人工湿地是利用基质-微生物-植物复合生态系统的物理、化学和生物的三重协调作用来去除废水中悬浮物、有机物、氮(N)、磷(P)和重金属的水处理系统^[1-2]。进入21世纪后，为克服传统工厂化循环水养殖系统(水处理技术以物理过滤结合生物为主)建设成本高、耗能大、运行成本高、水质不稳定、不能完全做到零污染等缺点，许多学者开始探索将人工湿地等生态型水处理设施引入工厂化循环水养殖系统的可行性^[3-6]。至今，基于人工湿地的循环水养殖系统尚属试验阶段，大部分研究都是针对水处理技术，即人工湿地的构建、优化、水处理效率及其强化技术等^{[1, 6]}，而针对系统中养殖对象的研究很少(如养殖品种、最适养殖密度、养殖容量等)。此外，传统工厂化循环水系统长期运行后，其水质变化规律与人工湿地循环水系统并不完全一致^[7]，开展湿地系统的相关研究依然很有必要。

鲫(Carassius cuvieri)，在分类上属鲤科，鲤亚科，鲫属，是中国常见的经济鱼类，其营养价值高、味道鲜美，在全国各地均有养殖。池塘单养情况下，鲫成鱼的养殖密度一般在0.5~1 kg·m^-3最为适宜^[8]。另有研究表明鲫长时间处于14 kg·m^-3密度情况下会表现出脾脏系数下降、血清抗坏血酸浓度降低的胁迫反应^[9]。该研究设置了2 kg·m^-3、4 kg·m^-3、8 kg·m^-3和16 kg·m^-3共4种养殖密度，试验期间定期测量系统的水质指标，评估温室人工湿地循环水系统中密度对鲫鱼生长、脏器系数、血清生理免疫指标及其对特定病原嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)抵抗力的影响, 以期为科学合理地应用人工湿地循环水养殖系统提供基础资料。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

鲫由中国水产科学研究院池塘生态工程研究中心(上海松江)提供，试验前在水泥池中(容积为10 m³)以2 kg·m^-3的密度驯养2周。试验用配合饲料(质量分数分别为粗蛋白33%、粗脂肪11%、粗灰分12%、钙2%、磷2%)由通威公司提供。攻毒试验用嗜水气单胞菌由华东师范大学提供。

1.2   系统设计

试验在一个封闭人工湿地循环水系统内进行，系统建于钢化玻璃的温室大棚中。系统由两级潜流湿地和8个并联的养殖槽(各槽直接与湿地相连，相互之间不贯通)组成(图 1)。人工湿地长×宽×高规格均为120 cm×60 cm×58 cm，以陶粒为填料，粒径2~5 mm，表面种植美人蕉，种植密度约12株·m^-2。每个养殖槽长×宽×高规格均为120 cm×60 cm×60 cm，槽底中央有一排水口(直径5 cm)，内有一插管，高55 cm，槽内水体可通过重力从插管上沿溢出，经排水管流入湿地，净化后又经水泵抽至设在养殖槽上沿的进水管内，然后回流至养殖槽形成循环。养殖槽内水深始终维持在55 cm，日循环2次。

图  1  试验系统布置图

Figure  1.  Layout of experimental system

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1.3   试验管理及采样

量取鲫全长和体质量，然后分别以2 kg·m^-3、4 kg·m^-3、8 kg·m^-3和16 kg·m^-3的密度养殖于系统中，记为A^#、B^#、C^#和D^#，每个密度组2个槽。每日9 : 00和15 : 00投喂配合饲料，日投喂量为鱼总质量的1%。每2周监测系统水温、溶解氧(DO)、pH、氨氮(NH₄⁺-N)、亚硝酸盐(NO₂^--N)、总氮(TN)、总磷(TP)和化学需氧量(COD)。试验结束后再次测量全长和体质量，之后每槽选取6尾鱼进行尾静脉采血，解剖，分离肝胰脏、脾脏和肾脏组织。所采血液经4 ℃过夜，5 000 r·min^-1离心10 min，分离血清。

1.4   指标测定

生长指标测定。分别使用精度为1 mm的直尺和0.1 g的电子天平测量全部养殖鲫试验前后的全长和体质量。

脏器系数测定。肝胰脏、脾脏和肾脏脏器质量与体质量之比即为各自的脏器系数。体质量测量完成的鲫，先经尾静脉采血，之后摘取肝胰脏、脾脏和肾脏，用生理盐水稍加冲洗，吸水纸吸干表面水分，并立即在电子秤上称质量，记录数据。

血清生理和免疫指标的测定。血清溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性和总蛋白、丙二醛(MDA)均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。其中，血清LSZ活性测定采用比浊发，SOD采样羟胺法，ACP和AKP采用磷酸苯二钠比色法，总蛋白质量浓度测定采用BCA(Bicinchoninic acid)法，MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法，测试步骤参照试剂盒说明书执行。

攻毒试验。于养殖结束后采用嗜水气单胞菌(10⁸细胞·mL^-1)对各密度组试验鱼进行攻毒。随机从每个密度组选取15尾鱼，采用一次性注射器经胸鳍基部向腹腔注射1 mL菌悬液，饲养1周，每天统计成活鱼数，按如下公式计算攻毒后的死亡率：死亡率(%)=[(试验初鱼体总数－成活鱼数)/试验初鱼体总数]×100。

1.5   数据处理

试验数据用平均值±标准误(X ±SE)表示。显著性检验在SPSS 19.0中进行，采用Student-Newman-Keuls法进行多重比较，以P < 0.05作为差异显著性标准。

2.   结果

2.1   系统运行情况

试验于2013年8月8日开始，至2013年10月15日结束，共68 d。养殖期间，水温25~19 ℃，pH 6.3~7.4，ρ(DO) 5~8 mg·L^-1，ρ(NH₄⁺-N) 0.075~0.328 mg·L^-1，ρ(NO₂^--N)0.004~0.129 mg·L^-1，ρ(TN) 3.1~5.4 mg·L^-1，ρ(TP) 1.25~2.1 mg·L^-1，ρ(COD) 2~14 mg·L^-1。根据以上数据，系统运行稳定，水质符合鲫正常生长生活需求。

2.2   养殖密度对生长的影响

各密度组初始体质量、全长均没有显著性差异(P>0.05)(表 1)。养殖68 d后，A^#组鲫平均体质量从137.1 g增长到194.1 g，增长率为41.6%，要高于其他3个密度组。但方差分析显示，无论是体质量还是全长，试验结束时各组间均不存在显著性差异(P>0.05)。通过观察发现，养殖后期D^#组鲫无论是活动力还是反应速度都明显要比A^#和B^#组弱。

表  1  不同养殖密度下鲫的生长性能

Table  1.  Growth of C.cuvieri at various stocking densities

组别 group	试验初始时  before experiment				试验结束时  after experiment			平均增长率/%  average growth rate
	养殖密度/kg·m-3 stocking densities	平均体质量/g average weight	平均全长/cm average total length		平均体质量/g average weight	平均全长/cm average total length		体质量/g body weight	全长/cm total length
A#	2	137.1±7.9	19.0±1.0		194.1±15.7	21.2±1.4		41.6	11.6
B#	4	134.8±6.6	19.2±0.8		172.1±18.7	20.8±1.3		27.7	8.3
C#	8	133.1±8.3	19.8±0.6		171.8±14.4	21.0±1.5		29.1	6.1
D#	16	137.8±6.5	19.5±0.6		178.7±13.3	21.4±1.5		29.7	9.7

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2.3   养殖密度对脏器系数的影响

经过68 d养殖，4种不同密度养殖条件下鲫脾脏、肾脏、肝胰脏脏器系数并无明显的变化规律，脾脏脏器系数为0.26%~0.32%，肾脏为0.28%~0.33%，肝胰脏为3.48%~4.79%(图 2)。Student-Newman-Keuls方差分析表明各组间各组织脏器系数均不存在显著性差异(P>0.05)。

图  2  不同密度养殖条件下鲫各组织脏器系数

Figure  2.  Organ coefficients of C.cuvieri at various stocking densities

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2.4   养殖密度对血清生理、免疫指标的影响

人工湿地循环水系统中养殖密度对鲫血清MDA质量摩尔浓度和ACP、AKP、LSZ活性影响显著(图 3)。随着养殖密度增加，血清中MDA质量摩尔浓度升高，D^#组鲫要显著高于A^#和B^#组(P < 0.05)，C^#和A^#组相比也显著升高(P < 0.05)。血清ACP、AKP和LSZ活力随养殖密度的升高而降低，D^#组ACP活力显著低于A^#、B^#和C^#组(P < 0.05)，AKP活力也显著低于A^#组(P < 0.05)；C^#和D^#组LSZ活力显著降低于A^#组(P < 0.05)。而在4种养殖密度条件下，鲫血清SOD活力和TP质量浓度虽随密度升高有不同程度的增加，但各组间不存在显著性差异(P>0.05)。

图  3  不同养殖密度对鲫血清生理、免疫指标的影响

图中不同的小写字母代表不同处理间有显著性差异(P < 0.05)

Figure  3.  Effects of various stocking densities on serum physiological and immunological parameters of C.cuvieri

Different lowercase letters represent significant difference among different treatments (P < 0.05).

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2.5   养殖密度对鲫抗病力的影响

经腹腔感染嗜水气单胞菌，饲养1周后各组鲫的死亡率见图 4。A^#、B^#、C^#和D^#组鲫死亡率分别从感染1 d后的6.7%、6.7%、6.7%和20.0%上升至感染1周后的53.3%、53.3%、60.0%和66.7%，并基本保持稳定。D^#组鲫无论是死亡速度还是死亡率都要高于A^#、B^#和C^#组，表明养殖密度对鲫抵抗嗜水气单胞菌的能力造成了一定的负面影响。

图  4  各养殖密度组鲫注射嗜水气单胞菌后的死亡率

Figure  4.  Mortality rate of C.cuvieri post-injected with A.hydrophila at various stocking densities

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3.   讨论

3.1   养殖密度对鲫生长、生理及免疫的影响

众所周知，养殖密度过高会对鱼类的生长、生理及免疫造成不利影响。鱼类生长环境(如DO、NH₄⁺-N等水质指标)会因鱼体生物量和投饵总量的增加而恶化；鱼类自身也会因生存空间的压缩被迫做出调整，这些调整影响到鱼类的摄食、行为和社会性，最终影响到机体代谢的各个方面^[10-11]。然而，对于某些集群性鱼类而言，养殖密度也并非越低越好。HONER等^[12]报道了罗非鱼(Sarotherodon galilaeus)在密度为7.4 kg·m^-3的条件下要比在3.74 kg·m^-3条件下生长速度快。研究也表明某些鱼类只有在低密度条件下才能生长良好，密度与生长率呈现负相关，如青石斑鱼(Epinephelus awoara)^[11]、大口黑鲈(Micropterus salmoides)^[13]等。

该研究发现，温室人工湿地循环水系统中，在2 kg·m^-3、4 kg·m^-3、8 kg·m^-3和16 kg·m^-3共4种养殖密度情况下，鲫的生长和脾、肾、肝胰脏器系数并未受到显著影响(P>0.05)。但养殖密度为2 kg·m^-3时鲫的平均增长率要比密度16 kg·m^-3时高(虽然不显著)，这表明低密度条件有利于鲫生长。16 kg·m^-3的养殖密度并未达到显著影响鲫生长和脏器系数的阈值，但养殖密度超过16 kg·m^-3时，密度可能会对鲫生长和脏器系数造成显著的不利影响。然而，若以血清生理免疫指标作为衡量标准，16 kg·m^-3的养殖密度则对鲫鱼造成显著影响。与2 kg·m^-3密度组鲫相比，16 kg·m^-3密度组鲫血清MDA含量显著升高(P < 0.05)，ACP、AKP和LSZ活性显著降低(P < 0.05)。此外，攻毒试验也表明16 kg·m^-3的养殖密度降低了鲫对嗜水气单胞菌的抵抗力。这些结果表明，16 kg·m^-3的密度条件虽未能显著影响鲫生长，但会对鲫免疫力造成不利影响。

关于密度影响鲫生长和免疫的研究也有报道。在池塘养殖条件下，夏华等^[14]研究2种密度(0.1 kg·m^-3和0.6 kg·m^-3)条件下鲫的生长情况，指出养殖密度过高不利于鲫的后期生长，并推测这可能是由于高密度(0.6 kg·m^-3)情况下，鲫的活动空间受到限制，机体需要消耗更多能量用于抵抗密度胁迫，最终导致机体不能有效地利用饵料营养而造成。在试验室水族箱养殖条件下，贺治^[9]对鲫拥挤胁迫30 d后发现，高(30 kg·m^-3)和中(14 kg ·m^-3)密度组鲫肝胰脏脏器系数显著高于低密度组(7.4 kg·m^-3)，而脾脏脏器系数显著低于低密度组。这与笔者研究中16 kg·m^-3的养殖密度并未对鲫脏器系数造成显著影响的结果不同，推测这可能跟湿地循环水系统中水质条件优越、有效弱化了密度的胁迫效应有关。王文博等^[15]研究也发现，15 kg·m^-3和80 kg·m^-3密度条件下养殖30 d的鲫，其血清皮质醇浓度明显升高，对嗜水气单胞菌抵抗力明显下降，这与该研究结果一致。以上研究结果均表明，16 kg·m^-3的养殖密度已经达到引起鲫应激反应的密度阈值，会对鲫的生理状况产生不利影响。

3.2   基于人工湿地的循环水养殖系统的应用

人工湿地是综合了物理、化学、生物多重净化作用的水处理设施，大量研究表明其在处理水产养殖尾水方面具有良好的效果^[16-19]。陶玲等^[17]利用2组并联的水平潜流人工湿地(栽种植物为美人蕉、莺尾和营蒲)处理冬季池塘养殖废水，结果表明，在水力负荷0.22 m³·(m²·d)^-1条件下，TN、TP、COD和总悬浮颗粒物(TSS)的去除率分别达到35.0%、38.2%、34.7%和91.6%。当前水产养殖中，人工湿地多应用于池塘循环水养殖模式的构建中，将其应用于室内工厂化养殖的研究还不多见。

与传统的静态池塘养殖相比，人工湿地循环水养殖系统能够更为有效地控制系统中的养殖水环境，有助于提高鱼类养殖密度，加快鱼类生长，甚至改善鱼类品质。李晓莉等^[20]做了湿地循环水系统(处理组)与传统池塘养殖(对照组)对异育银鲫(C.auratus gibelio)生长、机体组成及血液生化指标影响的对比试验，结果表明，养殖165 d后处理组鲫特定生长率和成活率明显提高(P < 0.05)，肌肉水分和粗脂肪质量分数显著降低(P < 0.05)，粗蛋白质量分数显著升高(P < 0.05)，表明生态型湿地循环水养殖模式对鲫的生长和品质有一定的改善作用，这可能与人工湿地对鱼类生存环境的有效改善有关。

跟传统工厂化养殖系统一样，基于人工湿地的室内循环水养殖系统能够大幅度提高鱼类的养殖密度。然而，与传统工厂化养殖系统相比，室内湿地循环水系统是否在提高养殖对象福利水平、肌肉品质和疾病控制方面更具优势则有待进一步研究。但可以肯定湿地循环水系统较传统工厂化养殖更为节能、更易于管理，且其生态系统更为复杂、系统内的水质也更稳定^{[1, 21]}。林玉良^[1]针对传统工厂化养殖存在的问题，将人工湿地与室内集约化养殖有机结合，构建了一个完整的室内生态型循环水养殖系统，此系统在6.6 m³·(m²·d)^-1高水力负荷条件下，对废水中NH₄⁺-N、NO₃^--N和NO₂^--N的去除率分别为46.12%、38.03%和71.84%，养殖对象[杂交鲟，达氏鳇(Huso dauricus♀)×史氏鲟(Acipenser schrenckii♂)]成活率为93.3%，饵料系数为1.30，养殖过程中未发生疾病。研究还指出，室内湿地循环水系统水质稳定、管理方便，具有一定推广应用前景，这与笔者研究结果相符。笔者研究中68 d的养殖试验期间系统运行稳定，水质符合鲫正常生长生活需求。

4.   结论

研究了2 kg·m^-3、4 kg·m^-3、8 kg·m^-3和16 kg·m^-3共4种养殖密度对温室人工湿地循环水系统中鲫的生长、生理及免疫的影响，结果表明，如果以生长为主要考量指标，鲫的养殖密度可提升至16 kg·m^-3，甚至更高。但同时数据也表明如此高的养殖密度会对鲫免疫力造成负面影响，增加了鱼病爆发的风险。