Optimization of heat pump drying technical parameters of salted dry fish
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摘要:
为改进传统腌干鱼类加工方式，文章研究了腌干鱼制品在不同热泵干燥条件下的干燥曲线以及干燥工艺参数。以色差和感官评分作为指标，选取干燥温度、湿度和风速等因素进行单因素试验，根据单因素试验结果确定各因素及其水平，通过正交试验确定腌干鱼类热泵干燥的最佳条件。结果表明，热泵干燥腌鱼的最佳工艺参数为：干燥温度30 ℃，相对湿度30%，风速1.5 m · s-1。此条件下热泵干燥的腌干鱼的色差为2.68，感官评分为88.7分，可以得到与腌前鱼样色差较小、感官品质佳、鱼体的脂肪氧化小、其过氧化值只有0.135 mg · kg-1腌干鱼，改善了腌干鱼的品质。
Abstract:To improve the traditional drying technology of salted dry fish, we investigated the dry curve and dry process parameters of salted fish under different heat pump drying conditions. Taking chromatism and sensory evaluation as indices, we studied the drying temperature, humidity and wind speed which affect drying process of salted dry fish, so as to determine the best process parameters in heat pump dry process through orthogonal experiment. The optimal parameters were as follows: heat pump temperature 30 ℃, relative humidity 30% and wind speed 1.5 m · s-1. The chromatism value of salted dry fish was 2.68 and the sensory score was 88.7 under these conditions. Salted dry fish after heat pump drying had smaller chromatism, better quality and less fat oxidation with peroxide value of 0.135 mg · kg-1 compared with fresh fish. The quality of salted dry fish was improved.
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Keywords:
- salted dry fish /
- heat pump drying /
- processing /
- optimization
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鳜(Siniperca chuatsi)是中国重要的名特优养殖品种之一，近年来细菌病、病毒病的发生严重影响其产量，其中烂鳃病是危害鳜的主要细菌病之一。细菌性烂鳃病是危害中国淡水养殖鱼类最常见的疾病之一，其病原主要包括柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)[1-2]和约氏黄杆菌(F.johnsoniae)[3-5]等。黄杆菌几乎感染所有的淡水养殖品种，对中国主导淡水养殖品种如草鱼(Ctenopharyngodon idella)[6-7]、鳜[8-9]、大口黑鲈(Micropterus salmoides)[10]等危害严重，死亡率最高可达50%。传统的抗菌药物治疗方法存在病原耐药性产生、药物残留等诸多弊端，而疫苗免疫是解决此类问题重要选择之一。美国在鱼类细菌性烂鳃病疫苗产业化方面走在世界前列，早在1997年柱状黄杆菌灭活疫苗(F.columnare Bacterin，Code 2974.00)批准上市，2009年柱状黄杆菌活疫苗(AquaVac-COL®)和嗜冷黄杆菌(F.psychrophilum)灭活疫苗也先后批准上市。中国细菌性烂鳃病疫苗研究相对滞后，近年来对全菌灭活疫苗[11-12]、基因工程灭活疫苗(即菌蜕疫苗)[13]及重组亚单位疫苗[14]开展了实验室研究，但尚未有相关产品进入产业化应用。
黄杆菌主要寄生在鱼体鳃组织、体表等处[15-16]，而鱼类的皮肤、鳃和肠道及其表面黏膜所构成的黏膜相关免疫组织(mucosal-associated lymphoid tissue，MALT)是鱼体内环境和外环境之间的第一道防御屏障[17]。因此，局部黏膜免疫在机体抗感染中发挥更为重要作用。而黄杆菌全菌灭活疫苗、亚单位疫苗等由于缺乏主动黏附能力，难以引发抵抗黄杆菌侵染的黏膜免疫应答，故其浸泡免疫效果不稳定，因此迫切需要开发新的浸泡型黄杆菌疫苗。弱毒疫苗由于能够模拟强毒株趋化、黏附、浸染宿主，引起机体强烈的黏膜免疫、细胞免疫，而成为浸泡疫苗研究的热点。LI等[18]通过链霉素诱导获得约氏黄杆菌减毒株(M170株)，在鱼体上连续盲传5代未出现毒力恢复，将其制备疫苗免疫草鱼获得了良好的免疫保护效果。在此基础上，为了进一步探索该疫苗用于预防鳜烂鳃病的可行性，采用血清溶菌酶(Lys)、免疫球蛋白(IgM)、相对免疫保护率(relative percentage survival，RPS)等指标评价了鳜对约氏黄杆菌减毒株的免疫应答规律，为开发安全、高效的鳜约氏黄杆菌活疫苗奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 菌株与实验鱼
约氏黄杆菌野毒株M168由笔者实验室从患病的鳗鲡(Anguilla anguilla)鳃分离并保存，减毒株M170是由M168经链霉素诱导而来。实验鳜购自广东清远某养殖场，健康，无发病史，镜检无寄生虫，体质量约100 g，养殖于200 L塑料桶中，实验前暂养7 d，充气，每天投喂适口鲮鱼作为饵料，定期排污，实验期间水温22~29 ℃。
1.2 约氏黄杆菌M170株的制备
将保存的M170菌种涂布于含50 μg·mL-1链霉素的0.5%胰蛋白胨平板上，25 ℃恒温培养24 h，挑取单菌落，接种于100 mL 0.5%胰蛋白胨液体培养基，25 ℃恒温培养过夜，然后按1 : 10转接至0.5%的胰蛋白胨液体培养基中，25 ℃恒温培养12 h，离心收集菌体，PBS调整浓度为1×107 CFU·mL-1，用于浸泡免疫，现配现用。
1.3 鱼体免疫
健康鳜200尾被随机分为2组，每组100尾，其中M170组鳜在107 CFU·mL-1疫苗悬液中浸泡30 min，对照组在同体积养殖水中浸泡，浸泡过程中保持充氧，免疫后将鱼转入塑料桶进行养殖。
1.4 免疫相关基因定量检测
1.4.1 RNA的提取及cDNA合成
免疫后第0、第6、第24、第48、第72小时以及第7、第14、第21、第28天每组随机抽取3尾鳜，分别取脾脏、肝脏组织，按照RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen)说明书提取RNA。用TransScript Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金)进行反转录，合成cDNA第一链。
1.4.2 定量PCR检测
以cDNA第一链为模板，在ABI 7500(applied biosystems)实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR检测。反应体系和反应程序按照试剂盒SYBR Premix EX TapTM Ⅱ(Tli RNaseH plus)(宝生物工程)说明书操作。采用2－ΔΔCt法计算样品中IgM、Lys基因(goose型)的相对表达量，β-actin为内参基因。引物序列为：
IgM F：5′-ATTGTCAGGTCCATCGGGC-3′
IgM R：5′-TCAGGGATGTTCATGTTGAGGTT-3′
Lys F：5′-CTGATGCGGGCAGAATGGAA-3′
Lys R：5′-AGCCGTTATACGCTCCTCTC-3′
Act F：5′-GACTTCGAGCAGGAGATGGG-3′
Act R：5′-CGAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′
1.5 抗体滴度的测定
1.5.1 样品收集与处理
分别于免疫后第7、第14、第20、第30、第35、第42天各组取3尾鱼，尾静脉采血，室温静置2 h后，4 ℃静置过夜，3 000 g、4 ℃离心15 min，取上清，最后将同组3尾血清等体积混合，-20 ℃冻存备用。
1.5.2 抗原制备
将约氏黄杆菌M170培养过夜，10 000 r·min-1离心10 min，重悬于0.01 mol·L-1 pH 7.4的PBS，然后再10 000 r·min-1离心10 min，如此洗菌3次后重悬于包被液CBS(Na2CO3 0.8 g，NaHCO3 1.46 g，水溶解，定容500 mL)中，稀释至OD600=0.5，冰浴下采用超声波200 W的功率破碎10次，每次10 s，间隔15 s，取破碎后的细菌作为抗原4 ℃保存备用。
1.5.3 抗原包被
将以上制备抗原用包被液(CBS)进行1 : 1稀释，然后50 μL·孔-1进行包被，4 ℃包被过夜。吸上清，PBST洗涤3次；然后加250 μL·孔-1的封闭液(3% BSA+CBS)进行封闭；4 ℃过夜，吸上清，PBST洗涤3次。
1.5.4 ELISA工作程序
将待测血清进行倍比稀释(1 : 2n稀释于1% BSA+PBST中)后，每孔加100 μL稀释血清，37 ℃恒温箱孵育2 h，空白孔加1% BSA+PBST，每个样品重复3个孔；弃上清，PBST洗涤5次；加一抗(鳜鱼IgM单抗，福建省农业科学院生物技术研究所龚晖研究员赠送)，100 μL·孔-1(1 : 4 000稀释于1% BSA+PBST中)，37 ℃恒温箱温育2 h；弃上清，PBST洗涤5次。加羊抗鼠IgG-HRP二抗(Sigma)，用1% BSA+PBST l : 5 000(V/V)稀释，100 μL·孔-1，37 ℃恒温箱温育45 min，空白孔加1% BSA+PBST；弃上清，PBST洗涤5次；加新鲜配制的底物溶液[V(TMB) : V(H2O2)=1 : 1](天根)100 μL·孔-1，37 ℃避光放置20 min，当显示蓝色时加50 μL ·孔-1 H2SO4终止反应，孔的颜色将变黄，在酶标仪下测定450 nm光密度(OD)，以空白对照组调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值2.1倍判断为阳性。
1.6 血清Lys活性测定
分别于免疫后第1、第2、第3、第4、第5、第6、第35、第42天各组取3尾鱼尾静脉采血，分离血清，取等体积的每尾鱼血清混合制备成混合样，按溶菌酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书要求测定血清中Lys活性，每个样品重复3次，计算样品中Lys含量。
1.7 RPS的测定
免疫后第28天，采用约氏黄杆菌野毒株M168注射攻毒，每组20尾鱼，注射浓度为109 CFU ·mL-1，每尾注射100 μL，连续观察14 d，记录鱼体死亡情况，对发病和死亡个体进行病原的分离和鉴定，并计算RPS：RPS＝(1－免疫组死亡率/对照组死亡率)×100%。
1.8 数据分析
实验所得数据均表示为“平均数±标准差( X ± SD)”，采用OringinPro 6.0软件进行数据处理，并采用t检验进行差异性分析，当P < 0.05时表示差异显著。
2. 结果
2.1 免疫后鳜Lys表达情况
约氏黄杆菌减毒活疫苗M170免疫组Lys相对对照组表达量在免疫后第6小时显著上调(P < 0.05)，到第48小时时表达量达到峰值，是对照组的10.9倍(P < 0.05)，随后表达量迅速下降，但在第7、第21和第28天表达量仍显著高于对照组(P < 0.05)(图 1)。免疫后不同时间点鳜血清Lys水平结果见表 1。结果显示M170免疫组第1天开始相对于对照组明显升高，第2天达到高峰，为对照组的8.43倍(P < 0.05)，随后下降，到第6天与对照组水平相当；对照组整个实验过程中维持在同一水平。以上结果表明浸泡免疫后鳜Lys基因表达和血清中Lys水平相对于对照组显著升高。
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表 1 鳜浸泡免疫后不同时间点血清中溶菌酶质量浓度Table 1. Lysozyme content in serum of mandarin fish post-immunizationμg·mL-1 组别
group免疫后天数/d days post vaccination 1 2 3 4 5 6 35 42 M170免疫组M170
immunized group83.23±3.33 120.46±4.22 104.36±4.38 48.93±1.37 24.28±1.07 13.88±3.61 14.52±0.48 10.53±0.41 对照组
control group12.35±0.35 14.29±0.40 10.34±0.45 12.33±0.43 12.95±0.23 11.25±0.38 9.56±0.21 11.58±0.39 2.2 免疫后鳜特异性抗体表达情况
约氏黄杆菌减毒活疫苗M170免疫组IgM的相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)，免疫组从第7天至第28天表达量相对于对照组均显著上调，其中第28天时M170免疫组IgM相对表达量是对照组的98.7倍(P < 0.05)(图 2)。免疫后不同时间点鳜血清抗体效价结果显示，免疫后第7天抗体效价相对于对照组显著升高，第28天血清抗体效价达到峰值(26)，之后稍有下降，第49天仍维持在24水平(图 3)。
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图 2 免疫后鳜IgM表达变化Figure 2. IgM expression profile of mandarin fish vaccinated with M170![]()
图 3 免疫后鳜血清抗体效价动力学Figure 3. The kinetics of serum antibody titer of mandarin fish post-immunization2.3 RPS的测定
免疫后第28天，用约氏黄杆菌强毒株M168进行活菌攻击，结果显示，对照组鱼从第2天开始出现死亡，而M170免疫组第4天开始出现死亡，死亡个体出现鳃丝腐烂、鳍条发白、腐烂等细菌性烂鳃病症状，死亡后可从鳜鳃、肝脏等部位分离到约氏黄杆菌。实验期间免疫组累计死亡率为10%，对照组累计死亡率为70%(表 2)，该疫苗对鳜的RPS为85.9%。
表 2 约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜的免疫保护效果Table 2. Immune efficacy of attenuated F.johnsoniae vaccine for mandarin fish组别
group死亡数/总数
numbers of dead fish/total fish累计死亡率/%
cumulative mortality相对免疫保护率/%
relative percentage survivalM170免疫组immunized group 2/20 10 * 85.9 对照组control group 14/20 70 - 3. 讨论
国际上有多种鱼类黄杆菌疫苗开发成功，其中柱状黄杆菌减毒活疫苗Aquavac-Col®已在美国批准上市[19]，LAFRENTZ等[20]和ALVAREZ等[21]相继研制了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)嗜冷黄杆菌弱毒疫苗。此研究证实通过链霉素连续传代诱导获得的约氏黄杆菌减毒株M170通过浸泡免疫能引发鳜非特异性和特异性免疫应答，并提供良好的免疫保护，为开发安全、高效的鳜约氏黄杆菌减毒活疫苗奠定基础。
Lys在鱼类抵抗病原感染中发挥重要作用，可水解致病菌中的黏多糖，抵抗外来病原的入侵[22]，广泛存在于血清、皮肤黏液和组织器官中，是鱼体重要非特异性免疫指标[23]。目前已发现2种类型的Lys，分别为chicken(c-)型和goose(g-)型，其中IRWIN和GONG[24]最早在天鹅(Cygnus cygnus)蛋中发现了具有抗菌作用的g-型Lys。SUN等[25]于2006年克隆鉴定了鳜g-型Lys基因，并证实了其抗菌功能。该研究结果表明疫苗接种后第1天鳜血清Lys含量显著升高，第2天达到峰值，为对照组的8.43倍，说明约氏黄杆菌减毒株引发了鳜的非特异性免疫应答。肝脏Lys基因表达量与血清中Lys含量测定结果类似，但持续时间存在较大差别，肝脏Lys基因表达量直到第28天仍与对照组存在显著差异，而血清Lys含量到第5天与对照组无显著差异，导致出现这种差异的原因为：1)2种方法的灵敏度存在差异，定量PCR方法更灵敏，较为细微差别均能区分开来，所以定量PCR检测的肝脏Lys基因表达量到第28天仍与对照组存在显著差异；2)定量PCR是测定体内g-型Lys基因转录数量，而Lys检测试剂盒则是检测血清中Lys酶活性。
血清特异性抗体效价是评价疫苗免疫效果最常用的指标之一[26-27]。该研究结果表明免疫组鳜血清抗体效价显著高于对照组，免疫后鳜脾脏IgM基因相对表达量与免疫后血清抗体效价变化规律基本一致，表明约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫鳜后引起了机体体液免疫应答。ESTEVE-GASSENT等[28]研究表明浸泡免疫可以激发鱼类体液免疫应答，通常来说全菌灭活疫苗约在免疫后500度日血清抗体效价达到峰值，但该研究结果显示血清抗体效价在700度日(免疫后第28天)达到峰值，且IgM基因相对表达量从第7到第28天一直呈现上升趋势，推测可能是约氏黄杆菌减毒活疫苗能够在鱼体内存活较长时间，可以持续激发机体体液免疫应答。
RPS是评价疫苗免疫效果最直接指标，其高低与疫苗种类、鱼类品种、免疫途径等存在密切的关系。该研究制备的约氏黄杆菌减毒活疫苗M170株免疫鳜后第28天，浸泡免疫RPS可达85.9%，表明制备的约氏黄杆菌活疫苗具有良好的免疫保护效果。而LI等[18]用该约氏黄杆菌减毒株制备疫苗浸泡免疫草鱼后第28天RPS为73.1%，造成这种差异的原因可能与鳜体表具有发达的黏膜免疫系统有关[29]。罗霞等[30]研究发现灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)浸泡免疫鳜后，皮肤黏液的抗体效价随着时间的推移而变化，说明鳜皮肤具有强大的黏膜免疫系统。在美国批准上市的柱状黄杆菌减毒活疫苗也存在类似的结果，该疫苗对孵化后第10至第48天的斑点叉尾(Ictalurus punetaus)浸泡免疫RPS为57%~94%，而对于孵化后第10天的大口黑鲈RPS为74%~94%[19]。
综上所述，约氏黄杆菌减毒株M170浸泡免疫鳜可刺激肝脏中Lys基因和脾脏中IgM基因表达上调，血清Lys活性提高，免疫后血清抗体效价可达到26，RPS可达85.9%，表明该疫苗可有效防治约氏黄杆菌导致的鳜烂鳃病。
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图 1 不同温度、相对湿度和风速对干燥过程中含水率变化的影响
Figure 1. Effect different temperatures, relative humidies and wind speeds on moisture content in salted dry fish
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图 2 不同干燥温度、相对湿度和干燥风速对腌干鱼色差的影响
Figure 2. Effect of different drying temperatures, relative humidities and wind speeds on chromatic aberration of salted dry fish
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图 3 不同干燥温度、相对湿度和干燥风速对腌干鱼感官品质的影响
Figure 3. Effect of different drying temperatures, relative humidities and wind speeds on sensory quality of salted dry fish
表 1 感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards for salted fish
类别
type评分标准/分score for evaluation 18~25 11~17 3~10 0~3 外观appearence 鱼肉组织完整、鱼体透明、鱼骨清晰可见、无褐变 鱼肉组织较完整、鱼体较透明、鱼骨隐约可见、无褐变 鱼肉组织略不完整、鱼体半透明、鱼骨不可见、有轻微褐变 鱼肉组织不完整、褐变严重、鱼体不透明、鱼骨不可见、褐变严重 气味odour 香味浓，无腐败、酸败气味 香味较淡，有轻微腐败、酸败气味 香味很淡，腐败、哈败气味较重 无香味，腐败、哈败气味很重 咬劲chewness 鱼肉结实，咀嚼性好 鱼肉较结实，咀嚼性较好 鱼肉较软，咀嚼性较差 鱼肉软，咀嚼性差 回味aftertaste 悠长 较长 短 无回味 
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表 2 正交因素水平设计
Table 2 Orthogonal design of factors and levels
水平
level温度/℃
temperature
(A)湿度/%
relativity humility
(B)风速/m·s-1
wind speed
(C)1 35 40 2.0 2 30 30 1.5 3 25 20 1.0
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表 3 影响因素风速的t检验结果
Table 3 T test of moisture content in salted dry fish at different wind speeds
组别
group检验对象
test object成对差异paired difference t 自由度df 显著性(双侧)
Sig. (2-tailed)均值
mean标准差
standard deviation标准平均误差
standard error mean95% 置信区间
95% confidence interval of difference下限lower 上限upper 1 1.0 m·s-1与1.5 m·s-1 0.075 09 0.028 13 0.007 26 0.059 52 0.090 67 10.339 14 0 2 1.0 m·s-1与2.0 m·s-1 0.058 40 0.045 52 0.011 75 0.033 20 0.083 61 4.969 14 0 3 1.5 m·s-1与2.0 m·s-1 -0.016 69 0.029 04 0.007 50 -0.032 77 -0.000 61 -2.226 14 0.043 注： P < 0.05表示显著；P < 0.01表示极显著
Note： P < 0.05 indicates significant difference；P < 0.01 indicates very significant difference.
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表 4 正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal experiment of salted dry fish
试验序号
No.干燥温度/℃
drying temperature (A)干燥湿度/%
drying humidity (B)干燥风速/m·s-1
drying wind speed (C)空白
blank色差
chromatism感官评分
sensory score1 1 1 1 1 11.67 66.0 2 1 2 2 2 11.58 73.1 3 1 3 3 3 10.90 66.3 4 2 1 2 3 6.99 84.8 5 2 2 3 1 2.94 84.0 6 2 3 1 2 7.25 83.4 7 3 1 3 2 9.05 77.3 8 3 2 1 3 8.61 75.8 9 3 3 2 1 10.37 77.4 色差chromatism K1/3 11.38 9.24 9.18 K2/3 5.73 7.71 9.65 K3/3 9.34 9.50 7.63 R1 5.66 1.80 2.02 感官评分sensory score M1/3 68.47 76.03 75.07 M2/3 84.07 77.63 78.43 M3/3 76.83 75.70 75.87 R2 15.60 1.60 3.37
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表 5 感官评价方差分析结果
Table 5 Result of variance analysis of sensory quality of salted dry fish
来源
source平方和
SS自由度
df均方和
MSF 显著性
significance温度temperature 365.682 2 182.841 37.054 * 湿度humidity 6.409 2 3.204 0.649 风速wind speed 18.562 2 9.281 1.881 误差error 9.869 2 4.934 总变异total 400.522 8 注： F0.05(2, 2)=19.00，F0.01(2, 2)=99.00，后表同此
Note： F0.05(2, 2)=19.00，F0.01(2, 2)=99.00. The same case in the following table.
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表 6 色差方差分析结果
Table 6 Result of variance analysis of chromatic aberration of salted dry fish
来源
source平方和
SS自由度
df均方和
MSF 显著性
significance温度temperature 49.240 2 24.620 35.102 * 湿度humidity 5.632 2 2.816 4.015 风速wind speed 6.680 2 3.340 4.762 误差error 1.403 2 0.701 总变异total variance 62.954 8
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表 7 验证试验结果
Table 7 Comparison of salted dry fish dried by traditional method and heat pump drying
腌干鱼样
sample of salted dry fish色差
chromatism感官评分
sensory score过氧化值/mg·kg-1
peroxide value传统干燥traditional dry 7.63±0.07 79.6±1.51 0.178±0.00 3 热泵干燥heat pump dry 2.68±0.32 88.7±1.16 0.135±0.00 1
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