Combined effect of light intensity and salinity on hatchability of Artemia cysts based on response surface methodology
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摘要:
为了探明光照强度(L)与盐度(S)对卤虫(Artemia)休眠卵孵化率的联合影响，采用中心复合设计试验设计方案进行响应面分析，寻找最适的条件组合，并对预测的条件组合进行验证。结果表明，在该试验条件下，光照强度与盐度的一次效应、二次效应对孵化率均有极显著影响(P<0.01)，两者的交互效应无显著影响(P>0.05)，随着光照强度或盐度的上升，孵化率呈先升后降的变化趋势。孵化率对实际自变量L和S的二次多元回归方程的拟合程度高，可用于预测。光照强度2 134.02 lx、盐度31.57 g · L-1为最适组合条件，在此最佳因子组合下卤虫休眠卵的孵化率达到最优，为29.86%，其可靠性达到0.983。对该组合条件进行结果验证，数据表明验证结果与预测值相符。建议该品系卤虫休眠卵在该研究得到最优的光照强度-盐度下进行孵化，以提高孵化效果。
Abstract:Using central composite design and response surface methodology,we explored the combined effect of light intensity and salinity on hatchability of Artemia cysts as well as determined the optimum experimental combination. The results show that the linear and quadratic effects of light intensity and salinity had very significant effect on hatchability (P<0.01) under experimental conditions;no significant interaction was found between light intensity and salinity on hatchability (P>0.05). The hatchability increased then decreased as light intensity or salinity increased. High fitting degree of hatchability to the quadratic regression equation of independent variables (light intensity and salinity) indicated its possibility of prediction. The optimum conditions for germination were light intensity of 2 134.02 lx and salinity of 31.57 g · L-1,under which the hatchability reached 29.86% and the reliability peaked to 0.983. Moreover,since verification result of optimum conditions accorded with the predicted value,it is suggested that the hatchability of Artemia cysts can be improved under optimum light intensity and salinity.
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Keywords:
- Artemia /
- hatchability /
- light intensity /
- salinity /
- response surface methodology
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酸价是衡量水产品油脂酸败的重要指标。鱼、虾等水产品在加工、贮藏及运输过程中，由于受氧、水、光、热、酶和微生物等因素的作用，油脂逐渐水解或氧化而变质，使中性脂肪分解为游离脂肪酸而使酸价增高，或使脂肪酸形成过氧化物后再分解为低级脂肪酸、醛类和酮类等有害物质[1-2]，影响水产品中油脂贮藏的稳定性，危害人体健康。因此，测定水产品的酸价有助于判断其油脂水解酸败程度，从而鉴定水产品的品质。
目前，国内外对油脂酸价的测定多采用氢氧化钾滴定法，中国GB/T 5530-1998[3]和SN/T 0801.19-1999[4]也把此法定为动植物油脂中酸价和酸度的测定方法。但样品未作处理，只能用于测定成品油脂，不适于水产品中酸价的测定。有报导[5-6]用石油醚来提取食品中的油脂，然后再测定酸价，但是水产品中水分含量较高，而石油醚、乙醚和正己烷等试剂不溶于水，只用它们提取水产品中的油脂效率很低，即使加大溶剂用量也不能达到试验的要求。因此，研究水产品的样品处理，制定一个适合于水产品酸价的测定方法，对于评定动物产品的品质，判断油脂是否酸败及酸败程度，降低保管损耗，保证人民群众身体健康等方面都具有重要意义。该研究用乙醚-乙醇混合溶剂提取水产品中的油脂后测定其酸价，方法的精密度和准确性良好。
1. 材料与方法
1.1 样品
鱼肉从超市购买。
1.2 试剂
干燥至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾。用邻苯二甲酸氢钾标定氢氧化钾标准溶液，其浓度为0.1052mol·L-1。无水乙醚-无水乙醇混合溶剂按体积比2:1的比例混合，使用前加入酚酞指示剂，用氢氧化钾标准溶液滴定至中性。用95%的乙醇配制10 g·L-1的酚酞指示剂溶液。
1.3 仪器
10mL和25mL碱式滴定管、锥形瓶、感量为0.0001 g的分析天平和50 mL聚丙烯离心管等。
1.4 实验方法
1.4.1 样品处理
将样品于绞肉机中绞成肉泥状，准确称取5 g(±0.01 g)于50 mL聚丙烯离心管中，加入15 mL乙醚-乙醇混合溶剂，涡旋振荡，超声提取15 min后以4 500 r·min-1离心3 min，上清液移入锥形瓶中，残渣用上述方法再提取2次，合并上清液后供测定使用。
1.4.2 酸价测定
在提取溶液里面加入2~3滴酚酞指示剂，以氢氧化钾溶液滴定至粉红色，10 s内不褪色即为终点，记录所需的氢氧化钾标准溶液的体积。
1.5 结果计算
$$ \text { 酸价 }=\frac{V \times c \times 56.1}{m} $$ 式中V为所用氢氧化钾标准溶液的体积(mL)；c为所用氢氧化钾标准溶液的准确浓度(mol·L-1)；56.1为氢氧化钾的摩尔质量(g·mol-1)；m为试样的质量(g)。
2. 结果
2.1 回收率试验
以从超市购买的罗非鱼作为空白样品，加入油酸[酸价ω(KOH)约为206 mg·g-1]进行添加回收试验，测定方法的准确度和精密度。每个样品进行6次平行测定，以消耗的KOH毫升数计算回收率，添加0.100 g油酸的平均回收率为94.3%，相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为3.53%，添加0.200 g油酸的平均回收率为96.1%，RSD为4.01%(表 1)。
表 1 罗非鱼酸价测定的回收率与精密度(n=6)Table 1. Recovery and RSD of acid value determination in tilapia油酸添加量/g
oleic acid added回收率/% recovery 平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSD1 2 3 4 5 6 0.100 91.5 94.7 97.5 89.8 93.9 98.4 94.3 3.53 0.200 96.5 92.3 101.3 91.0 97.4 98.3 96.1 4.01 2.2 实际样品分析
采用所建立的方法对采自湛江的罗非鱼样品进行分析，经6次平行测定，鱼肉酸价的平均值为1.2，RSD小于5%。为检测实际样品的提取效果，将此罗非鱼肉在日光下暴晒3 d后再次测定，进行对比试验。结果发现，经过暴晒，鱼肉酸价的平均值为10.7，这是由于暴晒后的鱼肉脂肪变质，氧化分解生成了更多的游离脂肪酸所致。
3. 讨论
用容量法进行酸价测定具有操作简单、结果准确和成本较低等优点。目前国内关于酸价测定的标准一般只局限于动物或者植物油脂，油脂样品不需提取即可直接滴定，而测定水产品及猪肉、鸡肉等畜禽产品的酸价时，必须先提取出油脂才能测定。为了拓展这些方法的适用性，此研究增加了样品的前处理步骤，使得水产品也能直接用容量法进行酸价测定，这为畜禽等其他动物产品进行相关研究提供依据。
3.1 提取溶剂的选择
测定水产品中的酸价，主要涉及样品中脂肪的提取。石油醚、乙醚、正己烷及乙酸乙酯等溶剂常用来提取脂肪，但是它们都不溶或者微溶于水，而动物产品一般含水量都比较高，直接用这些溶剂来提取时，由于其疏水性而不能将脂肪从动物产品中有效地提取出来。采用石油醚-无水乙醇(2:1)混合溶剂来提取游离脂肪酸，效果良好，但是2种溶液放置时分层，需用旋转蒸发仪蒸去石油醚，然后再用无水乙醚-无水乙醇溶解后滴定。减压蒸发的过程比较慢，水分也不容易蒸干，导致溶解后滴定时偏差比较大。直接用无水乙醚-无水乙醇(2:1)提取游离脂肪酸，提取液经过离心或者过滤后即为澄清液体，可以直接用来滴定。结果显示，该方法前处理时间短，回收率较高，RSD低于5%，可以用来进行水产品中酸价的测定。
3.2 提取条件的确定
取样量的多少与提取用溶剂的量成正相关，如果样品量太多，需要消耗较多的提取溶剂，既造成试剂的浪费又污染环境；而样品量太少，总游离脂肪酸的量也相应较少，会导致测定结果的误差比较大。经过多次试验，确定样品的重量为5 g。与样品相比，油酸的酸价太高，称量时应精确到±0.001 g，否则易对分析结果产生较大影响。另外在样品提取过程中，每次提取的时间不宜过短，以超声15 min为佳，经过3次重复提取，基本能够达到试验的要求。
3.3 指示剂的选择
有报道[7]称用百里酚兰作指示剂，效果比酚酞好，加入百里酚兰后溶液显示为黄色，滴定终点时突跃为兰绿色，在滴定颜色较深的油脂时效果比较好。水产品经过无水乙醚-无水乙醇提取后，经过离心的上清液是澄清液体，多次试验证明，用酚酞与百里酚兰效果相当，两者可以互相替代，对检测结果基本上无影响。
3.4 滴定溶液浓度的确定
试验中氢氧化钾溶液的浓度应根据实际样品的酸价进行调整，如果酸价过高，超过滴定管的刻度范围，需要提高氢氧化钾溶液的浓度或者更换大容量滴定管；反之则降低，以使消耗的溶液体积适当，滴定管的读数更加准确，减小试验的误差。
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图 1 光照强度与盐度及其交互作用对卤虫休眠卵孵化率影响的等高线(a)和响应面(b)
α=1.414 2为星号臂值，中心点重复5次。
Figure 1. Contour plot (a) and response surface plot (b) for effect of light intensity (L) and salinity (S) and their mutual interaction on hatchability of Artemia cysts
axial of star points α=1.414 2;the central points were repeated five times for each experiment.
表 1 试验设计及结果
Table 1 Experimental design and results
组合run 编码值code value 实际值actual value 孵化率/%hatchability 光照强度/lxlight intensity 盐度/g·L-1salinity 光照强度/lxlight intensity 盐度/g·L-1salinity 1 0 0 2 000.0 30.0 28.58±1.37 2 0 -α 2 000.0 25.0 19.78±2.08 3 α 0 3 000.0 30.0 22.63±1.98 4 0 0 2 000.0 30.0 30.07±2.28 5 -α 0 1 000.0 30.0 17.71±1.07 6 0 0 2 000.0 30.0 27.74±1.82 7 -1 1 1 292.9 33.5 21.46±0.98 8 1 -1 2 707.1 26.5 19.52±0.74 9 0 0 2 000.0 30.0 29.62±1.25 10 0 α 2 000.0 35.0 27.48±0.87 11 1 1 2 707.1 33.5 25.26±1.06 12 -1 -1 1 292.9 26.5 17.34±2.17 13 0 0 2 000.0 30.0 28.26±0.63 
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表 2 光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率的回归模型方差分析
Table 2 Variance analysis of effect of light intensity (L) and salinity (S) on hatchability of Artemia cysts
变异源 source of variation 平方和 sum of squares 自由度 df 均方 mean square F P 模型model 271.15 5 54.23 64.67 0.000 1 残差residual 5.87 7 0.84 失拟项lack of fit 2.27 3 0.76 0.84 0.538 7 纯误差pure error 3.60 4 0.90 总和total 277.02 12 R2=0.978 8 Adj R2=0.963 7 (Adj R2为校正系数)
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表 3 光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率的模型回归方程系数显著性检验
Table 3 Significance test for regression equation coefficient of model of light intensity (L) and salinity (S) on hatchability of Artemia cysts
变异源source of variation 回归系数regression coefficient 标准误standard error 置信下限95% lower limit of confidence 置信上限95% upper limit of confidence P 截距intercept 29.13 0.41 28.16 30.09 L 1.62 0.32 0.85 2.38 0.001 6 S 2.59 0.32 1.83 3.36 0.000 1 L×S 0.40 0.46 -0.68 1.49 0.405 8 L2 -4.73 0.35 -5.55 -3.91 0.000 1 S2 -3.00 0.35 -3.82 -2.16 0.000 1
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表 4 光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率影响优化的置信区间
Table 4 Optimization for confidence interval for effect of light intensity (L) and salinity (S) on hatchability of Artemia cysts
响应值response 预测值prediction 标准差Std Dev 标准误均值SE mean 95%置信下限95% lower limit of confidence 置信上限95% upper limit of confidence 可信度desirability 孵化率/% hatchability 29.86 0.92 0.40 28.91 30.80 0.983
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表 5 试验结果验证
Table 5 Verification of experimental result
试验条件experimental condition 光照强度/lx light intensity 盐度/g·L-1 salinity 孵化率/% hatchability 响应面预测最佳条件predicated optimum condition 2 134.02 31.57 29.86 验证响应面预测最佳条件verified optimum condition 2 134 31.5 29.32±1.02
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