催乳素(prolactin，PRL)与生长激素(growth hormone，GH)及生长催乳素(somatolactin，SL)具有相似的结构，被归为同一个多肽激素家族，并认为由同一个基因进化而来^[1]。鱼类PRL与其渗透压调节有关，广盐性鱼类在淡水适应过程中，PRL可使氯细胞变小并抑制钠钾ATP酶的活性^[2]。部分硬骨鱼存在2种不同形式的催乳素, 长链PRL(188aa，简称PRLⅠ或tPRL188)和短链PRL(177aa，简称PRLⅡ或tPRL177)^[3]。SEALE等^[4]将莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)从海水转到淡水中时血浆渗透压降低，同时血浆和腺垂体前外侧部(RPD)中PRLⅠ和PRLⅡmRNA水平都有增加，而从淡水转到海水中时刚好相反。AYSON等^[5]和YADA等^[6]早有报道，把莫桑比克罗非鱼从海水转移到淡水中，2种催乳素的mRNA水平都增加，PRLⅠ基因增加尤为显著。另外，VELAN等^[7]将莫桑比克罗非鱼和尼罗罗非鱼(O.niloticus)从淡水转移到盐度为15的水体中，1周后2种罗非鱼的PRLⅠ基因表达量均降低，而且尼罗罗非鱼比莫桑比克罗非鱼反应更强烈。总之，在淡水中2种PRL均具有防止钠离子(Na⁺)和氯离子(Cl^-)流失，维持鱼体渗透压平衡的作用^[8]。然而AUPERIN等^[9]研究表明，在适应咸水的过程中注射PRLⅠ的尼罗罗非鱼血浆Na⁺和Cl^-显著升高，注射PRLⅡ的罗非鱼变化不显著。因此该研究中选择PRLⅠ基因作为目的基因。

罗非鱼隶属于鲈形目、丽鱼科。罗非鱼为广盐性鱼类，可以在半咸水中生长和繁殖，有些品种甚至可以在盐度较高的水体中生长和繁殖^[10-11]。2001年中国水产科学研究院珠江水产研究所首次从国外引进了橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼(O.hornorum)，并对这2种罗非鱼进行了连续多代的选育，耐盐及生长试验表明，这2种罗非鱼耐盐性较强，经选育后其生长性能较好，遗传相对稳定^[12-13]。橙色莫桑比克罗非鱼(♀)与荷那龙罗非鱼(♂)杂交，产生的F1代雄性率高，养殖性能较好，具有推广养殖价值^[14]。文章选择橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代为研究材料，研究PRLⅠ基因在4种罗非鱼中的组织分布规律以及盐胁迫下该基因的表达情况，从分子水平探索杂交子代与亲代之间的耐盐差异，为在分子水平上开展耐盐罗非鱼品种选育提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   试验鱼

试验鱼取自珠江水产研究所高要水产种质工程中心，橙色莫桑比克罗非鱼体质量43.1~68.2 g，体长10.8~12.5 cm，荷那龙罗非鱼体质量53.2~76.4 g，体长11.1~12.7 cm，正交鱼(橙色莫桑比克罗非鱼♀×荷那龙罗非鱼♂)体质量17.4~37.4 g，体长8.6~10.0 cm，反交鱼(荷那龙罗非鱼♀×橙色莫桑比克罗非鱼♂)体质量21.0~42.6 g，体长8.9~10.4 cm，试验前暂养于室外淡水网箱中。

1.1.2   试剂

RNA提取试剂盒购自百泰克生物技术有限公司；PrimeScript^TMⅡ试剂盒及pMD19-T Vector、DNA Marker均购自TaKaRa公司；PCR反应体系所用Buffer、dNTP、Taq酶等均购自上海申能博彩生物科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix购自Life Technologies公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2   方法

1.2.1   总RNA的提取

以4种罗非鱼(各1尾)的垂体为材料，提取总RNA，具体步骤参照RNA提取试剂盒操作手册。用核酸蛋白检测仪检测RNA的浓度与纯度。

1.2.2   cDNA的合成

cDNA的合成按照PrimeScript^TMⅡ试剂盒操作说明进行，具体操作为在0.2 mL的PCR管中加入dNTP Mixture(10 mmol · L^-1 each)1 μL，Oligo dT Primer(50 μmol · L^-1) 1 μL，RNA 8 μL，混匀后65 ℃水浴反应5 min，冰上迅速冷却，然后加入下列试剂，5×PrimeScript buffer 4 μL，RNase Free H₂O 4.5 μL，RNase Inhibitor(40 U · μL^-1)0.5 μL，PrimeScriptⅡRTase 1 μL，在PCR仪上42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃保温，反应结束后置于-20 ℃保存。

1.2.3   PCR扩增与测序

参考尼罗罗非鱼mRNA全序列(GenBank登录号XM_ 003446405)设计引物PRL-F、PRL-R(表 1)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为10×PCR buffer Ⅱ 5 μL，dNTP Mixture (10 mmol · L^-1) 1 μL，Primer-F 1 μL，Primer-R 1 μL，Taq 0.5 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free H₂O 39.5 μL，总体积50 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃保温10 min；4 ℃保存。反应结束后用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。用试剂盒回收产物，然后克隆到pMD19-T载体上，每种罗非鱼随机挑10个单克隆送上海英骏生物技术有限公司进行测序。

表  1  PRLⅠ基因克隆和qPCR引物序列

Table  1  Primers of PRLⅠgenes used for cloning and quantity PCR

引物名称primer name	序列(5′→3′) primer sequence(5′→3′)	扩增长度/bp amplification length
PRL-F	GAGAAGAAGCAACAGCTAAC	798
PRL-R	TCCTTATCCTCGTGTTCCAA
PRL-7F	TCACTTCACTGCCCTACCG	169
PRL-7R	CAGCACATCTCTGGTTGCAT

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1.2.4   PRLⅠ基因的组织表达

取零盐度下橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼(各3尾)的脑、垂体、肠、鳃、性腺、肝、脾、肾、心脏、胃、皮肤和肌肉共12个组织进行表达丰度分析。PRLⅠ的qPCR引物为PRL-7F、PRL-7R(表 1)，扩增长度为169 bp。qPCR荧光染料使用SYBR Green PCR Master Mix(Life Technologies)试剂盒，根据操作说明进行试验，反应在ABI 7300荧光定量PCR仪上进行，反应总体积为20 μL，内含cDNA模板1μL，引物各0.4 μL(引物浓度为10 μmol · L^-1)，反应条件为50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共40个循环；Tm曲线。3次重复试验以减少误差。

1.2.5   盐胁迫下PRLⅠ基因的表达分析

盐胁迫试验在6个100 L的循环水族箱中进行，试验组与对照组各设3个平行组，每箱试验鱼8尾，持续充气保证水体溶氧充足，水温控制在(30.2±1.2)℃，pH为7.16±0.21，每天投喂罗非鱼专用浮性颗粒饲料2次，投喂量合计约为鱼体总质量的3%。盐胁迫试验取样时间为第0、第6、第24、第48、第54和第96小时，试验组第0小时盐度为0，前48 h盐度为22，之后盐度增至35，在第54和第96小时取样；对照组盐度始终为0，与试验组同步取样。通过加入用优质珊瑚礁盐配好的咸水调整每个水族箱的盐度，每次调整盐度均在1 min内达到所需要的盐度，水体盐度用RHS-10ATC手持盐度计测定。

1.2.6   数据分析

利用网上资源http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast的blastN和blastX工具进行同源基因搜索；用DNAMAN 7软件寻找开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)推断氨基酸序列；用ClustalX 2.0软件进行PRLⅠ基因核苷酸和氨基酸序列比对；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/在线预测可能的信号肽及信号肽切割位点的位置。在保证扩增效率的前提下，正常条件下基因的组织分布表达分析采用2^-ΔCt法^[15-16]，ΔC_t=C_t(target)- C_t(reference)；盐胁迫下基因在垂体中的表达分析采用2^-ΔΔCt法^[16]，ΔΔC_t=ΔC_t(test)-ΔC_t(control)，其中ΔC_t(test)=C_{t(test, target)}-C_{t(test, reference)}，ΔC_t(control)=C_{t(control, target)}-C_{t(control, reference)}。应用SPSS 20统计软件单因素方差分析对数据进行统计学分析。

2.   结果

2.1   PRLⅠ基因克隆及序列特征

将4种罗非鱼垂体的总RNA反转录后，进行PCR扩增，得到长度约为800 bp的单一片段，与预期片段大小一致，未发现非特异性扩增带。分别回收目的片段，克隆测序后经BLAST分析确定是PRLⅠ基因cds完整序列。4种罗非鱼的PRLⅠ基因序列长度均为798 bp(图 1)，包括ORF区639 bp(40~678)，5′非翻译区39 bp，以及3′非翻译区120 bp。以基因序列的第一个ATG为转录起始位点，将基因序列翻译成氨基酸序列，在第一个终止密码子TGA处终止翻译，结果表明4种罗非鱼PRLⅠcDNA均编码212个氨基酸，分子量在23.5 kDa左右，理论等电点均为9.13。亮氨酸(Leu)和丝氨酸(Ser)含量比较高，均占总氨基酸12%以上，前24个氨基酸肽段为信号肽，信号肽酶的可能切割位点位于第24和25位氨基酸之间。

图  1  橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代PRLⅠ基因cDNA序列比对

M. 橙色莫桑比克罗非鱼(KC702508)；H. 荷那龙罗非鱼(KC702509)；HMa. 反交子代同源片段a(KC702510)；HMb. 反交子代同源片段b(KC702511)；MHa. 正交子代同源片段a(KC702512)；MHb. 正交子代同源片段b(KC702513)；图 2同此

Fig. 1  Sequences of PRLⅠcDNA from O.mossambicus, O.hornorum and their hybrids

M. O.mossambicus (KC702508);H. O.hornorum (KC702509);HMa. homologous fragment a of O.hornorum♀×O.mossambicus♂(KC702510);HMb. homologous fragment b of O.hornorum♀×O.mossambicus♂ (KC702511);MHa. homologous fragment a of O.mossambicus♀×O.hornorum♂(KC702512);MHb. homologous fragment b of O.mossambicus♀×O.hornorum♂(KC702513);the same case in Fig. 2.

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4种罗非鱼PRLⅠ基因的同源性比对表明，正、反交子代的同源片段a(MHa：GenBank中序列号KC702512；HMa：GenBank中序列号KC702510)与橙色莫桑比克罗非鱼(M：GenBank中序列号KC702508)的核苷酸序列完全一致；正交子代同源片段b(MHb：GenBank中序列号KC702513)与荷那龙罗非鱼(H：GenBank中序列号KC702509)的核苷酸序列完全一致；两亲本核苷酸序列相差5个碱基，氨基酸序列仅在31号位点存在一个氨基酸残基差异；而反交子代同源片段b(HMb：GenBank中序列号KC702511)同荷那龙罗非鱼和橙色莫桑比克罗非鱼相比，核苷酸序列分别存在6个和5个碱基差异，其氨基酸序列与荷那龙罗非鱼相比仅在157号位点有1个氨基酸残基差异(图 1和图 2)。

图  2  橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代PRLⅠcDNA片段序列推导的氨基酸序列比较

Fig. 2  Comparative analysis of amino acid sequences deduced from PRLⅠcDNA sequences from Omossambicus, O.hornorum and their hybrids

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2.2   零盐度下PRLⅠ基因的组织表达

应用qPCR技术检测罗非鱼的18S rRNA、GAPDH、β-actin、EF1-α 4个内参基因在不同组织中的表达情况，筛选出最佳内参为β-actin基因，然后以β-actin基因为内参比较了橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼PRLⅠ基因不同组织或器官中的表达情况。2种罗非鱼垂体中PRLⅠ基因的表达量均高于其他组织或器官，且差异极显著(P＜0.001)，橙色莫桑比克罗非鱼垂体中PRLⅠ基因的表达量显著高于荷那龙罗非鱼(P＜0.05)。PRLⅠ基因在其他组织或器官中的表达量较低，且差异不显著(P>0.05)(图 3)。

图  3  莫桑比克与荷那龙罗非鱼不同组织或器官中PRLⅠ基因的组织特异性表达

字母不同表示有显著性差异(P＜0.05)

Fig. 3  Tissue-specific expression of PRLⅠin different tissues and organs of O.mossambicus and O.hornorum

Different letters above the bars indicate significant difference from one another (P < 0.05).

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2.3   盐胁迫下PRLⅠ基因的表达分析

盐胁迫试验筛选出的最佳内参同样为β-actin基因，4种罗非鱼受到盐胁迫后垂体中PRLⅠ基因的表达量显著降低，2个亲本转移至盐度22的水体后6 h便与0 h差异极显著(P＜0.001)，而2个杂交种在24 h以后才与0 h有显著性差异(P＜0.001)。4种罗非鱼垂体中PRLⅠ基因表达量在受到盐胁迫后均有下降的趋势，随着时间增加PRLⅠ基因表达量均会趋于稳定(图 4)。

图  4  盐胁迫试验后4种罗非鱼垂体中PRLⅠ基因在不同时间点(0 h为淡水，前48 h盐度为22，48 h以后盐度调整为35)的相对表达量

*，* *，* * *. 与0 h比差异显著，显著性水平分别为P＜0.05，0.01和0.001

Fig. 4  Relative expression differences of PRLⅠgenes in pituitary from four species of tilapia after being transferred from fresh water to brackish water (BW; 22) for the first 48 h and then from BW to sea water (SW; 35) after 48 h

*, * *, * * *. significantly different from initial level (time 0) at P < 0.05, 0.01 and 0.001, respectively

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3.   讨论

3.1   PRLⅠ基因及氨基酸序列特征分析

该研究首次克隆了橙色莫桑比克罗非鱼(GenBank中序列号KC702508)、荷那龙罗非鱼(GenBank中序列号KC702509)及其正交子代(GenBank中序列号KC702512和KC702513)与反交子代(GenBank中序列号KC702510和KC702511)的PRLⅠ基因。序列分析表明，4种罗非鱼的开放阅读框编码的212的氨基酸中，前24个氨基酸为信号肽，后188个氨基酸残基构成成熟肽，这与其他罗非鱼PRLⅠ成熟蛋白包含188个氨基酸一致^[3]。氨基酸序列比对表明，橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼氨基酸序列仅在31号位点存在一个氨基酸残基差异，正交子代和反交子代各有一个同源片段(MHa和HMa)与橙色莫桑比克罗非鱼完全一致，在31号位点同为Leu，而正交子代的另一同源片段(MHb)与荷那龙罗非鱼完全一致，在31号位点均为Phe，反交子代的另一同源片段(HMb)在此处也为Phe，由此推测在杂交子代中来源于橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的PRLⅠ基因都表达。

3.2   PRLⅠ的组织分布及盐度胁迫下的表达特征

淡水中橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼PRLⅠ基因的表达具有组织特异性，在垂体中的表达量显著高于其他组织。这与王杰等^[8]的研究结果类似，其研究表明建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)PRL基因在脑垂体有清晰的PCR扩增条带，其余各组织均未见清晰的扩增条带，荧光定量PCR检测出脑垂体中的表达量远远高于其他组织；BREVES等^[17]将莫桑比克罗非鱼从海水转移到淡水中后，罗非鱼血浆和垂体PRLⅠ基因与PRLⅡ基因的表达量均上升，而肾中PRLⅠ与PRLⅡmRNA水平均无变化，由此推测垂体是鱼类PRL基因的主要表达场所。杨淞等^[12]研究表明，橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的96 h半致死盐度分别为22.29和21.56，橙色莫桑比克罗非鱼的耐盐能力高于荷那龙罗非鱼。鱼类催乳素与其渗透压调节有关，广盐性鱼类在淡水适应过程中，PRL可使氯细胞变小并抑制钠钾ATP酶的活性^[2]。此试验结果表明橙色莫桑比克罗非鱼垂体中PRLⅠ在淡水中的本底表达水平显著高于荷那龙罗非鱼，这可能与橙色莫桑比克罗非鱼的高耐盐性有关。

笔者的研究结果表明，4种罗非鱼受到盐胁迫后垂体中PRLⅠ基因的表达量显著降低。SEALE等^[18]研究也表明海水适应的莫桑比克罗非鱼垂体中PRL基因的表达量在48 h后显著降低，与该研究结果类似；而将罗非鱼从海水转入淡水中则PRL基因的表达量显著上升。由以上结果推测，PRLⅠ基因的表达水平与罗非鱼对低盐度水体适应能力密切相关，其参与鱼体渗透压的调节，在其他鱼类中也有类似规律。LEE等^[19]将河豚(Takifugu rubripes)从盐度35的海水移至8.75的海水，其脑垂体中PRL的表达量显著升高；BURDEN^[20]发现，切除垂体的鲔科小鱼不能够在淡水中生存，表明垂体中的某种物质与其淡水适应性有关；PICKFORD和PHIMPS^[21]用PRL处理切除了垂体的鳅科小鱼，发现它们可以在淡水中生存。

盐胁迫后2个杂交子代垂体中PRLⅠ表达水平下降要迟于两亲本，表明2个杂交子代相对于两亲本而言对盐度的刺激更不敏感，由此推测2个杂交种的耐盐能力可能更强。笔者对橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代进行的耐盐试验也表明杂交子代的耐盐性高于其亲本。

笔者从DNA和mRNA水平对橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其正反交子代等4种罗非鱼PRLⅠ基因结构和表达水平进行了研究，这些结果有利于从分子水平上阐述罗非鱼渗透调控的复杂机制，从而为选育耐盐性较强的、适合海水环境养殖的罗非鱼新品种提供理论依据。