尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)原产于非洲，具有生长快、食性杂、适应性强以及无肌间刺等诸多优点，是联合国粮农组织向全世界推广养殖的优质鱼类。自20世纪70年代以来，中国多次从世界各地引进尼罗罗非鱼，在广东、海南、广西等南方地区进行推广养殖，取得了一定的经济效益和社会效益。2012年中国罗非鱼养殖产量达138×10⁴ t，占全球的32%^[1]。优良的苗种是保证罗非鱼成鱼品质的关键，因此良种的选择和培育是保障中国罗非鱼产业稳定发展的决定性因素。1999年中国水产科学研究院淡水渔业研究中心从埃及尼罗河地区引进的尼罗罗非鱼野生种群并经多代选育形成遗传性状稳定的优良品系，为区别其他原产地引进的尼罗罗非鱼群体命名为埃及品系尼罗罗非鱼^[2]。目前埃及品系尼罗罗非鱼选育过程中主要采用群体选育法，在重视生长特性、经济性状选择的同时有可能忽略了种群遗传结构方面的变化，导致遗传多样性降低，造成遗传瓶颈效应。因此，在埃及品系尼罗罗非鱼的选育过程中，需要对选育群体遗传结构的变化作进一步分析。为巩固、提高其生长特性，保证埃及品系尼罗罗非鱼选育过程中遗传信息的稳定遗传，研究团队利用mtDNA D-loop序列比对技术对尼罗罗非鱼选育世代群体的遗传变异情况进行分析评估，了解种群在保种选育过程中遗传结构方面的变化。

mtDNA D-loop是线粒体DNA中的一段非编码区，具有分子量小、结构简单、进化速度快、高度多态、母系遗传等特点^[3]，被广泛应用种群的进化研究和遗传多样性分析，如海洋、湖泊中银汉鱼(Odontesthes argentinensis)种群鉴别^[4]、蓝鳍金枪鱼(Thunnus orientalis)个体繁殖力比较研究^[5]、不同流域野生黄鳍鲷(Sparus latus)种群遗传结构差异分析^[5]等。上述研究针对同一物种的遗传信息差异，利用SSR、AFLP等分子标记分析往往工作量大且较难发现种群间差异，而线粒体DNA控制区丰富的变异可作为种群遗传结构研究的一个很好的工具。文章采用PCR结合DNA测序技术对埃及品系尼罗罗非鱼3个世代选育群体的遗传变异进行检测，旨在初步评价埃及品系尼罗罗非鱼在现有选育方式下的选育现状及选育潜力，为制定出更加合理有效的选育方案提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验选用埃及品系尼罗罗非鱼，从2006年起进行连续3个世代的跟踪研究，F₁ 29尾，F₂ 23尾，F₃ 28尾。分别采集3个世代群体的血液样本，取得的血样与ACD抗凝剂(5 : 1)充分混合，-70 ℃保存备用。

1.2   试剂及仪器

dNTPs；10×Buffer；Taq-DNA聚合酶；DNA Marker等试剂购买于宝生物工程(大连)有限公司。电泳仪为BIO-BAD PowerPac Universal型；PCR仪为Eppondorf Mastercycler gradient型；成像仪为Gene Company Limited Gbox型凝胶成像系统。

1.3   基因组DNA的制备

采用常规的酚-氯仿法制备基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度和纯度，稀释至100 mg · L^-1，作为PCR扩增的模板。

1.4   mtDNA D-loop序列引物合成

通过对不同引物的筛选，参考设计引物344F(5′-CTATTACTGGCATCTGGTTCC-3′)与PHE1R(5′-ACATCTTCAGTGTTACGCTT-3′)用于扩增埃及品系尼罗罗非鱼的mtDNA D-loop序列的PCR扩增^[7]，引物由上海基康生物技术有限公司合成。

1.5   PCR产物检测与目的片段的测序

PCR反应体系(50 μL)：10×PCR缓冲液5 μL，2.5 mmol · L^-1的dNTP 4 μL，r-Taq酶2 U，引物344F、PHE1R(5 μmol · L^-1)均为4 μL，模板1 μL，最后补充灭菌去离子水至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；每个循环包括94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共39个循环；最后一次循环结束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增反应产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳，5 V · cm^-1电泳约0.5 h，GBox记录电泳结果。将确定为目的片段的PCR扩增产物送上海基康生物技术有限公司进行正反向测序。

1.6   数据分析

先对正、反向序列进行重叠区拼接，除去多余的碱基片段(Contig-Express软件)。再对序列进行编辑校正(BioEdit软件)后，通过BLAST分析，确认PCR得到的序列是罗非鱼mtDNA D-loop区部分序列。对编辑校正后的序列进行比对分析(ClustalX2软件)。分析序列特征，统计序列的碱基组成和变异情况，用Kimura2-parameter模型计算遗传距离，并构建NJ系统发育树(MEGA 5软件)。统计种群的遗传多样性参数：单倍型多样度(H)、平均核酸差异数(K)、核苷酸多态性(P_i)、遗传分化指数(F_st)以及群体间的基因流(Nm)(DnaSPv 5软件)。

2.   结果与分析

2.1   线粒体D-loop区段基因扩增结果

埃及品系尼罗罗非鱼3个选育世代群体部分个体的线粒体DNA控制区PCR扩增结果见图 1。PCR扩增产物条带单一明亮，扩增片段大小约为550 bp，无非特异性条带出现，可以排除外源DNA污染及核DNA拷贝的可能性。

图  1  尼罗罗非鱼mtDNA D-loop部分序列PCR扩增结果

Figure  1.  Amplification of partial sequences in mtDNA D-loop region of O.niloticus

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2.2   选育世代群体的mtDNA D-loop序列的碱基组成

3个世代共80个个体的PCR产物经纯化后测序，在对比除去引物序列后，碱基序列长度为552~555 bp，序列长度多态性的出现是由于部分序列出现碱基插入或缺失所引起。测序结果在GenBank上进行BLAST比对分析，与同源序列的相似度高达99%以上。序列上传至GenBank，序列号分别为KJ813762~KJ813773。3个选育世代罗非鱼群体的mtDNA控制区序列碱基组成见表 1。世代间碱基组成较为相似，没有显著的变化。A、G、T和C的平均含量分别为29.1%、15.6%、35.0%和20.3%，其中碱基T的含量最高，碱基G的含量最低，A+T(平均为64.1%)的含量明显高于G+C(平均为35.9%)的含量。

表  1  3个世代尼罗罗非鱼mtDNA控制区部分序列的碱基组成

Table  1.  Base composition of mtDNA control region in three generations of O.niloticus

世代generation	T/%	C/%	A/%	G/%	A+T/%	G+C/%
F1	35.0	20.4	29.0	15.7	64.0	36.0
F2	35.1	20.2	29.1	15.6	64.2	35.8
F3	35.0	20.3	29.1	15.5	64.2	35.8
平均average	35.0	20.3	29.1	15.6	64.1	35.9

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2.3   世代群体间mtDNA D-loop序列的单倍型对比分析

3个世代群体控制区序列变异情况的结果见表 2。80个个体共检测出52个变异位点，占全序列的9.17%，其中转换35个，颠换13个，插入/缺失位点4个(211、231、338、396)，F₁、F₂和F₃这3个世代的转换数均大于颠换数，总体转换/颠换比率为2.69。80个个体共检测出12个单倍型，H为0.421~0.652。各世代单倍型序列见图 2。其中F₁有5个单倍型，F₂有7个单倍型，F₃存在7个单倍型；3个世代共享3种单倍型(F₁-2、F₂-1、F₃-1相同；F₁-3、F₂-2、F₃-3相同；F₁-4、F₂-3、F₃-4相同)，F₁群体与F₂群体共享1种单倍型(F₁-1与F₂-5相同)，其他为各世代群体独有。

表  2  3个世代尼罗罗非鱼D-loop区部分序列变异情况

Table  2.  Variation of partial sequence of D-loop region in three generations of O.niloticus

世代generation	转换conversion	颠换transversion	插入/缺失insert/deletion	多态位点比例/%ration of polymorphic sites	单倍型数number of haplotypes
F1	35	13	4	9.17	5
F2	35	13	4	9.17	7
F3	34	12	4	8.99	7
总体total	35	13	4	9.17	12

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图  2  3个世代罗非鱼mtDNA D-loop区部分序列变异情况

F₁-1~5. F₁的5种单倍型；F₂-1~7. F₂的7种单倍型；F₃-1~7. F₃的7种单倍型(相同=.缺失=-)

Figure  2.  Variation of partial sequence of mtDNA D-loop region in three generations of O.niloticus

F₁-1~5. five haplotypes of F₁; F₂-1~7. seven haplotypes of F₂; F₃-1~7. seven haplotypes of F₃ (same=.del=-)

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以12种单倍型的mtDNA D-loop序列构建的NJ系统树及其在3个选育世代中的分布见图 3。12种单倍型形成了2大分支，由此可推断这些单倍型可能来源于2个不同遗传背景的母系祖先。由单倍型在3个世代中的分布可以看出，各世代没有形成自己特有的单倍型类群，其中单倍型F₂-1出现频率最高，包括52个个体，为3个选育世代所共享。由拓扑结构可以看出，3个选育世代的单倍型在NJ系统树上互相交叉，并且各世代所独有的单倍型也没有形成独有的进化枝。

图  3  基于mtDNA D-loop区序列构建的12种单倍型NJ系统树及其在各世代中的分布

Figure  3.  NJ phylogenetic tree of 12 haplotypes based on mtDNA D-loop sequences and its distribution in different generations

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2.4   不同世代选育群体的遗传结构

3个世代尼罗罗非鱼控制区部分序列变异所反映的基因多态性见表 3。P_i是衡量一个种群mtDNA遗传多样性的重要指标，3个世代中F₂的P_i最高(0.040 3)，而F₁的最低(0.021 9)； H与K 2个参数在尼罗罗非鱼3个世代中也呈现出同样的趋势，F₂最高，F₁最低。

表  3  罗非鱼3个世代的遗传多样性参数

Table  3.  Genetic diversity parameters of three tilapia generations

世代generation	单倍型多样度H	平均核酸差异数K	核苷酸多态性Pi
F1	0.421	12.059	0.021 9
F2	0.652	22.221	0.040 3
F3	0.635	21.937	0.039 7
平均average	0.569	18.739	0.034 0

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从F_st和Nm的角度对世代间的遗传分化进行分析。F₁与F₂、F₃之间的F_st分别为0.067和0.076，均大于0.05，它们之间已经产生了中等程度的遗传分化，而Nm均大于1，在遗传分化中起了主要作用；F₂与F₃之间的F_st为负数(-0.039)，表明这2个世代间没有发生遗传分化。

基于控制区部分序列差异的3个世代间遗传距离见表 4。群体间碱基序列的差异反映的是亲缘关系的远近，3个世代间遗传距离为0.035~0.041，总体来看尼罗罗非鱼的各选育世代之间的遗传距离差异不大。

表  4  3个世代间的遗传距离(下)和标准差(上)

Table  4.  Genetic distance (below the diagonal) and standard deviation (above the diagonal) of three generations

群体generation	F1	F2	F3
F1	-	0.005	0.005
F2	0.036	-	0.006
F3	0.035	0.041	-

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表  5  3个世代间的基因交流Nm值(左下)和遗传分化F_st值(右上)

Table  5.  Gene flow (below the diagonal) and genetic differentiation (above the diagonal) of three generations

群体generation	F1	F2	F3
F1	-	0.067	0.076
F2	3.47	-	-0.039
F3	3.55	-	-

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3.   讨论

3.1   埃及品系尼罗罗非鱼选育世代的遗传多样性分析

埃及品系尼罗罗非鱼3个世代的mtDNA D-loop区序列中，4种碱基在控制区序列的碱基组成呈现出很强的偏向性，控制区中A+T的含量(64.1%)明显高于G+C的含量(35.9%)，与脊椎动物线粒体DNA序列的碱基组成特点相符合^[8]。此外，3个世代的变异位点上共有转换位点35个，颠换位点13个，碱基的转换数远高于颠换数，符合动物线粒体DNA碱基变异的特点，转换在近缘物种间比较容易发生，颠换则在较远缘物种间频繁显现。P_i是分子遗传学中评价遗传多样性的灵敏指标，可用来衡量种群的遗传多样性的高低。研究发现，埃及品系尼罗罗非鱼3个世代的P_i分别为0.021 9、0.040 3和0.0397，相比太湖鲢(Hypophthalmichthys molitrix)的平均P_i0.012 4^[9]、养殖刀鲚(Coilia nasus)的平均P_i 0.009 9^[10]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)的平均P_i 0.006 1^[11]，埃及品系尼罗罗非鱼各世代的mtDNA D-loop区多态性相对比较丰富。mtDNA属于母系遗传，后代种群的核苷酸多样性与原始构建种群密切相关，因此推测埃及品系尼罗罗非鱼引种时的群体具备较高的遗传多样性。

80尾罗非鱼个体中，共检测出12个单倍型，在NJ系统树中形成2大分支，推断这些单倍型可能来源于2个不同遗传背景的母系祖先。埃及品系尼罗罗非鱼是从埃及尼罗河下游地区引进，该地区连通维多利亚湖、艾伯特湖、爱德华湖等多个尼罗罗非鱼野生种群繁殖水系，为不同水系间的尼罗罗非鱼的杂交提供了条件，使得尼罗罗非鱼可能具有不同的母系来源^[12-13]。

3.2   不同选育世代群体间的遗传变异与分化

从F_st和Nm方面对世代间的遗传分化进行分析。F₁与F₂、F₁与F₃之间的F_st均大于0.05，它们之间呈现中度遗传分化^[14]。而微卫星标记的研究结果是3个世代群体间无明显的遗传分化^[15]，这可能是因为在研究种群的遗传变异时，采用不同的分子标记研究结果存在一定的差异，相比微卫星标记技术mtDNA D-loop序列分析技术在检测种群遗传差异水平上可能具有更高的灵敏性。尤锋^[16]用同工酶和RAPD 2种标记对山东近海野生和养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行群体遗传学研究，结果发现RAPD标记得到的遗传距离和F_st均高于同工酶标记的同一指数；李培^[17]利用SSR和D-loop序列2种分子标记对3种笛鲷属(Lutjanus)鱼类野生和养殖群体进行了遗传分析，发现SSR标记计算得出群体间F_st低于mtDNA D-loop序列分析结果。该研究中，埃及品系尼罗罗非鱼F₁与F₂、F₁与F₃之间的呈现中度遗传分化，推测可能是因为F₁到F₂世代选育过程中，以生长速度和尾鳍条纹为主要选择目标的选育方式干扰了种群遗传结构。

3.3   人工选育方式对种群遗传结构的影响

罗非鱼的选育过程中，会出现近交机率增加，有效种群数目不断减少等因素，导致遗传多样性降低，遗传效应减弱，造成遗传瓶颈。近年来，利用分子标记技术对人工选育水生动物群体遗传结构影响的研究屡见报道。ZOU等^[18]利用mtDNA D-loop技术探究同一品种罗非鱼引种前后的遗传结构差异和遗传多样性水平变化，探讨引种后不同养殖气候和水文条件对罗非鱼群体遗传结构的影响，以此指导罗非鱼的引种选育工作；张天时等^[19]利用微卫星技术人工选育中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)群体开展连续6个世代的遗传多样性跟踪分析，探讨目前的人工选育方式对对虾的选育潜力和遗传效应的影响，为中国对虾的选种育种方式改进提供技术保障；张志允等^[20]采用微卫星技术对中华鳖(Trionyx sinensis)黄河群体的3个选育世代及其奠基群体的遗传变异进行分析，发现3个选育世代的遗传多样性有随着选育世代的递增而递降的明显趋势，揭示了人工选育可使选育群体趋于一致的规律。上述研究中经选育后的子代群体其遗传多样性与亲本群体相比均有所降低。该研究中，埃及品系尼罗罗非鱼经过三代群体选育，尼罗罗非鱼核苷酸多样性P_i的遗传多样性仍处于较高水平，没有发生明显的降低趋势，与王腾等^[15]对埃及品系尼罗罗非鱼3个选育世代的SSR标记分析结果较为一致，表明在目前的人工选育方式下埃及品系尼罗罗非鱼的世代种群遗传多样性得到了很好的保存。同时各世代均未形成独有的单倍型类群，12个单倍型在NJ系统树上互相交叉，各世代独有的单倍型也未形成独有的进化枝，说明人工选择的压力并没有对埃及品系尼罗罗非鱼选育种群的遗传结构造成大的影响，可继续目前的选育方式，采用较小的选择强度维持目前有效群体的大小，对罗非鱼种质资源进行复壮和改良，避免近亲交配。