卤虫(Artemia)在鱼、虾、蟹、头足类等水产动物苗种生产中是极优质的活饵料。近几年来，关于卤虫的研究主要在分子生物学^[1-3]、急性毒性^[4-6]及其在养殖对象的应用^[7-9]等方面。卤虫的孵化率是衡量卵质量好坏的一个重要指标^[10]，光照强度和盐度作为卤虫孵化的重要影响因子，国内外已有报道。如PAUL等^[11]指出不同品系的卤虫卵对光照的要求不同；张强等^[12]报道光照对巴里坤湖卤虫卵孵化率无影响，但会影响孵化的同步性，盐度对该品系的虫卵有较大的影响；吕光俊^[13]报道了盐度为5 g · L^-1卤虫孵化率最高；徐利生等^[14]报道盐度20~30 g · L^-1为天津品系卤卵最适孵化范围；ASIL等^[15]研究了光照强度对卤虫孵化、生长参数的影响，结果表明2 000 lx能提高孵化率，2 000~5 000 lx为卤虫生长的适宜光照强度^[16]。目前，文献报道的影响卤虫孵化率主要是单因子试验设计，而此设计具有很大的局限性^[17]。众所周知，卤虫的孵化环境是一个复杂的体系，有必要研究各种因子对卤虫卵孵化的综合影响。如党志超和李永祺^[18]利用正交试验设计钙离子(Ca²⁺)、pH和盐度三因子对卤虫卵孵化的影响；张闰生和张銮光^[19]采用正交试验法测定温度、盐度、光照和pH对天津卤虫卵孵化的综合影响，指出4个因素对卤虫卵的孵化有着极显著影响，并发现温度和光照间存在很强的交互作用。关于光照强度和盐度对卤虫卵孵化率是否存在交互作用以及二次效应，尚未见有相关报道。响应曲面法^[20]不仅可以建立因子和响应值间的模型，还可以对因子进行有效评价，在卤虫孵化条件的研究上尚未见用此方法的相关报道。该研究利用响应曲面法建立光照强度和盐度与孵化率的曲面模型，并评价光照强度和盐度的因子效应及其交互作用进行，确定最佳的组合，旨在优化卤虫卵孵化条件，最大程度挖掘卤虫卵的孵化潜能。

1.   材料与方法

1.1   材料

试验所用的卤虫休眠卵产地为山东省滨州市，经过试验观察确定试验卤虫为孤雌生殖卤虫(Artemia parthenogenetica of Binzhou)。

1.2   试验设计

通过光照强度和盐度的单因子试验，确定该试验所用品系的卤虫卵正常孵化的光照强度和盐度范围。试验采用中心复合设计(central composite design，CCD)试验设计方案，响应值为孵化率，因子为光照强度(L，1 000~3 000 lx)和盐度(S，25~35 g · L^-1)；该试验设计采用2因素5水平，因子点数4，轴点数4，中心点数5，共13组试验，每个试验组合重复3次。光照强度和盐度组合见表 1。

表  1  试验设计及结果

Table  1.  Experimental design and results

组合run	编码值code value			实际值actual value		孵化率/%hatchability
	光照强度/lxlight intensity	盐度/g·L-1salinity		光照强度/lxlight intensity	盐度/g·L-1salinity
1	0	0		2 000.0	30.0	28.58±1.37
2	0	-α		2 000.0	25.0	19.78±2.08
3	α	0		3 000.0	30.0	22.63±1.98
4	0	0		2 000.0	30.0	30.07±2.28
5	-α	0		1 000.0	30.0	17.71±1.07
6	0	0		2 000.0	30.0	27.74±1.82
7	-1	1		1 292.9	33.5	21.46±0.98
8	1	-1		2 707.1	26.5	19.52±0.74
9	0	0		2 000.0	30.0	29.62±1.25
10	0	α		2 000.0	35.0	27.48±0.87
11	1	1		2 707.1	33.5	25.26±1.06
12	-1	-1		1 292.9	26.5	17.34±2.17
13	0	0		2 000.0	30.0	28.26±0.63

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1.3   试验方法

卤虫休眠卵孵化率测定参考陈马康等^[21]方法并略有改进。称取0.1 g卤虫卵，倒入100 mL烧杯中，加入50 mL经曝气后的自来水，充气10 min后使得卵悬浮，用微量吸液管3个样品，每个约100粒卵，移至滤纸上，在解剖镜上计算卵数(Ci)，然后将样品分别用试验设置盐度的孵化用水冲至100 mL烧杯中，再加入同一盐度的孵化用水至80 mL，按试验设计的光照强度放入光照培养箱进行静水孵化。孵化期间的温度为27.5~28.5 ℃，pH为7.5~7.8，溶解氧为(6.23±0.02)mg ·L^-1。试验设置的盐度用经曝气后的自来水和海水晶(海龙牌)进行调节，盐度使用手持式盐度计(HSS-100，上海精密仪器仪表有限公司出品)进行测定，光照强度采用不同瓦数的照明灯泡与调节灯泡离水面距离进行调节，并采用数字式照度计(AR813A，希玛公司生产出品)进行测定。

1.4   响应值测定

在试验设置的光照强度-盐度组合条件下，孵化28 h后在每个烧杯中加入碘液，计算每个烧杯中的无节幼体数(Ni)，孵化率(H，%)按照公式计算：

式中Ni为无节幼体数，Ci为卵数。

1.5   数据处理

数据测定结果用平均值±标准差(X ±SD)表示。采用Design-Expert 8.0软件对试验数据处理并绘制相应的响应曲面和等高线图，并求得最佳的试验组合。显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

2.   结果与分析

2.1   光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率的影响

光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率的影响试验结果见表 1。二次多元回归方程的响应面及其等高线见图 1。通过该组动态图可评价光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率的交互作用。曲面较圆说明影响不显著(P>0.05)，而曲面较陡则说明影响显著(P<0.05)。盐度30 g · L^-1、光照强度1 000~2 000 lx时，随着光照强度的升高，孵化率呈上升趋势。光照强度对孵化率有极显著的影响(P<0.01)，光照强度高于2 000 lx，孵化率明显下降；当光照强度为2 000 lx、盐度为25~30时孵化率逐渐升高，盐度高于30时孵化率开始下降(图 1-b)。温度与盐度对卤虫孵化率的影响等高线呈圆形，表示无交互作用，温度、盐度都存在最大值(图 1-a)。

图  1  光照强度与盐度及其交互作用对卤虫休眠卵孵化率影响的等高线(a)和响应面(b)

α=1.414 2为星号臂值，中心点重复5次。

Figure  1.  Contour plot (a) and response surface plot (b) for effect of light intensity (L) and salinity (S) and their mutual interaction on hatchability of Artemia cysts

axial of star points α=1.414 2;the central points were repeated five times for each experiment.

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2.2   卤虫休眠卵孵化条件拟合优化

利用Design-expert 8.0软件对表 1中的数据进行最小二乘进行回归拟合，方差分析结果见表 2。模型P为0.000 1 <0.01，表明所建立的回归模型极显著；失拟项P为0.537 8>0.05，表明拟合的模型有效。光照强度与盐度的一次效应P分别为0.001 6和0.000 1，表明两者的一次效应均对卤虫孵化率有极显著影响(P<0.01)；光照强度与盐度的交互作用P为0.405 8>0.05，表明两者交互作用无显著作用(P>0.05)；光照强度与盐度的二次效应P分别为0.000 1和0.000 1，表明两者的二次效应对孵化率有极显著的影响(P<0.01)(表 3)。回归系数显示，盐度的效应较光照强度明显。光照强度(L)与盐度(S)和卤虫孵化率(H)的实际二次回归方程为：

表  2  光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率的回归模型方差分析

Table  2.  Variance analysis of effect of light intensity (L) and salinity (S) on hatchability of Artemia cysts

变异源 source of variation	平方和 sum of squares	自由度 df	均方 mean square	F	P
模型model	271.15	5	54.23	64.67	0.000 1
残差residual	5.87	7	0.84
失拟项lack of fit	2.27	3	0.76	0.84	0.538 7
纯误差pure error	3.60	4	0.90
总和total	277.02	12
R2=0.978 8        Adj R2=0.963 7      (Adj R2为校正系数)

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表  3  光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率的模型回归方程系数显著性检验

Table  3.  Significance test for regression equation coefficient of model of light intensity (L) and salinity (S) on hatchability of Artemia cysts

变异源source of variation	回归系数regression coefficient	标准误standard error	置信下限95% lower limit of confidence	置信上限95% upper limit of confidence	P
截距intercept	29.13	0.41	28.16	30.09
L	1.62	0.32	0.85	2.38	0.001 6
S	2.59	0.32	1.83	3.36	0.000 1
L×S	0.40	0.46	-0.68	1.49	0.405 8
L2	-4.73	0.35	-5.55	-3.91	0.000 1
S2	-3.00	0.35	-3.82	-2.16	0.000 1

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该方程的决定系数R²=0.978 8，说明该模型能解释97.88%响应值的变化，模型拟合程度良好。因此，可以利用此模型对该试验用的品系卤虫休眠卵在不同光照强度、盐度条件下的孵化率进行分析与预测。通过软件对模型进行分析，可得光照强度、盐度最佳的组合条件为L=2 134.02 lx和S=31.57 g · L^-1。此时该品系卤虫孵化率可以达到29.86%，其可信度为0.983(表 4)。

表  4  光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率影响优化的置信区间

Table  4.  Optimization for confidence interval for effect of light intensity (L) and salinity (S) on hatchability of Artemia cysts

响应值response	预测值prediction	标准差Std Dev	标准误均值SE mean	95%置信下限95% lower limit of confidence	置信上限95% upper limit of confidence	可信度desirability
孵化率/% hatchability	29.86	0.92	0.40	28.91	30.80	0.983

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2.3   模型验证

以响应面分析得到的卤虫休眠卵孵化最优的光照强度-盐度组合条件，利用同一品系同一批次的卤虫休眠卵进行验证，做5组平行试验(表 5)。试验结果与预测相符，故响应面分析方法可靠。

表  5  试验结果验证

Table  5.  Verification of experimental result

试验条件experimental condition	光照强度/lx light intensity	盐度/g·L-1 salinity	孵化率/% hatchability
响应面预测最佳条件predicated optimum condition	2 134.02	31.57	29.86
验证响应面预测最佳条件verified optimum condition	2 134	31.5	29.32±1.02

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3.   讨论

卤虫卵孵化率高低不仅与产地、品系有关系，而且与孵化条件密切关联。孵化条件通常指温度、盐度、光照强度和pH等。笔者试验中利用中心复合设计和响应曲面方法，光照强度与盐度对卤虫孵化率的二次多项回归模型决定系数和预测系数分别达到0.978 8和0.963 7。该试验设计方法已经在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)^{[17, 22-23]}、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)^[24]、马氏珠母贝(Pinctada martensii)^[25-26]水产品种中应用。综合上述研究及该试验结果，认为中心复合设计是一种十分有效的试验设计与过程优化的技术，以较小的试验次数同时考察多个因子，能够在试验条件范围内快速接近目标函数的极值点保证预测的正确性，对水产生物的孵化、生长等条件优化有重要的意义。

光照强度是影响卤虫休眠卵孵化的重要因素之一。PAUL等^[11]研究结果表明不同产品卤虫卵对光照的反应程度不同，同一品系的卤虫卵孵化对光照强弱的反应也不同。张闰生和张銮光^[19]报道光照对天津品系卤虫卵孵化有明显的刺激作用，认为光照强度为2 000 lx时孵化效果较好，高于或低于该水平都会使得孵化率降低；而光照强度大小、有无光照并不影响巴里坤湖卤虫卵的孵化率^[12]；光照强度对卤虫卵孵化的差异反应了卤虫卵产地、品系不同。该试验中选用了产地为山东的卤虫卵为研究对象，结果表明光照强度的一次效应对该品系虫卵孵化率的影响有极显著(P<0.01)，随着光照强度的增大，孵化率呈先上升后下降的变化趋势(图 1)，这一结果与张闰生和张銮光^[19]的结论一致。

盐度也是影响卤虫卵孵化率的重要因子之一。该试验中盐度对卤虫卵孵化率有极显著影响(P<0.01)。在试验设置盐度范围内，随着盐度升高，孵化率升高，达到一定盐度后，随盐度的升高孵化率则下降。天津品系卤虫卵在盐度为35时孵化率最高^[19]；吕光俊^[13]报道山东威海品系卤虫适宜孵化盐度为3~10，最适孵化盐度为5，并认为高盐度不适合卤虫的孵化；杨娜等^[27]指出山东埕口盐场、海南岛莺歌海盐场和青海柯柯盐湖的卤虫卵最适盐度分别为30、20和35；贾沁贤等^[28]指出山西盐池卤虫孵化适宜盐度范围为20~40。该试验中卤虫孵化最适盐度为30(图 1)，与上述研究结果既有类似处，也有不同之处，这反映了卤虫卵产地影响孵化特性。盐度对卤虫卵孵化是通过调节卵壳内外渗透压的大小而实现。当卤虫卵开始孵化时，卵内的海藻糖转化为甘油，甘油在卵内积累并从介质中不断吸收水分而使卵壳破裂，胚胎即可从中伸出^[19]。

以往在研究卤虫卵孵化条件时多是采用单因子试验，偶尔采用传统正交设计^[18-19]。该试验采用中心复合设计和响应曲面方法，克服传统正交设计所建立模型预测性差的问题，建立光照强度和盐度对卤虫卵孵化率的连续变量曲面模型，模型拟合程度好，可以对孵化率进行很好的分析与预测。Design-Expert 8.0软件模拟最适卤虫卵孵化的条件组合为L=2 134.02 lx和S=31.57 g · L^-1，其可靠性达到0.983。在验证试验中采用软件模拟出来的最优组合，得到了与预测相近的结果，证明所构建的模型可靠。

不同产地、不同品系的卤虫卵，在大小、孵化适宜条件、营养价值、生长状况等许多方面都存在差异，使用之前有必要对其进行前期研究。另外，卤虫卵实际孵化过程涉及的影响因子很多，最为关键的因子有盐度、温度、pH和光照强度。这些因子对卤虫卵孵化率的影响程度以及因子间的互作效应还需进一步试验。