]、𩾃(Miichthys miiuy)[28]、鲈鲤(Percocypris pingi pingi)[29]、许氏平鲉(Sebatese schlegelii)[30]、金乌贼(Sepia esculenta)[31]和赤眼鳟(Spualiobarbus curriculus)[32]等物种也观测到了类似现象。例如西伯利亚鲟眼径生长拐点在3~4日龄，背鳍生长拐点在13~14日龄，口宽生长拐点在17~18日龄，胸鳍和臀鳍生长拐点分别在16~17日龄和21~22日龄；鲈鲤由慢速生长到快速生长的转折点在25日龄，头部和尾部在22~27日龄出现生长拐点，吻长在33~34日龄出现生长拐点，背鳍、尾鳍、臀鳍和腹鳍则在31~44日龄出现生长拐点。这些研究证实异速生长模式广泛地存在于不同鱼类品种，尤其在生长发育的初期阶段，为满足摄食、游泳、避敌等生存能力的需要，不同性状或器官之间存在显著的异速生长模式。利用生长发育早期阶段不同性状间的异速生长关系，有针对性地创造良好养殖条件，能够在一定程度上提高苗种繁育的成功率；而在生长发育后期阶段，则可以利用异速生长开展不同性状的遗传改良工作。如该研究结果中，两两性状异速生长指数之间表现出高遗传相关的有6个，其中有4个相关数值在0.90以上，2个相关数值在0.82~0.88。因此利用这些拥有高异速生长遗传相关的形态性状便可进行彼此之间的间接选择，以全长和尾柄高为例，用全长与体质量的异速生长就能够间接改良尾柄高与体质量的异速生长。
如果按照异速生长的原始概念，每个形态性状都需要建立一个关于异速生长的随机回归模型，将多个形态性状的异速生长联合起来分析，就相当于进行多性状的随机回归模型分析。因此建立联合异速生长模型，对实现多个形态性状相对体质量异速生长的随机回归模型分析至关重要。该研究从异速生长关系的幂函数出发，考虑多个体形态性状生长间的相互作用关系，推导出联合分析多个形态性状相对体质量异速生长的最优数学模型；并将这个联合异速生长模型镶嵌到体质量动物模型的每个遗传和环境效应中，从而实现了对多个形态性状异速生长遗传规律的随机回归模型分析。通过不同模型统计标准的比较，筛选出估计牙鲆体质量与形态性状异速生长遗传参数的最优随机回归模型。在通常的随机回归模型中，协变量一般是时间因素，而在异速生长关系的遗传分析中，随机回归模型的协变量是每个形态性状，因此这种模型应该被称为多维随机回归模型。综上所述，该研究将随机回归模型成熟的理论方法有效地应用在牙鲆生长性状的遗传分析中，揭示了牙鲆体质量与形态性状之间异速生长的遗传规律，以期能够为开展鱼类及其他水产动物品种异速生长的遗传参数估计与数量遗传学育种提供新思路和新方法。
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图 1 感染GIV-R-SY1301后发病鞍带石斑鱼幼鱼各个组织的原位杂交结果
阳性信号为蓝色。a，b，c，d，m，n，o，p，i，j分别为对照组脾、肾脏、肝脏、心脏、胃、肠、脑、眼和鳃组织的原位杂交结果图; e.发病鱼脾脏，大量阳性细胞散布在脾髓中；f.发病鱼肾脏，杂交信号主要存在于肾小体和其周围的造血组织中，肾小管中没有发现信号；g.发病鱼肝脏，杂交信号位于肝细胞周围的门管和血窦中，而正常的肝细胞没有信号；h.发病鱼心脏，少量的杂交信号位于心脏心肌细胞中；k~l.发病鱼的鳃，杂交信号主要位于血管和毛细血管丰富的周围组织，例如软骨组织周围的毛细血管网(k)和入鳃动脉(l)；q~r.发病鱼胃和肠道，杂交信号主要在具有丰富血管的粘膜下层和浆膜层，粘膜层也有微弱的信号存在；s~t.发病鱼脑和眼，没有杂交信号在脑和眼中。
Figure 1. Result of in situ hybridization in different tissues of E.lanceolatus
The signal is observed microscopically as blue staining. a, b, c, d, m, n, o, p, i and j are in situ hybridization results of spleen, kidney, liver, heart, stomach, intestines, brain, eye and gill, respectively. e. spleen of infected fish, many hybridization signals distributed in splenic pulp; f. hybridization signals were mainly in renal corpuscle and its surrounding hemopoietic tissues, but not in tubular epithelium; g. liver, hybri-dization signals were observed in portal area of necrotic hepatocyte, but not in normal hepatocyte; h. heart, only few hybridization signals were observed in myocardial cell; k~l. gill, hybridization signals were mainly around the afferent artery and capillary vessel lumen, such as in capillary vessel lumen around cartilage tissue (k) and afferent branchial vessel (l). q and r. stomach and intestines, hybridization signals were mainly in the submucosa and serosa where had rich blood vessels, and slightly in the mucosa; s~t. brain and eye, no hybridization signal was found in brain and eye.
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图 2 GIV-R-SY1301绝对定量标准曲线
Figure 2. Standard curve for absolute quantification of GIV-R-SY1301
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