Genetic diversity analysis of six cultured populations of Macrobrachium rosenbergii using microsatellite markers
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摘要:
采用微卫星分子标记技术比较了中国和泰国罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)养殖群体的遗传多样性及遗传结构。使用12对荧光标记微卫星引物扩增3个广东罗氏沼虾养殖群体、1个江苏养殖群体以及2个泰国养殖群体，结果显示所检测的12个微卫星位点均具有较高的多态性[多态信息含量(PIC)=0.853~0.941]。各群体均具有较高的遗传多样性水平[期望杂合度(He)=0.848~0.896]。群体间遗传分化指数(Fst)及AMOVA分析显示，群体间遗传分化属于中低水平(Fst＜0.15)，遗传变异有5.27%来自群体之间，94.73%来自于群体内部。遗传距离分析显示江苏群体和广东群体2的遗传距离(Da)最近(0.160 8)；而广东群体1和泰国群体2之间的遗传距离最远(0.695 8)。基于遗传距离构建的UPGMA系统进化树显示，6个群体聚为2个大支，广东3个群体与江苏群体聚为一支，泰国的2个群体聚为另一支。研究结果显示所分析的中国和泰国罗氏沼虾养殖群体均具有较高的遗传多样性，但彼此亲缘关系较远。
Abstract:We compared the genetic diversity and structure of cultivated population of Macrobrachium rosenbergii collected from different areas in China and Thailand by microsatellite analysis. Twelve fluorescently labeled primers were used to amplify microsatellite DNA from three Guangdong cultivated populations (GD1, GD2 and GD3), one Jiangsu cultivated population (JS) in China and two cultivated populations in Thailand (TG1 and TG2). The results show that the detected microsatellite loci possessed high polymorphism (PIC=0.853~0.941). All the populations analyzed displayed high genetic diversity (He=0.848~0.896). Genetic differentiation index (Fst) and AMOVA analysis reveal that the genetic differentiation within populations was relatively low (Fst < 0.15). About 5.27% genetic variation was derived from inter-populations, while 94.73% variation was derived from intra-population. Nei′s genetic distance indicates that the genetic distance between JS and GD2 population was the lowest (0.160 8), while that between the GD1 population and TG2 population was the highest (0.695 8). Phylogenetic analysis displays that these six M.rosenbergii populations could be divided into two groups. GD1, GD2, GD3 and JS populations were clustered together as one group and TG1 population was clustered with the TG2 population as another group. The results demonstrate that the analyzed cultivated M.rosenbergii populations maintained relatively high genetic diversity, and there was low kinship between China and Thailand populations.
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温度和盐度是贝类养殖过程中2个重要的水环境因子，对贝类机体抗氧化还原水平具显著影响[1]。因海水温度和盐度易受季节及降雨等方面影响，导致海水贝类抗氧化酶活性改变，造成贝类大面积死亡，给贝类养殖带来严重的经济损失。近年来温度和盐度对水生动物抗氧化酶活性影响已成为研究热点。已有研究发现，温度和盐度变化对贻贝(Mytilus galloprovincialis)[2]、栉孔扇贝(Chlamys farreri)[3]和缢蛏(Sinonovacula constricta)[4]等贝类中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性具有显著影响。对其他水生动物研究发现，温度降低能够降低大黄鱼(Pseudosciaema crocea)肌肉中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性[5]；银鲳(Pampus argenteus)肝脏中抗氧化酶活性易受盐度影响发生改变[6]。
华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)隶属软体动物门、瓣鳃纲、珍珠目、扇贝科，广泛分布于中国南海、日本、越南以及印度尼西亚等沿海地区[7]。华贵栉孔扇贝养殖周期较短、易养成、肉质甜美，是一种重要水产经济贝类[8-9]。目前，国内外对华贵栉孔扇贝的研究主要集中在群体遗传多态性[10]、壳色和闭壳肌颜色[11]、呼吸和排泄[12]以及毒性金属对免疫影响[13]等方面。温度和盐度对华贵栉孔扇贝抗氧化酶协同影响的研究尚未见报道。中心复合设计是近年来国内外应用较多的一种试验优化方法，其优点在于减少试验次数、具有较好的预测性、易获得较优条件等[14]。响应曲面能够直观地反映出因素间对响应值的互作影响。文章采用中心复合设计和响应曲面分析方法，考察温度和盐度对华贵栉孔扇贝血淋巴中SOD、CAT和GSH-PX 3种抗氧化酶活性的协同效应，建立影响因子与响应值之间关系的曲面模型，并对各因素的二次效应和交互作用进行分析，旨在阐明温度和盐度变化对华贵栉孔扇贝抗氧化酶活性的影响，为华贵栉孔扇贝耐高温、高盐品系培育以及健康养殖提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
华贵栉孔扇贝于2013年3月20取自海南三亚某养殖场，平均壳长为(63.12±2.454)mm。华贵栉孔扇贝取回后用软毛刷刷去表面附着物，放入水族箱中，在广东海洋大学无脊椎动物实验室暂养7 d，暂养期间海水温度为25 ℃，盐度为22，24 h连续充气，每天投喂亚心型扁藻(Tetraselmis Chui)，每天50%换水1次。
1.2 试验设计
正式试验前采用单因素试验方法，确定华贵栉孔扇贝可以正常摄食，生长的温度和盐度分别为19~31 ℃和22~38。试验采用中心复合设计和响应曲面法，优化了温度和盐度2个因子对华贵栉孔扇贝中SOD、CAT、GSH-PX活性的影响(表 1)，温度(T)和盐度(S)在上述范围内各取3个水平。各水平的编码值分别为-1、0、1，共设计11个组合，中心点重复3次，整个试验重复2次。为减小系统误差，所有组合均随机安排。
表 1 试验设计及结果Table 1. Experiment design and result试验组group 编码值coded value 实际值actual value 超氧化物歧化酶/U·mg-1
SOD过氧化氢酶/ U·mg-1
CAT谷胱甘肽过氧化物酶/ U·mg-1
GSH-PXT S T S 1 0 -1 25 22 31.43±1.43 38.32±1.03 14.27±1.32 2 1 1 31 38 7.21±1.46 11.09±1.39 11.28±0.58 3 -1 -1 19 22 6.14±0.22 17.94±2.10 6.34±1.64 4 0 0 25 30 30.51±0.64 35.25±0.56 27.43±1.02 5 0 0 25 30 28.65±0.13 32.95±0.42 31.34±0.75 6 -1 0 19 30 16.23±1.24 20.42±1.43 16.76±0.53 7 0 0 25 30 37.56±0.73 33.95±0.48 29.56±0.85 8 0 1 25 38 17.34±1.43 21.42±1.71 11.44±1.45 9 -1 1 19 38 9.95±1.28 16.32±1.91 5.96±1.35 10 1 -1 31 22 29.78±0.45 31.32±2.42 13.74±1.84 11 1 0 31 30 22.67±0.94 25.48±2.33 24.34±0.93 注：T. 温度；S. 盐度
Note：T. temperature；S. salnity1.3 试验方法
试验在760 mm×550 mm×475 mm塑料箱中进行，每个试验组放入30只华贵栉孔扇贝，用充气泵供给充足的氧气，并调节箱体中海水的温度、盐度至表中相应的组合(表 1)。温度每天上升或下降1~2 ℃；盐度则采用曝气后的海水加入海水晶或加入淡水进行控制，每天上调或下调幅度为2。当温度和盐度达到各组合后再饲养7 d，然后随机抽取健康的10只华贵栉孔扇贝，用灭菌的1 mL注射器在闭壳肌中抽取血淋巴，置于1.5 mL含有抗凝剂的离心管中，放入4 ℃冰箱中用于酶活性测定。
1.4 酶活性测定
试验中SOD、CAT和GSH-PX活性的测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法，其活性单位定义为1 mg组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活性单位(U)；CAT活性通过分光光计测定H2O2减少的量进行测定，CAT活性单位定义为每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmoL的H2O2的量为1个CAT活性单位(U)；GSH-PX活性通过测定催化底物氧化产生的黄色化合物离子浓度来测定，GSH-PX活性单位定义为每毫克组织蛋白每分钟扣除非酶促反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1 μmoL · L-1为1个GSH-PX活性单位(U)。
1.5 数据处理
采用Design Expert 8.0软件进行试验设计与数据处理，以温度和盐度为自变量，SOD、CAT、GSH-PX为因变量，进行二次多项回归拟合，建立酶活性的二次回归模型为：Y=b0+b1T+b2S+b3T×S+b4T2+b5S2。式中Y为相应变量(SOD、CAT和GSH-PX活性)，b0为回归常数，b1和b2分别为温度和盐度的一次效应，b3为温度和盐度的互作效应，b4和b5为温度和盐度的二次效应。
通过ANOVA分析确定回归方程模型的显著性，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，得出决定系数以考察模型的拟合优度，模型中各项效应采用最小二乘法进行估计并采用F统计量进行显著性试验。并对华贵栉孔扇贝中SOD、CAT和GSH-PX活性最小时的温度和盐度进行优化，优化出的结果可靠性以满意度函数来表示。
2. 结果与分析
2.1 温度、盐度对SOD活性的影响
一次效应是指响应值与影响因子间呈线性关系，二次效应则是指响应值与影响因子间呈非线性关系，当二次效应显著则表明影响因子在最优值。温度、盐度对华贵栉孔扇贝血淋巴中SOD活性所建立的回归模型极显著(P < 0.01)(表 2)。失拟项显著性检验结果为不显著(P>0.05)，表明拟合的模型有效。温度、盐度的一次效应、二次效应以及温、盐互作效应对SOD活性影响均显著(P < 0.05)(表 3)。对试验数据进行二次多元回归拟合，根据所测得的数据得出SOD活性对温度、盐度的二次回归方程为YSOD=-374.421 5+21.420 8T+9.288 1S-0.137 4T×S-0.330 8T2-0.109 0S2。该回归方程的决定系数为0.950 1，校正系数为0.900 3，预测系数为0.805 8，表明该模型能解释95.01%响应值变化，仅有总变异的5.99%不能用此模型解释，因此模型选择恰当。
表 2 温度和盐度对超氧化物歧化酶活性影响回归模型方差分析Table 2. Variance analysis of synergistic effect of temperature and salinity on SOD activity来源
source平方和
SS自由度
df均方
MSF P 模型 model 1 118.58 5 223.72 19.05 0.002 9 残差 residual 58.71 5 11.74 失拟 lack of fit 14.53 3 4.84 0.22 0.876 9 纯误差 pure error 44.18 2 22.09 cor total 1 177.29 10 注：决定系数R2=0.950 1；校正系数Adj R2=0.900 3；预测系数Pred R2=0.805 8
Note：R2=0.950 1；Adj R2=0.900 3；Pred R2=0.805 8表 3 回归方程系数显著性检验Table 3. Significance test for regression coefficients因子
factor系数估计
coefficient estimate标准误
standard errorP 95%置信下限
CI low95%置信上限
CI highintercept 31.89 1.76 27.37 36.41 T 4.56 1.40 0.022 5 0.96 8.15 S -5.48 1.40 0.011 3 -9.07 -1.88 T×S -6.60 1.71 0.012 0 -11.00 -2.19 T2 -11.91 2.15 0.002 6 -17.44 -6.37 S2 -6.97 2.15 0.023 0 -12.51 -1.44 注：系数估计值为编码形式
Note：The coefficient estimates were given in terms of coded factors.温盐的交互作用显著(P < 0.05)(图 1-a)，当温度为25 ℃、盐度为22~30时，SOD活性呈现上升趋势，盐度高于30，SOD活性逐渐降低，且酶活性低于30 U · mg-1；当盐度为30，温度19~25 ℃时，SOD活性呈现升高趋势，当温度大于25 ℃，SOD活性逐渐下降(图 1-b)。温度和盐度分别为27.07 ℃和25.6时，SOD活性最大(34.20 U · mg-1)。
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图 1 温度、盐度对华贵栉孔扇贝超氧化物歧化活性影响的等高线(a)和响应曲面图(b)Figure 1. Contour plot (a) and response surface (b) for synergistic effect of temperature and salinity on SOD activity of C.nobilis2.2 温度、盐度对CAT活性的影响
表 4为温度、盐度对华贵栉孔扇贝CAT活性所建立的回归模型的方差分析。结果表明，回归模型为极显著(P < 0.01)，失拟项显著性检验结果为不显著(P>0.05)。从表 5可知，温度的一次效应和盐度的二次效应对CAT活性影响均显著(P < 0.05)，盐度的一次效应、温度的二次效应以及温盐互作效应对CAT活性影响均极显著(P < 0.01)。对试验数据进行拟合，得出CAT活性对温度、盐度的二次回归方程为YCAT=-268.599 3+18.400 9T+5.338 5S-0.096 9T×S-0.302 5T2-0.062 0S2。该回归方程的决定系数为0.981 5，校正系数为0.963 0，预测系数为0.833 1，表明该模型能解释98.15%响应值变化，因此模型选择恰当。
表 4 温度、盐度对过氧化氢酶活性影响的回归模型方差分析Table 4. Variance analysis of synergistic effect of temperature and salinity on CAT activity来源
source平方和
SS自由度
df均方
MSF P 模型 model 795.31 5 159.06 53.08 0.000 2 残差 residual 14.98 5 3.00 失拟 lack of fit 12.32 3 4.11 3.09 0.254 1 纯误差 pure error 2.66 2 1.33 cor total 810.29 10 注：决定系数R2=0.981 5；校正系数Adj R2=0.963 0；预测系数Pred R2=0.833 1
Note：R2=0.981 5；Adj R2=0.963 0；Pred R2=0.833 1表 5 回归方程系数显著性检验Table 5. Test of significance for regression coefficient因子
factor系数估计
coefficient estimate标准误
standard errorP 95%置信下限
CI low95%置信上限
CI highintercept 33.97 0.89 31.68 36.25 T 2.20 0.71 0.026 4 0.38 4.02 S -6.46 0.71 0.000 3 -8.28 -4.64 T×S -4.65 0.87 0.003 0 -6.88 -2.43 T2 -10.89 1.09 0.000 2 -13.69 -8.09 S2 -3.97 1.09 0.014 7 -6.77 -1.17 温度和盐度的互作效应对华贵栉孔扇贝CAT活性影响显著(P < 0.05)(图 2-a)，当温度为26 ℃、盐度为22~38时，CAT活性呈现上升后下降的趋势；当盐度为22、温度为19~26 ℃时，CAT活性呈现上升趋势；温度高于26 ℃时，CAT活性呈现下降趋势；当温度和盐度分别为26.89 ℃和22时，CAT活性达到最大值(37.53 U · mg-1)(图 2-b)。
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图 2 温度、盐度对华贵栉孔扇贝过氧化氢酶活性影响的等高线(a)和响应曲面图(b)Figure 2. Contour plot (a) and response surface (b) for synergistic effect of temperature and salinity on CAT activity of C.nobilis2.3 温度、盐度对GSH-PX活性的影响
表 6为温度、盐度对华贵栉孔扇贝GSH-PX活性所建立的回归模型的方差分析。结果表明，方程模型为极显著(P < 0.01)，失拟项显著性检验结果为不显著(P>0.05)。从表 7可知，影响因子温度的一次效应对GSH-PX活性影响显著(P < 0.05)，温度、盐度的二次效应对GSH-PX活性影响极显著(P < 0.01)，盐度的一次效应、温盐互作效应对GSH-PX活性影响均不显著(P>0.05)。对数据进行处理得出的温度和盐度对GSH-PX活性影响的回归方程为YGSH-PX=-289.251 4+9.316 5T+13.055 4S-0.010 8T×S-0.168 6T2-0.215 1S2。回归方程的决定系数为0.096 79，校正系数为0.935 7，预测系数为0.823 1，表明该模型能解释96.79%响应值的变化，仅有总变异的3.21%不能用此模型解释，因此模型选择恰当。
表 6 温度、盐度对谷胱甘肽过氧化物酶活性影响的回归模型方差分析Table 6. Variance analysis of synergistic effect of temperature and salinity on GSH-PX activity来源
source平方和
SS自由度
df均方
MSF P 模型 model 813.60 5 162.72 30.11 0.001 0 残差 residual 27.02 5 5.40 失拟 lack of fit 19.36 3 6.45 1.68 0.393 6 纯误差 pure error 7.66 2 3.83 cor total 840.63 10 注：决定系数R2=0.967 9；校正系数Adj R2=0.935 7；预测系数Pred R2=0.823 1
Note：R2=0.967 9；Adj R2=0.935 7；Pred R2=0.823 1表 7 回归方程系数显著性检验Table 7. Test of significance for regression coefficient因子
factor系数估计
coefficient estimate标准误
standard errorP 95%置信下限
CI low95%置信上限
CI high截距 intercept 28.31 1.19 25.25 31.38 T 3.38 0.95 0.016 1 0.94 5.82 S -0.94 0.95 0.365 1 -3.38 1.49 T×S -0.52 1.16 0.673 3 -3.51 2.47 T2 -6.07 1.46 0.008 9 -9.82 -2.31 S2 -13.76 1.46 0.000 2 -17.52 -10.01 温盐的互作效应对GSH-PX活性影响不显著(P>0.05)，且当温度接近26 ℃、盐度接近29时，GSH-PX活性接近最大值(图 3-a)。当盐度为29、温度为9~31 ℃时，随着温度的升高，GSH-PX活性呈先上升后下降的趋势；当温度为26 ℃、盐度为22~38时，GSH-PX活性随着盐度的升高呈现出先上升后下降的趋势；当温度为26.68 ℃、盐度为29.7时，GSH-PX活性最大(28.81 U · mg-1)(图 3-b)。
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图 3 温度、盐度对华贵栉孔扇贝谷胱甘肽过氧化物酶活性影响的等高线(a)和响应曲面图(b)Figure 3. Contour plot (a) and response surface (b) for synergistic effect of temperature and salinity on t GSH-PX activity of C.nobilis2.4 温度、盐度对抗氧化酶活性影响的优化
以华贵栉孔扇贝中抗氧化酶活性为目标，通过中心组合设计试验考察了温度、盐度2个因子对SOD、CAT、GSH-PX活性的影响，采用响应曲线法对结果进行优化，对3种酶活性进行整体评估。结果显示，当温度为26.41 ℃、盐度27.69时，SOD、CAT和GSH-PX活性处于相对最大值(分别为33.02 U · mg-1、35.73 U · mg-1和27.94 U · mg-1)，满意度达98.9%。即在此组合下，抗氧化酶活性最高。为了进一步验证响应曲面优化条件的可靠性，按所得最优条件进行验证试验，设置温度为26.4 ℃、盐度为27.7时，所测得SOD、CAT和GSH-PX活性分别为34.12 U · mg-1、35.69 U · mg-1和27.88 U · mg-1，与理论预测的条件下所得到的最大酶活性基本相符，说明模型优化条件合理有效。
3. 讨论
3.1 温度和盐度对华贵栉孔扇贝SOD、CAT、GSH-PX活性影响分析
温度是水生动物生存所需的重要非生物环境因素之一，主要对生物机体中生化反应过程、代谢能力以及生物体中某些生物大分子的活力产生影响。温度改变常会造成水体中溶氧含量降低，发生呼吸爆发，产生大量氧自由基，造成贝类氧化损伤。试验发现，温度的一次效应和二次效应对华贵栉孔扇贝SOD、CAT和GSH-PX活性的影响显著(P < 0.05)。一次效应显著表明SOD、CAT和GSH-PX 3种酶活性易受到温度影响，二次效应显著则说明当盐度一定时，随温度升高SOD、CAT、GSH-PX活性呈现峰值变化，即存在最大值。这一变化规律与李晓英等[15]对青蛤(Cyclina sinensis)肝胰脏中SOD活性研究结果相同，主要原因是当温度升高时，试验华贵栉孔扇贝受到外界温度胁迫，短时间内体内的代谢速度加快，产生过多的活性氧自由基，诱导SOD、CAT、GSH-PX活性升高，但温度超过最适范围时，机体的新陈代谢能力及自身活力降低，相关抗氧化酶活性受体内环境的改变而降低，最终导致机体因体内残有大量氧自由基而死亡[16-17]。该研究发现，当华贵栉孔扇贝体内SOD、CAT和GSH-PX活性最大时所对应的温度条件下，华贵栉孔扇贝无论在摄食还是自身活力均优于其他条件组，表明在最适环境条件下，华贵栉孔扇贝抗氧化酶活性较高，利于机体内氧自由基清除，减少个体因呼吸爆发造成的死亡现象。对鸡帘蛤(Chamelea gallina)[18]、海蛤(Macoma balthica)[19]、盘鲍(Haliotis discus)[20]、中华鲟(Acipenser sinensis Gray)[21]等的研究同样发现，当温度处于最适温度时，机体内抗氧化酶活性最高。华贵栉孔扇贝属于暖水性贝类，因此，在室内人工养殖过程中海水温度应控制在约26.4 ℃，以保证华贵栉孔扇贝抗氧化能力最强，个体成活率最高。当池中贝类突然发生死亡，可首先检测水温的变化，若温度高于或低于正常温度，则会造成贝类呼吸爆发死亡；若温度并未发生改变，则可判断是由于病害或者投喂饵料问题造成贝类死亡。
盐度是水环境中重要的非生物因子，水体盐度的改变能够对机体的渗透压产生影响，从而影响生物体内离子水平、能量代谢以及电解质平衡，最终改变生物体内某些酶的活性[22-23]。该试验显示，盐度的一次效应对华贵栉孔扇贝SOD和CAT活性影响显著(P < 0.05)，而对GSH-PX活性影响不显著(P>0.05)，表明SOD和CAT活性易受盐度影响；盐度的二次效应对SOD、CAT和GSH-PX活性影响显著(P < 0.05)，表明当温度一定时3种抗氧化酶活性随着盐度的升高呈现出先升高后下降的峰值变化。这可能是由于在等渗点附近，华贵栉孔扇贝的代谢率和耗氧率较高，而盐度高于或低于等渗点时，其耗氧率呈现下降趋势[24]，因此机体的新陈代谢会减慢，氧化还原反应产生的氧自由基较少，导致抗氧化酶活性下降。这与强俊等[25]对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼抗氧化酶活性研究结果相同，即当盐度过高时，肝脏中CAT活性呈现下降趋势。时少坤等[26]在对近江牡蛎(Crassostrea rivularis)中SOD活性的研究中发现，SOD活性在高盐度组中显著低于其他盐度组；PAITAL等[27]研究发现，锯缘青蟹(Scylla serrata)腹肌中盐度对GSH-PX活性影响不显著，但在一定盐度范围内GSH-PX活性会随着盐度的升高呈现出先升高后降低的变化趋势。以上研究均与此试验结果一致，表明高盐度或低盐度能够抑制抗氧化酶活性，只有在适宜的盐度范围内，抗氧化酶活性才能达到最大。因此在人工养殖华贵栉孔扇贝过程中，不可忽略海水盐度对贝类造成的影响，若盐度超过26~28，会造成华贵栉孔扇贝代谢降低，体内氧自由基增多，最终导致贝类死亡，降低经济效益。
3.2 温度和盐度对华贵栉孔扇贝SOD、CAT、GSH-PX活性联合效应分析
该研究采用响应曲面法分析温度和盐度对华贵栉孔扇贝SOD、CAT、GSH-PX活性联合效应的影响。响应曲面分析方法最大优点是可以通过对响应曲面的分析得到拟合度较高的模型方程，同时还能对试验结果进行优化，找到最优因子组合。然而，国内外关于环境因子对贝类抗氧化酶活性影响的研究基本集中在某一环境因素下几个孤立水平点进行分析，并未建立可靠的模型。该研究基于响应曲面图发现，SOD、CAT和GSH-PX活性的响应曲面图呈上凸曲线，表明3种酶存在最大值。对所建立模型进行优化，得到SOD、CAT和GSH-PX活性最高的理论条件为温度26.4 ℃、盐度27.7。说明在此条件下，华贵栉孔扇贝的生存环境较适宜，未受到外界恶劣环境的胁迫。结果显示温度和盐度的交互作用对SOD、CAT活性影响显著(P < 0.05)，表明温度和盐度2个因子可以相互影响；温度和盐度的交互作用对GSH-PX活性影响不显著(P>0.05)，表明对于GSH-PX而言，温度和盐度是2个独立因子，两者之间不存在效应叠加或干扰。对其他水生动物研究表明，温度和盐度对吉富罗非鱼[25]、军曹鱼幼鱼[28]的SOD和CAT活性具有显著的协同效应，与该研究所得结果相同，但温度和盐度联合效应对GSH-PX活性影响研究较少。
该研究表明温度和盐度联合效应对华贵栉孔扇贝适应生存环境的程度具有显著影响，因此在华贵栉孔扇贝耐高温品种选育或人工养殖时不仅需考虑温度和盐度单因素的影响，还应考虑温度与盐度两因素互作作用。该试验只考察了温度盐度2个因子对血淋巴中抗氧化酶活性的影响，海水中其他因素对抗氧化酶活性的影响有待进一步研究。
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图 1 基于Nei′s遗传距离构建的6个罗氏沼虾群体的UPGMA聚类树
Figure 1. UPGMA dendrograrn of six populations of M.rosenbergii based on Nei′s genetic distance
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图 2 参试罗氏沼虾群体在K=4时的遗传结构图
Figure 2. Cluster analysis based on 14 microsatellite loci for M.rosenbergii specimens from STRUCTURE (K=4)
表 1 用于罗氏沼虾微卫星扩增的引物序列及其退火温度
Table 1 Primer sequence and annealing temperature for microsatellite marker amplification
序号No. 位点loci 重复序列repeat sequence 引物序列primer sequence 片段大小production size 复性温度/℃ annealing 1 EMR-31B (CA)7 F: FAM-GCTGTGCTCCAAAATCTCTCTC
R: CTCACCCATACTTGACAACGAC210 58 2 EMR-55 (TTA)13 F: FAM-GAAGTCATCCGACAAACTTCAC
R: AGTAATCATGTGGCCTAGCCTAG200 58 3 EMR81 (CT)15 F: TAMRA-GGAACCAGTGAAAAAGCAATGA
R: GGGGTGCATTCAAAAATAGGT240 58 4 EMR85 (AG)12 F: FAM-GACGGACAGACATTCATTAGCC
R: ATTCACCCCACACTTTGACATT220 58 5 Mbr1 (GA)24 F: HEX-CCCACCATCAATTCTCACTTACC
R: TCCTTTTCACATCGTTTCCAGTC272~320 60 6 Mbr-2 (GT)22 F: HEX-TTCCCGACCAATTTCTCTTTCTC
R: GGCAAAAATGATCTTGGATTCAC298~336 60 7 Mbr-3 (AG)14 F: TAMRA-CAACTCTATGTTTCGGCATTTGG
R: GGGGAATTTTACCGATGTTTCTG232~284 62 8 Mbr-4 (GT)29 F: HEX-CCACCTACCGTACATTCCCAAAC
R: CGGGGCGACTTTTAGTATCGAC288~326 62 9 Mbr-5 (AG)25 F: HEX-CAAGGCTCGTGTCTCTTGTTTC
R: GCTTGTACTTGTTCAGCTTTTGC286~328 62 10 Mbr-9 (TG)5(AG)17 F: TAMRA-TTGTTTGCTTGTTTAGTGTCAAGG
R: CTCCAAAACCGAAAAATCCTCAC240~284 60 11 Mbr11 (AG)31 F: TAMRA-GTATTGAGAACAAAGGCGCACAG
R: ATCTCTTTCCAAAACAGGGCACA263~291 60 12 MRMB25 (CT)17 F: FAM-CCGGTCCAAAGGAATACAGA
R: GTGGGTGGTGTCCCTATGTT194~216 46 
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表 2 罗氏沼虾12个微卫星位点的等位基因数、杂合度及多态信息含量
Table 2 Number of alleles, heterozygosity and polymorphic information content of 12 microsatellite loci of M.rosenbergii
位点locus 等位基因数Na 有效等位基因数Ne Shannon指数I 观测杂合度Ho 期望杂合度He 多态信息含量PIC EMR-31B 22 12.71 2.766 0.673 0.924 0.915 EMR-55 14 10.79 2.506 0.906 0.910 0.908 EMR81 23 13.72 2.853 0.980 0.930 0.919 EMR85 21 14.70 2.840 0.853 0.935 0.933 Mbr1 19 12.96 2.725 0.671 0.926 0.897 Mbr-2 13 6.61 2.124 0.691 0.852 0.853 Mbr-3 16 8.68 2.449 0.590 0.888 0.887 Mbr-4 24 18.33 3.024 0.723 0.948 0.941 Mbr-5 19 11.40 2.666 0.891 0.915 0.914 Mbr-9 28 16.57 3.045 0.713 0.943 0.939 Mbr11 17 8.41 2.439 0.488 0.884 0.886 MRMB25 14 7.88 2.321 0.994 0.876 0.876 均值mean 19.17 11.90 2.646 0.765 0.911 0.906
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表 3 6个罗氏沼虾养殖群体的遗传多样性
Table 3 Genetic diversity of six populations of M.rosenbergii
参数index 广东1 GD1 江苏JS 广东2 GD2 广东3 GD3 泰国1 TG1 泰国2 TG2 等位基因数Na 13.000 12.750 12.000 13.833 12.500 10.917 有效等位基因数Ne 7.409 7.204 6.791 8.947 8.274 6.558 Shannon指数I 2.207 2.159 2.135 2.348 2.239 2.046 观测杂合度Ho 0.821 0.751 0.720 0.761 0.808 0.683 期望杂合度He 0.871 0.858 0.861 0.896 0.881 0.848 多态信息含量PIC 0.850 0.846 0.845 0.880 0.857 0.806
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表 4 6个罗氏沼虾养殖群体的遗传分化指数
Table 4 Fixation index (Fst) of six populations of M.rosenbergii
广东1 GD1 江苏JS 广东2 GD2 广东3 GD3 泰国1 TG1 泰国2 TG2 广东1 GD1 江苏JS 0.023 0 广东2 GD2 0.024 5 0.006 3 广东3 GD3 0.031 0 0.046 9 0.041 0 泰国1 TG1 0.071 3 0.073 4 0.074 9 0.058 4 泰国2 TG2 0.093 1 0.077 8 0.082 5 0.072 9 0.006 1
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表 5 6个罗氏沼虾养殖群体的AMOVA分析
Table 5 AMOVA analysis among six populations of M.rosenbergii
变异来源source of variation 自由度df 平方和sum of squares 方差组分variance component 百分率/% percentage 群体间among populations 5 108.518 0.296 76 5.273 51 群体内within populations 312 1663.064 5.330 52 94.726 49** 总变异total 317 1771.582 5.627 28 注：* *. 1 023次模拟检验后显示为极显著(P＜0.01)
Note：* *. very significance (P＜0.01) after 1 023 permutation tests
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表 6 6个罗氏沼虾养殖群体的遗传距离(对角线下)和遗传相似度(对角线上)
Table 6 Nei′s genetic distance (below diagonal)and genetic similarity (above diagonal)of six populations of M.rosenbergii
广东1 GD1 江苏JS 广东2 GD2 广东3 GD3 泰国1 TG1 泰国2 TG2 广东1 GD1 - 0.760 4 0.737 4 0.664 0 0.393 9 0.311 7 江苏JS 0.273 9 - 0.851 5 0.572 2 0.407 7 0.432 5 广东2 GD2 0.304 6 0.160 8 - 0.597 4 0.382 2 0.390 0 广东3 GD3 0.409 4 0.458 2 0.415 2 - 0.423 5 0.379 7 泰国1 TG1 0.611 7 0.597 1 0.661 8 0.559 3 - 0.814 2 泰国2 TG2 0.695 8 0.568 1 0.611 7 0.628 4 0.205 5 -
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