斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)隶属于鲈形目、鲈亚目、鳍科、石斑鱼亚科、石斑鱼属，为广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域的暖水性礁栖鱼类，具有很高的经济价值^[1-2]。近年来，过度捕捞等人为因素导致斜带石斑鱼资源遭到严重破坏，该物种被国际自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN)列为近危(near threaten，NT)^[3]。资源衰退加剧与市场需求旺盛的矛盾促使斜带石斑鱼养殖业快速发展，迄今已成为中国南方沿海重要的海水养殖种类^[4-5]。但人工养殖往往会导致物种遗传多样性的下降，造成养殖种类繁育后代生存能力与适应能力的下降、优良经济性状的丧失，最终导致种质衰退^[6-8]。为使斜带石斑鱼的资源得到更好的种质保护和合理开发利用，避免种质衰退，迫切需要对其遗传背景进行分析，弄清斜带石斑鱼种群的遗传多样性和亲缘关系，建立起种质标准和繁育保护体系^[9]。目前关于石斑鱼的研究多集中在生物学、繁殖技术、养殖方式、功能基因等方面。关于斜带石斑鱼的遗传多样性、种类鉴定和遗传分化等方面也有报道，如ANTORO等^[10]对泰国及印尼的斜带石斑鱼野生群体开展了种群遗传差异的研究；蒙子宁等^[11-12]对斜带石斑鱼和赤点石斑鱼(E.akaara)进行了RAPD(random amplified polymorphic DNA)和线粒体细胞色素b(Cyt b)基因序列变异分析，还对斜带石斑鱼单一养殖群体亲本和子代遗传变异进行了RAPD分析；骆剑等^[13]对中国南海斜带石斑鱼野生群体与人工繁殖群体进行了微卫星分析等。但还未见关于多个养殖群体的遗传差异和遗传多样性比较的报道。

RAPD又称随机扩增多态DNA技术，是由WILLIAMS等^[14]及WELSH和MCCLELLAND^[15]等人于1990年同时创立的，因RAPD技术具有简单快速、灵敏度高、通用性好等优点，被广泛应用于物种的鉴定、种群结构分析以及遗传多样性研究等领域。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有母性遗传、进化速度快、多态性强等特点，已成为鱼类进化生物学和群体遗传学研究的重要遗传标记^[16-17]。同时线粒体Cyt b基因是线粒体DNA上的蛋白质编码基因，其进化速度适中，适合种群水平差异的检测，是探讨种间和种内遗传分化程度的良好标记^[18]。文章采用RAPD和线粒体Cyt b基因序列分析2种技术针对广东沿海斜带石斑鱼的3个养殖群体(惠州、深圳、湛江)进行遗传差异分析，目的是从DNA水平上揭示其遗传背景，了解人工养殖对遗传多样性的作用和影响，从而为斜带石斑鱼的资源保护和利用、人工繁殖与养殖、遗传改良与育种等提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   样品采集与DNA提取

斜带石斑鱼3个群体样品分别取自广东3个养殖基地石斑鱼繁育群体的子一代(惠州澳头、简称HZ，n=26；深圳南澳、简称SZ，n=15；湛江东海岛、简称ZJ，n=34；n为样本数)，这些养殖群体的繁育群体是由从当地海域捕获的野生个体组成。值得一提的是，由于斜带石斑鱼野生资源衰退，这些繁育群体的数量非常有限。剪取鱼体尾部少量组织放入-180 ℃液氮罐中保存，运回实验室后转入超低温冰箱(-80 ℃)备用。基因组DNA的提取方法参照SAMBROO等^[19]的方法进行，略调整。具体为取鱼体尾部组织约50 mg，置于1.5 mL Eppendorf管中，用STE缓冲液漂洗2次；加500 μL STE缓冲液，用干净的剪刀剪碎组织，混匀后加入10% SDS溶液50 μL和蛋白酶K(20 mg·mL^-1)5 μL，56 ℃消化4 h；用等体积的苯酚(Tris饱和，pH=8.0)，V(苯酚) : V(氯仿) : V(异戊醇)=25 : 24 : 1抽提2次(混合5 min，离心3 min，取上清)，再用1倍体积氯仿抽提1次(混合5 min，离心3 min，取上清)；加2倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA(12 000 r·min^-1离心5 min，弃上清)；用70%乙醇洗涤沉淀2遍，管壁倒扣、室温干燥1.5 min；最后加入200 μL TE或无菌超纯水溶解DNA，4 ℃过夜后-20 ℃保存备用。

1.2   RAPD检测

PCR反应条件如蒙子宁等^[11]所述，PCR反应体系总体积为25 μL，内含10×Taq缓冲液2.5 μL、25 mmol·L^-1 MgCl₂ 1.5 μL、2.5 mol·L^-1 dNTP(MBI)1 μL、5 μmol·L^-1引物(上海生工)1 μL、5 U TaqDNA聚合酶(MBI)0.2 μL、以及10 ng·μL^-1基因组DNA 2 μL，用16.8 μL超纯水补足体积至25 μL。PCR反应过程为95 ℃预变性5 min、后经过45个循环(94 ℃ 1 min→36 ℃ 1 min→72 ℃ 2 min)，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，于Gel Doc 2000(Bio-RAD)自动成像仪上观察。所用引物购自或委托上海生物工程技术服务有限公司(上海生工)合成。

1.3   线粒体Cyt b基因片断扩增及测序

从斜带石斑鱼每个群体中随机选取各4尾进行线粒体Cyt b基因片断的扩增及测序。所用引物序列为上海生工合成(表 1)。PCR反应条件同样参照蒙子宁等^[11]的条件，PCR反应体系总体积为25 μL，包括2.0 mmol·L^-1 MgCl₂、0.2 mmol·L^-1 dNTP、0.2 μmol·L^-1引物(上海生工，表 1)、1 U Taq plus DNA聚合酶(MBI)、1×Taq聚合酶缓冲液、及30 ng基因组DNA。PCR反应过程包括94 ℃预变性2 min、后经过30个循环(94 ℃ 45 s→50℃ 1 min→72 ℃ 1 min)，最后72 ℃下延伸10 min。PCR产物用UNIQ-5(上海生工)柱式纯化试剂盒纯化后，在ABI 377型自动测序仪(Perkin Elmers)上进行双向测序。

表  1  RAPD和Cyt b引物序列

Table  1.  Primer sequences of RAPD and Cyt b

RAPD引物序列(5′→3′) RAPD primer sequence(5′→3′)			Cyt b引物序列(5′→3′) Cyt b primer sequence(5′→3′)
S165-TGTTCCACGG	S183-CAGAGGTCCC	S241-ACGGACGTCA	L14724-5′-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3′
S168-TTTGCCCGGT	S190-ACCGTTCCAG	S242-CTGAGGTCTC
S178-TGCCCAGCCT	S192-CTGGGTGAGT	S245-TTGGCGGCCT
S180-AAAGTGCGGC	S193-GTCGTTCCTG	S248-GGCGAAGGTT	H15149-5′-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3′
S181-CTACTGCGCT	S195-CAGTTCACGG	S250-ACCTCGGCAC
S182-CCTCTGACTG	S200-TCTGGACGGA

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1.4   数据分析

RAPD电泳图谱中的每一条清晰、明亮而且重复性好的条带记为1个位点，出现带的记为1，没有出现带的则记为0，建立“1/0”矩阵。应用PopGene 1.31软件对矩阵进行统计处理，分别统计多态位点百分率(P)、基因多样性(h)和香农信息指数(i)等遗传参数(H)，用以评估斜带石斑鱼群体遗传多样性水平。对h和i进行t检验，用以检测群体遗传多样性的差异程度和水平。采用TFPGA软件来计算斜带石斑鱼群体间的遗传相似度(I)和遗传距离(D)。

应用ClustalX 1.83和Genedoc软件对线粒体Cyt b基因序列进行拼接，同时结合人工校正进行对位排序。通过MEGA 4.1软件统计基因序列的碱基组成，采用非加权组平均法(UPGMA)和邻接法(NJ)分别构建分子系统树，通过Bootstrap 1 000检验分子系统树各分枝的置信度。用DnaSP 5.1软件计算出变异位点、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数。

2.   结果

2.1   RAPD分析

通过生物软件PopGene 1.31对RAPD条带所构建的“0/1”矩阵进行分析统计，斜带石斑鱼3个群体的P为28.30%~32.08%、i为0.142 9~0.163 8、h为0.094 8~0.108 7(表 2)；t检验各群体的遗传多样性差异不显著(P>0.05)(表 3)；3个群体间的I很高(0.967 1~0.980 8)、D很小(0.019 4~0.033 5)(表 4)，表明群体间无明显遗传分化。

表  2  斜带石斑鱼的遗传变异

Table  2.  Genetic variation of E.coioides

群体 stock	多态位点百分率(P)/% percentage of polymorphic loci	香农信息指数(i) Shannon′s information index	基因多样性(h) gene diversity
惠州  HZ	31.13	0.150 6	0.098 1
深圳  SZ	32.08	0.163 8	0.108 7
湛江  ZJ	28.30	0.142 9	0.094 8

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表  3  基因多样性(对角线上方)和香农信息指数(对角线下方)的t检验

Table  3.  T-test for gene diversity (above diagonal) and Shannon′s information index (below diagonal)

群体 stock	惠州群体 HZ stock	深圳群体 SZ stock	湛江群体 ZJ stock
惠州  HZ	-	0.651 2	0.885 5
深圳  SZ	0.699 4	-	0.559 3
湛江  ZJ	0.819 4	0.545 6	-

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表  4  遗传相似度(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)

Table  4.  Genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

群体 stock	惠州群体 HZ stock	深圳群体 SZ stock	湛江群体 ZJ stock
惠州  HZ	-	0.975 1	0.980 8
深圳  SZ	0.025 2	-	0.967 1
湛江  ZJ	0.019 4	0.033 5	-

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2.2   线粒体Cyt b

测序得到长度为469 bp序列(GenBank登录号DQ448043~DQ448045)。通过与NCBI数据库中的相关序列进行比对分析，所得序列前1~39(39 bp)为tRNA^Glu基因，47~469(423 bp)为Cyt b基因(起始密码子为ATG)，两基因之间有7 bp的间隔区。斜带石斑鱼3个群体的线粒体Cyt b基因序列经比对未见插入和缺失，423 bp序列中只存在4个变异变点，均发生在密码子的第三位点，为C/T转换替代，核苷酸多样性(0.003 8)和平均核苷酸差异数(1.621)均非常低。就碱基组成而言，T、C、A和G平均含量分别为28.5%、30.6%、25.8%和15.1%;A+T含量为52.8%。密码子第一位点和第二位点各碱基相对均匀，无明显偏倚；但密码子第三位点的碱基明显偏倚，特别是鸟嘌呤G(2.1%)，远低于平均含量15.1%(表 5)。

表  5  斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因的碱基组成

Table  5.  Base composition of mitochondrial Cyt b gene of E.coioides

密码子 codon	T	C	A	G	A+T
第一位点 the first site	24.8	24.1	25.5	25.5	54.3
第二位点 the second site	38.3	22.7	21.3	17.7	50.3
第三位点 the third site	22.3	45.1	30.5	2.1	59.6
平均 mean	28.5	30.6	25.8	15.1	52.8

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从GenBank取得尖吻鲈(Lates calcarifer)(登录号NC_ 007439)的相应线粒体Cyt b基因片段作为外群(outgroup)序列。NJ和UPGMA系统树拓扑结构基本一致(图 1)，所检测个体并没有按照各自所属群体聚类，而是相互聚在一起。显然，斜带石斑鱼3个群体之间无明显的遗传分化。

图  1  基于斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因的NJ(a)和UPGMA(b)系统树

分枝节点处的数值为1 000次Bootstrap置信值

Figure  1.  Phylogenetic tree of E.coioides based on partial mitochondrial Cyt b gene sequences by NJ (a)and UPGMA (b)methods

Bootstrap values (1 000 replicates)are shown at nodes.

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3.   讨论

3.1   RAPD与线粒体Cyt b的多态性

RAPD和线粒体Cyt b基因序列分析广泛应用于鱼类的物种鉴定、种群结构分析及遗传多样性研究^[20]。该研究利用这2种分子标记技术分析了广东斜带石斑鱼主要养殖地区(惠州、深圳、湛江)3个养殖群体。试验仅用17条随机引物就检测到高达40.57%的多态位点，但在所测定的斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因只检测出4个变异位点，且变异位点仅存在少数个体中。可见，对研究斜带石斑鱼种内遗传变异，RAPD技术较线粒体Cyt b基因序列分析具有更高的灵敏性和多态性，这与BARDAKCI和SKIBINSKI^[21]在进行罗非鱼遗传分析时得出的结论一致。究其原因，RAPD技术是利用寡核苷酸引物对核DNA进行随机扩增，它不仅继承了聚合酶链式反应(PCR)高效灵敏的特性，而且因其扩增的区域大多为非编码的核基因组，积累较多变异，因而RAPD标记又具有很高的多态性^[22]；与之相反，线粒体Cyt b为蛋白质编码基因，承受较大的选择压力，变异性较小^[23]。因此，在应用线粒体基因于石斑鱼种内遗传分析时，应选择变异较大的NADH脱氢酶基因或控制区，以获得更多的遗传信息。

3.2   斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因的特点

此研究中斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因以ATG为起始密码子，没有发现插入或缺失，与tRNA^Glu之间有7 bp的间隔区。一般认为，鱼类的线粒体基因组结构较核基因组更为紧密，蛋白质编码不含内含子且基因间分隔不到10个碱基，使得线粒体基因组难以发生重排，从而维持基因次序的稳定^[24]。此外，Cyt b是鱼类线粒体基因组中较为保守的基因^[23]，此研究所检测到的变异位点均位于密码子第三位点，为沉默突变，不导致氨基酸替代，体现出该基因的保守性。斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因A+T含量为52.8%，在已报道的硬骨鱼亚纲14种鱼类(52%~60%)接近下限^[25]。斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因密码子第三位点的碱基偏倚明显，鸟嘌呤G(2.1%)远低于平均含量15.1%，这种强烈的反G偏倚在鱼类中普遍存在。

3.3   斜带石斑鱼养殖群体的遗传差异

1) 群体内遗传多样性。尽管许多石斑鱼种类具有很高的经济价值，但迄今有关石斑鱼遗传学的研究报道不多，且集中在物种鉴定、种群结构和系统进化等方面，涉及种内遗传多样性的有关于蜂巢石斑鱼(E.merra)^[26]的研究报道。P是反映物种遗传多样性水平的重要指标，通过比较得出斜带石斑鱼的P(40.57%)较蜂巢石斑鱼(65.58%)的低。除了物种差异外，由于对它们的遗传背景知之甚少，尚难究其原因。但值得指出的是，蜂巢石斑鱼目前资源状况较好，尚未被列入IUCN之濒危物种红色名录，而作为印度洋-太平洋沿岸国家重要渔业对象的斜带石斑鱼承受着巨大的捕捞压力，过度捕捞使斜带石斑鱼的自然种群破坏严重，这势必会影响其遗传结构。此外，该研究中的斜带石斑鱼为养殖群体，不可避免受到养殖过程中瓶颈效应、遗传漂变和近交等因素的影响。

2) 群体间遗传差异。进一步对斜带石斑鱼3个养殖群体之间的遗传差异进行研究，RAPD分析表明，群体的遗传多样性差异性不显著(t检验，P>0.05)，而且群体间具有很高的遗传相似度、遗传距离很小；进而Mantel检验得出群体间的遗传距离与地理距离无显著相关(R=0.090 9)。显然，斜带石斑鱼群体间的遗传差异很小，具有相似的遗传背景。线粒体Cyt b基因序列所检测到的核苷酸多样性和平均核苷酸差异数均非常低、通过NJ和UPGMA不同方法构建的系统树中，所检测个体并没有按照各自所属群体聚类，而是相互聚在一起, 表明斜带石斑鱼群体之间无明显的遗传分化，这与RAPD的分析结果一致。该研究中斜带石斑鱼取自惠州的澳头、深圳的南澳和湛江的东海岛，最近相距仅数十公里，最远达五百公里，但RAPD和线粒体Cyt b基因序列分析结果均表明，这3个群体间的遗传差异很小。由此可见，广东沿海斜带石斑鱼养殖群体具有较为相似的遗传背景。

3.4   保护斜带石斑鱼遗传多样性的建议

养殖群体繁育后代时普遍出现遗传多样性下降的问题^[27-28]，这是制约水产养殖健康持续发展的一个主要因素。斜带石斑鱼是中国南方沿海省份主要海水养殖经济鱼类，蒙子宁等^[12]曾利用分子标记技术对其亲本及繁育后代的遗传多样性水平进行跟踪检测，发现繁育群体规模小以及将繁育后代性成熟个体补充进入繁育群体，将会产生较高的遗传漂变和近交效应，这是导致繁育后代遗传多样性水平降低的主要原因。因此，为避免人工养殖中斜带石斑鱼遗传多样性的丧失以及近交衰退的出现，应1)适当增加亲本数量，维持一定的有效繁育群体大小；2)补充与现有繁育群体遗传背景差异较大的亲本，尽可能避免选择补充亲缘关系很近的群体，一般来说野生种群的遗传多样性较高，其性成熟个体应为补充亲本的首选。

然而随着斜带石斑鱼自然资源的日益衰退，这样的首选亲本变得越来越少。可行的替代办法是选择地理相距较远，遗传背景与现有繁育群体有一定差异的养殖群体中的性成熟个体作为补充亲本。该研究中，广东沿海斜带石斑鱼养殖群体具有较为相似的遗传背景，补充亲本的采集地点尽可能避免在省内，应考虑中国海南岛、台湾或距离更远的泰国、新加坡等地，甚至更远的国家或地区，并进一步对各地斜带石斑鱼群体的遗传背景进行深入研究或跟踪了解，以为人工增养殖提供参考。