糙海参(Holothuria scabra)，又名糙参、白玉参，具有很高的经济价值和药用价值，是中国南方地区重要的经济参类之一^[1]。由于过渡捕捞以及生态环境的变化，中国南方地区野生海参的自然资源日益减少，甚至在某些地区出现了无参可捕的现象^[2-3]。随着近些年糙海参人工育苗技术的突破，糙海参的人工养殖在中国南方地区日益增多^[4]。目前，一些学者已经对糙海参进行了初步的研究。姚雪梅等^[5-6]研究了在不同pH下糙海参消化酶的活性，并对其生长和摄食情况与水温、水质的关系等方面进行了探究。严俊贤等^[7]从糙海参的胚胎和幼体发育的角度，研究了不同发育时期糙海参苗体的变化情况。杨学明等^[8]从人工育苗的角度，综合运用升温等多种刺激方法人工诱导糙海参产卵，并进行了批量人工育苗。JUSTIN等^[9]对北大西洋糙海参种群的遗传结构进行了评估。PURCELL^[10]和MERCIER等^[11]分别研究了糙海参的活动、行为等。

光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一种能在厌氧光照条件下，以小分子有机化合物或二氧化碳(CO₂)为碳源，进行不放氧光合作用的细菌^[12]。大量试验证明，光合细菌能分解利用养殖水体内的有害物质来进行自身的生命活动，通过自身的大量繁殖来争夺养殖水体及底泥中有害菌的生态位^[13]。同时，光合细菌菌体还是很多水产动物苗期优良的高效饵料。光合细菌在净化水质、降低氨氮(NH₃-N)、亚硝酸盐等有毒物质浓度、提高动物免疫力和实现健康养殖方面发挥重要作用^[14]。光合细菌在水产养殖中应用非常广泛，但目前光合细菌对糙海参生长和消化酶活性的影响还未见报道。笔者研究了光合细菌的不同添加量对苗期糙海参生长、消化酶活性及育苗水体水质的影响，以期为糙海参育苗期间的健康养殖和提高幼苗成活率提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   材料

糙海参亲本来自广东省湛江市徐闻县大井村附近的自然海域，选取个体较大、体表健康的亲本进行人工育苗。受精卵经过约24 h进入耳状幼体阶段，选择此阶段的糙海参耳状幼体进行试验。光合细菌(超浓缩型)购买于广州市利健药业有限公司，菌体浓度为1×10¹¹ cfu · mL^-1。

1.2   试验设计

试验所用糙海参幼苗养殖于室内水泥池(5 m×3 m×1.5 m)中，每池放苗4×10⁴尾。试验用幼苗随机分为4组，每组设3个重复，组1为对照组，组2、组3和组4为试验组。试验的起止时间是2013年7月28日至2013年9月7日，共41 d。在试验前期，各组每日投喂适量的金藻和扁藻。试验进行至第16天后，大部分糙海参幼苗已经生长至稚参阶段，贴在池底和池壁生长，此时每日除投喂适量金藻和扁藻外，还需投喂适量商品海参饲料(大连蛟龙水产饵料开发中心生产的森得牌海参开口料)。对照组按照上述饵料饲喂41 d，组2、组3和组4除了上述饲喂外，每隔5 d，还分别向池中泼洒光合细菌50 mL、100 mL和150 mL。试验期间不换水，试验用海水盐度为30~32，pH为7.5~8.0，24 h不间断充气增氧，溶解氧保持在5.0 mg · L^-1以上，试验期间水温在27~30℃之间。

1.3   试验指标测定

1.3.1   生长和成活

在试验结束后，每个池随机取糙海参1 000尾，置于干毛巾上吸干水分，用电子天平称其质量(W₁，精确至0.001 g)，计算每尾海参平均质量(W)。将每个池的所有海参按上述方法称取总质量(W₂)，除以每尾海参平均质量计算成活总数，再计算成活率(SR)。计算公式为：

1.3.2   消化酶

1) 粗酶液提取。在每个水泥池分别随机采集试验结束后20尾糙海参的肠道，用去离子水冲洗干净后用滤纸吸干，迅速称质量，在匀浆器中匀浆，并且稀释10倍制成匀浆液。冷冻离心(8 000 r · min^-1) 5 min，取其上清液，即酶粗提液，4 ℃保存待测，24 h内测定完毕。2) 消化酶的测定。采用福林-酚法测定蛋白酶活性。1个蛋白酶活性单位定义为：pH为7.0，底物酪蛋白质量浓度为20 mg · mL^-1 37 ℃条件下保温10 min，每毫克酶蛋白、每分钟产生1 μg酪氨酸的酶量。采用淀粉-碘显色法测定淀粉酶活性；1个淀粉酶活性单位定义为：pH为7.0，在37 ℃条件下保温30 min，1 mg酶蛋白中能完全水解10 mg淀粉时的酶量。采用305二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性，在37 ℃下，每分钟催化纤维素水解生成1 μg葡萄糖的酶量定为1个活力单位。采用G-250考马斯亮蓝染色法测定酶液蛋白浓度。酶的活力以比活力表示，即每毫克蛋白酶单位(U · mg^-1)^[15]。

1.3.3   水质

每隔10 d在每个水泥池取水样，水中的NH₃-N、亚硝态氮(NO₂^--N)、化学需氧量(COD)和总磷(TP)采用上海海争电子科技有限公司生产的DZ-A型水产养殖检测仪进行当场测定。

1.4   数据分析

采用Excel 2010对糙海参苗体体质量、成活率、消化酶活性和育苗水体水质因子进行样本频率的假设检验，以分析各组差异的显著性。采用SPSS 19.0软件的One-way ANOVA分析组间差异，并用Duncan′s进行均值多重比较，分析组间的差异显著性(P＜0.05)，试验数据用平均数±标准差(X±SD)表示。

2.   结果

2.1   不同光合细菌添加量对糙海参生长和成活的影响

经过41 d的试验，不同光合细菌添加量的水泥池中糙海参的生长和成活存在着一定的差异(表 1)。不添加光合细菌的组1中糙海参出苗苗体个体体质量和成活率均为最低，且显著低于添加光合细菌的试验组(P＜0.05)。随着光合细菌添加量的增加，糙海参出苗苗体体质量和成活率都呈现数值上的上升趋势，组3和组4的体质量和成活率差异均不显著(P＞0.05)，但这2组的体质量和成活率显著高于组2(P＜0.05)。

表  1  糙海参的体质量和成活率

Table  1.  Body weight and survival rate of H.scabra

组别group	体质量/mg body weight	成活率/% survival rate
1	5.92±0.03a	64.67±0.38a
2	6.30±0.02b	68.00±0.25b
3	6.39±0.01c	69.67±0.29c
4	6.40±0.01c	70.17±0.14c
注：同列数据上标字母不同者之间表示存在显著差异(P＜0.05) Note：Different letters in the same column indicate significant difference (P＜0.05).

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2.2   不同光合细菌添加量对糙海参肠道消化酶活性的影响

各试验组和对照组中糙海参消化道消化酶的活性见图 1。试验组的3种酶活性较对照组均有显著的增加(P＜0.05)。随着光合细菌添加量的增加，糙海参消化道蛋白酶活性逐渐增大，在低剂量的添加组(组2)中显著低于中高剂量添加量的试验组(组3和组4)(P＜0.05)，但组3和组4中消化酶活性无明显差异(P＞0.05)；在淀粉酶方面，试验组的酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，但随着光合细菌添加量的增加，各试验组淀粉酶活性差异不明显(P＞0.05)；纤维素酶活性和蛋白酶呈现相同的变化规律。

图  1  不同组中糙海参蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶活性

Figure  1.  Protease, amylase and cellulase activities of H.scabra in different groups

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2.3   不同光合细菌添加量对糙海参养殖水体水质的影响

各组的各项水质指标均随着光合细菌的添加出现不同程度的变化(图 2)。NH₃-N和NO₂^--N这2个指标在试验至第10天时，对照组和试验组含量基本一致，差异不显著(P＞0.05)，从第20天至试验结束，对照组的NH₃-N和NO₂^--N均显著高于试验组(P＜0.05)；光合细菌对于糙海参养殖水体的COD于试验进行至第30天时发挥作用，显著低于对照组(P＜0.05)；养殖水体中TP的变化很小，对照组和试验组差异不明显(P＞0.05)。

图  2  不同组中糙海参养殖水体水质变化

Figure  2.  Change of water quality in different groups

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3.   讨论

3.1   光合细菌对苗期糙海参生长和成活的影响

光合细菌含有较高的蛋白质，粗蛋白的质量分数高达65.45%，粗脂肪约7%，菌体的脂类成分中含有大量类胡萝卜素、泛醌(辅酶Q), 这些特性决定了光合细菌可以作为糙海参苗期优良的饵料^[12]。袁玉成等^[14]对刺参(Stichopus japonicus)幼参养殖池施用光合细菌等微生态制剂，显著提高了幼参的生长率和成活率；朱学芝等^[16]对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的研究得出，养殖池中定期添加一定量的光合细菌，不仅能够抑制有害菌的生长，还能使对虾肠道形成有益菌群，改善对虾的生长成活状况。从该试验结果看，在糙海参的育苗池中添加一定量的光合细菌可以提高参苗地成活率和生长速率，从泼洒光合细菌的量来看，组3的效果明显优于组2，说明加大细菌的泼洒剂量，不但可以为糙海参苗体提供更为丰富的饵料，还可能使光合细菌很快地成为养殖水体的优势菌种，这样不但控制了养殖水体环境的水质，还能在水体生态系统中抑制有害微生物的繁殖。同时，光合细菌还会很快在糙海参肠道内发展成有益菌群，与致病菌间就生存和繁殖的空间、时间、定居部位以及营养素等开展竞争，有效地抑制有害菌的繁殖。这样就大大提高了糙海参育苗期间的生长速率和成活率。当泼洒剂量进一步增大时(组4)，糙海参苗体的生长速率和成活率并没有进一步增大，说明按照每隔5 d泼洒100 mL光合细菌的施用方式已经可以使光合细菌的有效利用达到最大化。

3.2   光合细菌对苗期糙海参消化酶活性的影响

消化酶活力是表明动物对摄食食物吸收能力的重要指标，其高低反映了动物对食物中营养成分的消化能力，消化酶活性的变化可以反映出动物在不同环境下的机体消化吸收能力的生理反应^[15]。糙海参没有消化腺，但其肠道可以分泌多种消化酶^[17]，因此，取肠道组织为研究对象来进行消化酶活性的研究是可行的。从此试验结果来看，糙海参肠道中淀粉酶活性远远高于蛋白酶和纤维素酶的活性，这与其摄食底栖藻类和腐蚀碎屑的食性相一致^[18]。由于参苗的摄食，环境中的光合细菌可能会定植在糙海参的肠道中，饱和肠粘膜的吸附位点，致使有害病原细菌无法在肠道中定植，维持肠道内的生态平衡。添加光合细菌均能显著增加各种消化酶的活性，组3和组4的蛋白酶活性和纤维素酶活性均明显高于组1，而光合细菌添加量的多少则对淀粉酶活性的影响不大，说明环境中少量的光合细菌就可以大大增加淀粉酶的活性，而要大幅提高蛋白酶和纤维素酶的活性，则需要较大量的光合细菌，这一结果也与糙海参的食性相一致。有研究表明，海参肠道中存在大量的细菌^[11]，这提示了光合细菌可能会参与糙海参的食物消化，菌体所分泌的蛋白酶及其所提供的分解后的有机氮对于糙海参消化蛋白可能是个有力的弥补。此试验的养殖水体泼洒光合细菌可以不同程度提高消化酶活性，但究竟是细菌自身分泌的消化物质导致糙海参肠道消化酶提高还是由于摄入光合细菌而刺激糙海参机体本身产生更多的消化酶来消化吸收光合细菌尚不清楚，还有待进一步的研究。

3.3   光合细菌对苗期糙海参育苗水体主要污染物的净化效果

许多研究表明，光合细菌属于养殖水体中的有益微生物，它可以通过自身生命活动的作用，将养殖动物的残饵粪便等分解为无毒无害的CO₂、硝酸盐(NO₃^-)、磷酸盐(PO₄^3-)等，有效地降解有机污染物，是物质循环中十分重要的环节^[19-20]。在此试验第10天进行水质测定时，各试验组与对照组的NH₃-N和亚硝酸盐含量差异不显著(P＞0.05)，原因可能是由于各试验组每隔5 d泼洒一次光合细菌，而在第10天进行水质测定时，各组泼洒的光合细菌总量还相对较少，时间也很短，因此光合细菌的作用还未及时地显现出来。张明磊等^[21]在用光合细菌改善养殖水体水质的研究中发现，第8天左右出现拐点，这与该研究的结果相似。从第10天开始至试验结束，对照组的NH₃-N和亚硝酸盐含量一直呈现上升的趋势，但随着光合细菌的持续泼洒，NH₃-N和亚硝酸盐增加缓慢直至趋于稳定，且泼洒量较大的试验组的去除效果更为明显。根据朱学芝等^[16]的研究结果，随着光合细菌的泼洒，光合细菌逐渐成为养殖水体的优势菌群，对于有害物质的去除作用逐渐出现，但是泼洒量较大的光合细菌更容易在短时间内成为优势菌群，故泼洒量大的试验组优于其余试验组。光合细菌对于COD的降低作用主要在试验30 d后出现作用，对照组和试验组之间差异明显(P＜0.05)，而各试验组之间差异不明显(P＞0.05)，说明COD的降低需要时间的积累，且相对少量的光合细菌即可满足对于COD的降低需求。各试验组与对照组中的TP变化不显著(P＞0.05)，这与田功太等^[13]对刺参研究的结果相似，其中的原因可能是由于糙海参的育苗池内前期主要泼洒金藻、扁藻等藻类，后期泼洒商品饲料，水体中磷(P)元素的添加恰好满足了糙海参的自身生长需求，故水体中TP的含量趋于稳定，且一直处于适宜范围内。

综合试验研究结果并结合生产实际认为，光合细菌可以作为糙海参苗期优良的饵料，其菌体本身的消化酶或者是由于菌体的刺激而使参苗肠道分泌的大量消化酶可以增强参苗的消化机能，且光合细菌还能够有效地调节养殖水体的水质。因此，在糙海参育苗期间，根据苗池负载量、水源情况等因素灵活掌握光合细菌的泼洒，达到最佳的效果。