Effects of gonadotropin-releasing hormone and domperidone on ovarian development of Penaeus monodon in vitro
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摘要:
研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)促性腺激素释放激素(EsGnRH-I)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)促性腺激素释放激素(PcGnRH)、多巴胺拮抗物地欧酮(DOM)及神经组织对斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育的调控作用效果。试验前使用石蜡切片、HE染色及荧光观察确定斑节对虾卵巢发育分期及各期卵母细胞形态特征。结果显示，斑节对虾卵巢具有自发荧光现象，主要集中于滤泡细胞以及富含卵黄颗粒的次级卵母细胞、成熟卵母细胞的细胞质区域，荧光强度与卵巢发育阶段具有显著正相关性(P＜0.01)。随后采用离体卵巢组织培养的方法研究3种激素对卵巢发育的影响。结果表明，50 ng·mL-1 EsGnRH-I、500 ng·mL-1 PcGnRH和0.3 μg·mL-1 DOM对离体卵巢的发育有明显的刺激作用，显著增大卵母细胞直径(P＜0.01)，与脑组织、胸神经处理组效果相似；同时组合使用PcGnRH和DOM能极显著促进卵母细胞发育(P＜0.01)。荧光定量PCR结果显示PcGnRH和DOM处理后能显著增加卵黄蛋白原的积累量。说明甲壳类动物GnRH和DOM均能促进斑节对虾卵母细胞成熟，并具有协同作用。
Abstract:This study investigated the effects of Eriocheir sinensis GnRH (EsGnRH-I), Procambarus clarkii GnRH (PcGnRH), domperidone (DOM) and nerve tissues on ovarian development in Penaeus monodon. The stage of ovarian and the oocyte morphology in each period were determined by paraffin sections, HE staining and fluorescence observation. The results show that P.monodon ovaries had natural autofluorescence. The fluorescence focused on the region including follicular cells, cytoplasm of developing oocyte and mature oocyte which contained amount of yolk globules. The fluorescence intensity was positively correlated to ovarian developmental stages (P < 0.01). Then we analyzed the effects of three types of hormones on the ovarian development by ovarian tissues cultured in vitro. The results showed that 50 ng·mL-1 EsGnRH-I, 500 ng·mL-1 PcGnRH and 0.3 μg·mL-1 DOM significantly increased the diameter of the oocytes (P < 0.01), similar to the treatments of brain and thoracic nerve. Combined use of PcGnRH and DOM significantly increased the diameter of the oocytes (P < 0.01). Real time quantitative PCR show that treatments of GnRH and DOM obviously induced the accumulation of vitellogenin. In conclusion, crustaceans GnRH and DOM could promote the oocyte maturation of P.monodon, and combined use of them had asynergistic effect.
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Keywords:
- GnRH /
- domperidone /
- tissue culture /
- ovarian maturation /
- P.monodon /
- autofluorescence
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甲壳类动物繁殖调控机制一直是研究热点，研究发现通过外源激素处理能促进虾蟹产卵。蔡生力[1]应用17α-羟孕酮显著促进体外培养的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)卵巢细胞分生和卵母细胞直径增大，在相同培养时间内，试验组卵母细胞直径比对照组增大30%~50%。此外，刘伟等[2]发现利用17α-羟孕酮进行点滴、注射、浸泡后均不同程度促进克氏原螯虾(Procambarus clarkii)卵巢的同步发育。注射5-羟色胺(5-HT)后抑制了多巴胺的分泌，对罗氏沼虾(Marcobrachium rosenbergii)[3]和斑节对虾(Penaeus monodon)的卵巢发育成熟[4]具有促进作用；甲基法尼酯也可有效加快刀额新对虾(Metapenaeus ensis)卵巢的成熟[5]。作为脊椎动物HPG轴中心调控因子，GnRH类似物最近在斑节对虾[6]，凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[7]及梭子蟹(Portunus pelagicus)[8]等甲壳动物中通过免疫化学方法鉴定，被发现分布于中枢神经及卵巢中。NGERNSOUNGNER等[6]用不同亚型的GnRH，七鳃鳗GnRH-I及章鱼GnRH注射斑节对虾能够促进卵巢的发育。然而，这些激素的调控作用网络和内分泌调控机理还未完整剖析，在甲壳类动物中GnRH和多巴胺拮抗剂是否有协同作用至今未有定论。
此研究采用近缘物种克氏原螯虾和中华线螯蟹(Eriocheir sinensis)的GnRH以及地欧酮DOM对离体培养的斑节对虾卵巢组织发育的影响进行了探讨，了解其对卵母细胞成熟的作用，初步探讨斑节对虾中可能存在的激素调节机制，为GnRH参与生殖调控提供证据，进一步深入了解甲壳类生殖内分泌机制。
1. 材料与方法
1.1 材料
1) 斑节对虾。健康的斑节对虾雌虾(体质量80~120 g，体长20~26 cm)养殖于中国水产科学研究院南海水产研究所深圳基地，在29~32 ℃充气的自然海水中暂养7 d，每天投喂2次。
2) 试剂。PcGnRH(pGlu-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2)[9]和EsGnRH (pGlu-Asn-Tyr-His-Phe-Ser-Asn-Gly-Trp-His-Pro-Gly-NH2)[10]由上海吉尔生物有限公司合成，多潘立酮即地欧酮DOM购自宁波第二激素厂。
3) 细胞培养基。根据已报道的研究结果[11]，选取2×L-15为基础培养基。用0.22 μm滤膜过滤灭菌，100 mL/瓶分装后-4 ℃冷藏。在使用前加入15%胎牛血清(Gibco，USA)、10%肌肉提取液及1% 100× PSN ANTIBIOTIC MIX(Invitrogen，USA)。
1.2 斑节对虾卵巢组织培养
健康斑节对虾于1%高锰酸钾浸泡消毒，随后无菌条件下70%酒精全身擦拭，并解剖取出卵巢、脑、胸神经及视神经，卵巢称重用于计算性腺指数。组织用含有1% PSN ANTIBIOTIC MIX的冰冷磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤数次，随后分别切成1 mm3的小块。适量卵巢组织块均匀接种到24孔板中，加入1 mL培养基，于28 ℃振荡培养24 h。
卵巢组织分为12个处理组，在振荡培养前加入组织或80 μL试剂，分别为50 ng·mL-1 PcGnRH，500 ng·mL-1 PcGnRH，50 ng·mL-1EsGnRH，500 ng·mL-1 EsGnRH，0.3 μg·mL-1 DOM，3 μg·mL-1 DOM，脑组织，胸神经，视神经，视神经及3 μg·mL-1 DOM，视神经及500 ng·mL-1 PcGnRH与3 μg·mL-1 DOM混合物，对照组只加入PBS。
1.3 组织切片及直径统计
将部分卵巢组织小块置于Bouins固定液进行过夜固定，经流水冲洗及70%~100%梯度酒精脱水后，使用1 : 1乙醇二甲苯透明，经过浸蜡包埋后过夜放置，进行连续切片，片厚4 μm，相邻2张切片，一张进行苏木精-伊红染色，另一张切片在二甲苯中浸泡10 min，直接在Evos fL DP71荧光显微镜(Life Technologies, USA)下观察，激发光波长460~495 nm，曝光时间30 ms。各组随机选择20个卵母细胞进行直径测量，卵母细胞的直径按照(细胞长径+细胞短径)/2的公式计算。各期卵巢组织同样处理。
1.4 卵黄蛋白原(Vg)的荧光定量PCR测定
提取各组剩余卵巢组织RNA，按照PremeScript TM RT reagent Kit (TaKaRa)说明书反转录获得cDNA模板，利用TaKaRa SYBR® Prime ScriptTM RT PCR Kit (Perfect Real Time)试剂盒在LC480荧光定量PCR仪(Roche，USA)进行定量PCR反应。反应程序为95 ℃预变性40 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，共进行40个循环。每个组别设置3个重复。使用引物Vg-F (5′-AAAACCGATGAGAAGAC T-3′) 和Vg-R(5′-TCCTACAGAAGACACCCT-3′)扩增卵黄蛋白原基因。扩增EF-1α-F (5′-GTCTTCCCCTTCAGGACGTC-3′)和EF-1α-R (5′-CTTTACAGACACGTTCTTCACGTTG-3′)[12]作为内参，试验数据采用相对ΔCT法(2-ΔΔCT法)分析基因在各组样品中的相对表达量。
1.5 数据处理
试验数据采用“平均值±标准误”(X±SE)表示。显著性检验在SPSS 19.0中进行，采用ANOVA及Student-Newman-Keuls法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性标准。
2. 结果
2.1 卵巢发育分期及各期卵母细胞特征
首先通过切片方法确定卵巢发育分期。根据HE染色结果，参考黄建华等[13]分期方法将斑节对虾卵巢发育分为6期，其中Ⅱ期核染色质期(图 1-a)大多数由卵黄发生前期卵母细胞(Oct1)组成，直径为11.8~43.5 μm；Ⅲ期周边核仁期(图 1-b)富含卵黄发生前期与卵黄发生期初级卵母细胞(Oct2)，卵母细胞直径持续增大，约为35~85 μm；Ⅳ期卵黄囊期(图 1-c)卵母细胞明显增大，充满卵黄颗粒，HE染色为紫红色，各次级卵母细胞的直径差异较大，为131~237 μm；Ⅴ期(图 1-d)即成熟期卵巢内充满皮质杆状体的卵子，卵母细胞直径达到160~283 μm。
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图 1 卵巢分期组织学切片a为Ⅱ期卵巢HE染色切片；b, c, d分别为Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ期卵巢组织HE染色切片; 相对应的e, f, g, h为绿色荧光拍照的Ⅱ至Ⅴ期卵巢切片图片；其中Oct1为卵黄发生前卵母细胞；Oct2为初级卵母细胞；Oct3为次级卵母细胞；Oct4为成熟卵母细胞。箭头示绿色荧光信号处。Figure 1. Ovarian histology in different periodsa is HE staining of Stage Ⅱ ovarian; b, c and d are HE stainings of Stage Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ ovarian, respectively; e, f, g, h are fluorescence images corresponding to Stage Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ ovarian using a fluorescence microscope; Oct1 are previtellogenic oocytes; Oct2 are early vitellogenesis oocytes; Oct3 are vitellogenic oocytes; Oct4 are mature oocytes. The arrows show the green fluorescence signals.利用460~495 nm激发光，可在荧光显微镜中清晰观察到各期卵巢切片。在早期发育的Ⅱ期几乎看不见绿色荧光，仅在卵黄发生前期卵母细胞(Oct1)周围有微弱带状绿色荧光，同时少数滤泡细胞中也存在点状荧光(图 1-e)；早期发育的Ⅲ期卵母细胞出现较弱绿色荧光，主要分布在初级卵母细胞(Oct2)核仁区及周围的滤泡细胞中，在少数初级卵母细胞细胞质中成片出现荧光(图 1-f)；Ⅳ期荧光增强，主要分布在次级卵母细胞(Oct3)细胞质的卵黄颗粒上(图 1-g)；Ⅴ期荧光最强，强荧光信号分布在具有卵黄颗粒的部分，除细胞核外，整个成熟卵母细胞(Oct4)发出较强绿色荧光，而富含脂肪滴的皮质棒状体发出的荧光较弱(图 1-h)。4个不同发育期的荧光强度与发育阶段存在显著正相关性(R=0.865，P＜0.01)，可根据荧光强度初步判断卵巢发育分期。
2.2 GnRH及DOM对卵母细胞直径的影响
所解剖的斑节对虾卵巢呈黄绿色，结合切片观察确定所用于组织培养的斑节对虾处于Ⅲ期，性腺指数为2.9%，符合黄建华等[13]研究的班节对虾Ⅲ期卵巢发育的组织学及性腺指数特征。经24 h的药物处理后，卵母细胞直径发生变化见图 2。
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图 2 不同试验组卵母细胞直径的变化Figure 2. Changes of diameter of oocytes in different experimental groups未处理组卵母细胞直径为(112.28±4.95)μm，PcGnRH可有效地增大卵母细胞的直径，其中高浓度(500 ng·mL-1)组别效果极显著(P＜0.01)，平均直径达150 μm；EsGnRH具有相似效果，但低浓度(50 ng·mL-1)处理即可获得显著增大效果(P＜0.01)，高浓度(500 ng·mL-1)促进效果不显著；300 ng·mL-1 DOM处理显著促进卵母细胞直径增至(138.93±6.70) μm(P＜0.05)，高浓度下则增大效果不显著(图 2-A)。GnRH或DOM试验处理组均较对照促进卵母细胞直径增大8% ~33%。
试验添加脑组织、胸神经作为阳性对照，添加视神经作为阴性对照，结果显示添加脑组织块与卵巢组织块共培养可显著增大Ⅲ期斑节对虾的卵母细胞直径(P＜0.05)；胸神经促进卵母细胞发育的效果最为明显，卵母细胞直径增大至(152.16±5.32) μm(P＜0.01)；而视神经作用效果不明显。当视神经组单独添加3 μg·mL-1 DOM后，能促进卵母细胞增大至(131.4±10.48) μm，而添加500 ng·ml-1 PcGnRH与3 μg·mL-1 DOM组合则显著增大卵母细胞直径至(142.20±7.82) μm(P＜0.01)(图 2-B)。
2.3 Vg的定量表达
甲壳动物的卵巢发育主要是通过卵黄发生过程合成Vg[14]，因此Vg含量变化可以作为卵母细胞成熟程度的考量。选取细胞试验效果显著的处理组进行Vg含量的定量测定。从图 3可以看出脑处理组极显著增强了Vg mRNA的表达量，较对照组提高了22倍。EsGnRH及DOM单独处理组Vg相对表达量明显增强，分别为对照组的2.8倍和3.4倍(P＜0.05)，同时EsGnRH与DOM共同作用极显著高于单一处理组，为对照组的13.4倍，但是没有脑组织处理组表达量高。
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图 3 Vg在不同试验组中的实时荧光定量分析Figure 3. Real-time quantitative analysis of Vg in different experimental groups3. 讨论
通常使用HE染色进行组织分析来判断卵巢发育具体时期，试验中发现可以根据卵巢切片自发光的荧光强度来确定斑节对虾的卵巢分期。自发荧光的强度从Ⅱ期到Ⅳ期逐渐增强，在Ⅴ期达到最大值，这与卵黄颗粒的积累量和积累部位完全一致，因此荧光强弱反映了卵母细胞中卵黄的含量。新近的研究结果表明，墨吉对虾(Fenneropenaeus merguiensis)卵巢也具有类似的特性[15]。事实上，从三疣梭子蟹卵巢提纯的卵黄磷蛋白被证明是一种含有糖和类胡萝卜素辅基的高密度脂蛋白(HDL)[16]。类胡萝卜素是一种脂溶性色素，具有一定的光学特性，因此带有类胡萝卜素基团的卵黄蛋白在一定波长激发下显示出荧光。在Ⅱ、Ⅲ期的滤泡细胞中也发现点状荧光，说明滤泡细胞是卵黄蛋白的合成部位。根据卵巢切片自发光情况可判断卵巢分期，较HE染色方法用时短，切片还可继续使用，是一种简便有效的卵巢细胞分期手段。
早期研究证明了将处于生殖期的脑、胸神经节抽提物注射入另一甲壳动物成体中，能显著促进卵巢发育[17]，中华绒螯蟹离体卵巢组织添加脑及胸神经节对卵黄发生前期及初级卵黄发生期的卵母细胞直径有增大作用，对次级卵黄发生期卵母细胞直径增大作用更为显著[18]。同样笔者试验中也研究了斑节对虾的脑、胸腺神经及视神经对卵巢发育的调节作用，发现脑及胸神经可以极显著地增大斑节对虾Ⅲ期次级卵黄发生期卵母细胞直径。视神经共培养没有明显的抑制作用。
同时，通过使用2种近缘物种的GnRH均促进了斑节对虾卵母细胞的发育。利用500 ng·mL-1的PcGnRH或者50 ng·mL-1的EsGnRH能极显著促进体外培养的斑节对虾卵母细胞的增长。在脊椎动物中，促性腺激素释放激素GnRH处于下丘脑-垂体-性腺生殖激素调控轴(HPG轴)的顶端与中心位置[19-20]。不同类型的GnRH具有不同的效果，在脊椎动物中Ⅰ型主要与性腺激素的释放相关，Ⅱ型和Ⅲ型参与生殖行为、内分泌调控等。PcGnRH和EsGnRH的一级结构最近分别从克氏原鳌虾[9]和中华绒鳌蟹[10]中被分离获得，通过体外注射试验，PcGnRH和EsGnRH均能促进自身卵巢的成熟。因此，从一级结构及已获得的作用效果分析，PcGnRH和EsGnRH可能属于Ⅰ型，且Ⅰ型的PcGnRH和EsGnRH均对近缘物种斑节对虾卵细胞成熟具有调控作用。此外，虾类PcGnRH与蟹EsGnRH的效果相比，小剂量(50 ng·mL-1)的蟹EsGnRH效果更明显，推测斑节对虾内源的GnRH一级结构与EsGnRH类似，易于与斑节对虾GnRH受体的结合，从而发挥调控的作用。
多巴胺抑制剂DOM也能促进斑节对虾卵母细胞的增长。在脊椎动物中，多巴胺不仅能直接抑制脑垂体性腺刺激素的分泌活动，也能抑制GnRH的功能[21]。DOM作为多巴胺拮抗物，通过消除多巴胺对促性腺激素分泌活动的抑制作用，从而显著增强了GnRH促进性腺激素的分泌及诱导排卵的作用。招潮蟹(Uca pugilato)注射了多巴胺拮抗剂5-HT后促进了其精巢发育成熟[22]。使用0.3 μg·mL-1 DOM极显著促进体外培养的斑节对虾卵母细胞增长至(138.93±6.70) μm，视神经与DOM共同作用也具有相似效果，说明在斑节对虾中可能存在多巴胺调控通路。然而，高剂量(3μg·mL-1 DOM)促进效果反而降低，这可能存在一定的负反馈调节的机制。
同时联用GnRH与DOM具有协同促进卵母细胞成熟的效果。在鱼类养殖中，GnRH与DOM配合用于鱼类催产已得到广泛应用。最近研究表明联合使用GnRH与DOM能够促进胡瓜鱼(Osmerus eperlanus L.)LHβ的表达，提高性腺指数，促进卵巢卵黄蛋白的合成[23]。卵黄发生和积累卵母细胞发育成熟的关键条件[24]。单独使用EsGnRH或DOM均能促进卵母细胞Vg表达量的增加，联合使用效果更为显著。ALFARO等[25]对野生的细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)亲虾和家养的凡纳缤对虾亲虾注射5-HT和多巴胺拮抗剂螺旋丁苯(spiperone)合剂，促进了卵巢成熟、产卵。上述研究结果表明，虽然甲壳类中不存在脊椎动物的HPG轴调控系统，但可能通过中枢神经系统分泌相互拮抗的激素或神经递质，实现对卵巢发育刺激或抑制的拮抗调节。由于Vg的水平与斑节对虾卵母细胞的发育成熟具有正相关关系(结果未发表)，推测斑节对虾GnRH对Vg可能的调控机制为在GnRH的刺激下c-Jun等转录因子被激活，最终促进了促黄体生成激素(LH)的转录和Vg的表达。
4. 结论
文章对近缘物种GnRH及DOM对斑节对虾卵巢体外成熟效果进行了研究和探索，证明了克氏原螯虾、中华绒螯蟹的GnRH和DOM可以显著促进卵母细胞发育，也提示在无脊椎动物不存在类似于HPG轴的条件下，GnRH和DOM具有协同刺激卵母细胞成熟的作用。
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图 1 卵巢分期组织学切片
a为Ⅱ期卵巢HE染色切片；b, c, d分别为Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ期卵巢组织HE染色切片; 相对应的e, f, g, h为绿色荧光拍照的Ⅱ至Ⅴ期卵巢切片图片；其中Oct1为卵黄发生前卵母细胞；Oct2为初级卵母细胞；Oct3为次级卵母细胞；Oct4为成熟卵母细胞。箭头示绿色荧光信号处。
Figure 1. Ovarian histology in different periods
a is HE staining of Stage Ⅱ ovarian; b, c and d are HE stainings of Stage Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ ovarian, respectively; e, f, g, h are fluorescence images corresponding to Stage Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ ovarian using a fluorescence microscope; Oct1 are previtellogenic oocytes; Oct2 are early vitellogenesis oocytes; Oct3 are vitellogenic oocytes; Oct4 are mature oocytes. The arrows show the green fluorescence signals.
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图 2 不同试验组卵母细胞直径的变化
Figure 2. Changes of diameter of oocytes in different experimental groups
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期刊类型引用(3)
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