大黄鱼(Larimichthys crocea)属石首鱼科，黄鱼属，也称黄鱼、大黄花、大鲜，是中国重要的经济海水养殖鱼类之一。随着人工育苗技术的成功，大黄鱼养殖业发展迅速，养殖规模不断扩大，养殖密度不断增加，对大黄鱼养殖饲料的需求越来越大，要求也越来越高。

大黄鱼养殖的饲料一般有3种：生物饵料、鲜饲料和人工配合饲料。生物饵料主要包括轮虫、卤虫无节幼体、枝角类和桡足类等，是育苗阶段常用的饲料，但在池塘进行成鱼养殖时，生物饵料难以满足大黄鱼生长需要^[1-2]。现有的人工配合饲料由于普遍存在水中稳定性不好，饲料系数偏高，养殖效果欠佳，目前还仅限于阶段性使用^[3-6]。现阶段大黄鱼养殖中使用较多的仍然是冰鲜杂鱼饲料。冰鲜杂鱼饲料种类繁多，来源广泛，质量、档次各异，有些可能携带病原微生物，引发鱼体疾病，为大黄鱼的健康养殖带来了隐患。目前对水产养殖饲料中微生物的研究主要集中在添加益生菌方面^[7-8]，对饲料本身携带的细菌等微生物的研究报道很少。了解大黄鱼投喂饲料中细菌等微生物群落结构、弄清微生物的组成，对减少由饲料中微生物引起的大黄鱼病害有重要意义^[9-11]。此外，饲料中微生物可能通过影响大黄鱼肠道微生物的组成和变化，进而影响大黄鱼的生长、发育、生理和病理。笔者以16S rRNA基因作为分子标记，通过克隆文库构建、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析、测序和系统进化分析等分子生物学技术手段，对大黄鱼冰鲜杂鱼饲料中菌群的组成和遗传多样性进行研究，为揭示鱼类养殖饲料微生物的种类、探讨其菌群结构对大黄鱼健康养殖的影响等提供基础数据。

1.   材料与方法

1.1   样品采集

饲料样品于2012年7月采自宁德三都湾大湾养殖区富发公司养殖场，是已绞碎的冰鲜小杂鱼饲料，于-20 ℃保存备用。

1.2   DNA提取、PCR扩增及16S rRNA基因克隆文库构建

称取0.20~0.25 g的饲料样品用于提取DNA，DNA提取方法参照YU和MORRISON^[12]。使用细菌16S rRNA基因通用引物对27F和1492R^[13]进行PCR扩增，其序列分别为27F，(5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′)；1492R，(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，扩增产物片段长约1 500 bp。25 μL PCR扩增反应体系含1 μL的DNA(约50 mg.L^-1)，2.5 μL的10×PCR缓冲液，引物各0.5 μmol.L^-1，200 μmol.L^-1的dNTPs，1 U的Taq酶(大连宝生物公司出品)，补无菌水至25 μL。PCR反应条件为在94 ℃下预变性5 min；接着以94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；最后在72 ℃下延伸10 min。扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

将上述PCR产物切胶纯化回收后连接到pMD18-T克隆载体(大连宝生物公司出品)，10 μL连接体系包含4 μL纯化PCR产物、1 μL pMD18-T克隆载体及连接缓冲液，16 ℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含氨苄青霉素(Amp，50 mg ·L^-1)的LB培养基上，37 ℃培养16~20 h，从Amp+抗性培养基上随机挑选150个克隆子，用菌落PCR方法检测克隆子是否有插入目的片段，菌落PCR引物使用克隆载体上的引物M13(上海美吉生物医药科技有限公司合成)。

1.3   RFLP分析和克隆文库统计学分析

经检验有正确插入目的片段的菌落PCR产物分别用限制性内切酶Afa Ⅰ和Hha Ⅰ进行单酶切。酶切反应体系为15 μL，包含8 μL菌落PCR产物，2 U内切酶及相应的缓冲液，在37 ℃酶切反应过夜后加入1.5 μL终止液，酶切产物通过2.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统拍照并记录结果。结合图片分析软件分析统计出所有不同的酶切带型及其出现的频率，用Past软件分析和绘制克隆文库稀有度曲线(rarefaction curve)。

1.4   测序和系统进化树的构建

根据RFLP分析得到的结果，在RFLP图谱中出现2次以上的酶切带型中挑选1~2个克隆子，出现1次的酶切带型中随机挑选10个克隆子，送上海美吉生物医药科技有限公司测序，测序引物为27F。测得的序列先用RDP CHMERA-CHECK序列分析软件分析^[14]，以排除嵌合体序列，然后在GenBank中进行Blast比对。利用MEGA 3软件，用邻接法(neighbour-joining)法构建系统进化树。

2.   结果与分析

2.1   RFLP分析

从Amp+抗性培养基上随机挑选的150个克隆子经菌落PCR筛选得到125个阳性克隆子，将这些克隆子的菌落PCR产物分别用限制性内切酶Afa Ⅰ和Hha Ⅰ进行单酶切，根据酶切图谱将125个克隆子分为82种酶切带型。其中最优势的酶切带型含有23个克隆子，占随机挑选的阳性克隆子的18.4%，次优势带型含4个克隆子，占3.2%。有3种酶切带型各含3个克隆子，分别占阳性克隆子的2.4%，其余酶切带型均只含1~2个克隆子，酶切带型只出现一次的克隆子数占随机挑选的阳性克隆子数的50%以上。这说明在饲料样品中，细菌遗传多样性很丰富，且优势细菌的主导地位并不是很突出。克隆文库稀有度曲线(图 1)分析表明，稀薄曲线并未趋近平台期，说明取样克隆子数目偏少，取样还不够充分。

图  1  大黄鱼饲料中细菌稀有度曲线

Figure  1.  Rarefaction curve of feed mash of large yellow croaker

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   序列比对和系统进化树分析

共挑选27个克隆子进行测序，去除嵌合体序列后得到23条有效序列(共代表 64个克隆子，已提交到GenBank，序列号为KF571747-KF571769)，根据BLASTN比对结果，结合系统进化分析，将23条有效序列分为3大类群(图 2)：其中γ-变形菌纲细菌(γ-Proteobacteria)占据明显地优势地位，含17个RFLP带型(代表 54个克隆子)，约占所分析克隆子数(64个)的84.4%；其次是黄杆菌纲(Flavobacteria)细菌，约占所分析克隆子数的10.9%；梭杆菌纲(Fusobacteria)细菌较少，约占4.7%。

对各类细菌进一步分析的结果表明，γ-变形菌纲细菌又可分为嗜冷杆菌属细菌(Psychrobacter sp.)、发光杆菌属细菌(Photobacterium)、弧菌属细菌(Vibrio sp.)和盐单胞菌科(Halomonadaceae)细菌等，其中嗜冷杆菌属细菌占优势地位，约占γ-变形菌纲克隆子数的60.9%(图 2)。与这些嗜冷属细菌最相似的序列主要来自低温环境，如积雪土壤、南极土壤、低温海洋(GenBank描述)等。有些最相似序列是一些潜在风险致病菌。如与SL-8最相似序列P.faecalis H5和SL-129最相似序列P .celerL9均来自奶酪中的潜在风险致病细菌^[15]；与SL-44最相似的序列Psychrobacter sp. L68分离自病鱼(GenBank描述)；与SL-31最相似的序列(clone ZH-4)分离自细菌污染的氨基酸口服液(GenBank描述)。序列相似性均达到97%以上。

图  2  大黄鱼冰鲜杂鱼饲料中细菌系统进化树

编号SL-N(n代表克隆子编号)是来自大黄鱼饲料克隆子的序列，后面括号中数值表示RFLP带型出现的次数，未标出次数的带型均只出现一次，参比序列来自GenBank，每个节点上显示大于50的自举值(100次重复)，标尺代表核酸置换率。

Figure  2.  Phylogenetic tree of bacteria in feed mash of large yellow croaker

SL-N (n represents different clones No.) represent cloned sequences from feed mash of large yellow croaker. Numbers in brackets that follow the clones indicate the occurrence frequency of the RFLP patterns, and clones without brackets indicate the RFLP patterns that occurred only once.Reference sequences are derived from the GenBank. Bootstrap values above 50 (100 iterations) are shown at each node. Scale bar represents the nucleotide substitution percentage.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

γ-变形菌纲中处于次优势地位的类群是发光杆菌属细菌，含4个RFLP带型(SL-7、SL-9、SL-33和SL-126)，分别与来自海湾(Photobacterium sp. MOLA 439)、鱼肠道(Photobacterium sp. OIM3)(GenBank描述)中细菌最相似，序列相似性均达到99%。

有3个克隆子属于弧菌属细菌，与之最相似的序列是分离自大菱鲆(Scophthalmus maximus)的病原菌序列Vibrio sp. YASM15(GenBank描述)以及分离自鱼体的具有抗菌活性的细菌序列VVibrio sp. S3669^[16]。仅检测到一条假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)细菌序列(SL-124)，它与来自珊瑚粘液的克隆子CI 23序列^[17]最相似，相似性到达98%。有2个RFP带型(SL-6和SL-25)属于盐单胞菌科细菌，各代表 2个克隆子，其中与SL-6最相似的序列为来自红海鞘^[18]的盐单胞菌属(Halomonas)细菌，相似性为97%；SL-25与来自高盐环境的盐单胞菌和色盐杆菌(Chromohalobacter)^[19]亲缘关系最近，但相似性均为94%。

有7个克隆子序列属于黄杆菌纲细菌序列。其中有3个克隆子与来自海洋环境的类香味菌属细菌Myroides pelagicus SM1^[20]最相似，相似性达99%；有3个克隆与冷适应细菌Aequorivita sp. B3-5(GenBank描述)最相似，但相似性为94%。另有一个克隆子SL-1与来自海洋的未知菌属的黄杆菌科细菌亲缘关系最近，相似性为94%。

有2条序列(代表 3个克隆子)为未知菌属的梭杆菌纲细菌，它们分别与来自猪肠道中细菌DJF_ B254(GenBank描述)和来自采后15 ℃下保存的牡蛎中的细菌克隆子154B12^[21]最相似，相似性分别为97%和99%。

3.   讨论

此研究所采集的冰鲜鱼中优势细菌类群是嗜冷杆菌属细菌(约占53.4%)，与之最相似的序列主要是来自低温环境，如冷藏食品、低温海洋等。冰鲜保存的条件下样品中原有的一些细菌不适应低温，生长缓慢或死亡，而嗜冷细菌因能够适应低温环境成为优势菌群。这些细菌显然与冷藏环境有关，并不一定都是样品中原有的优势细菌。除嗜冷杆菌外，也检测到其他类群的冷适应菌序列。

在冰鲜杂鱼饲料中检测到一些克隆子序列除了与来自海洋环境的细菌序列相关外，还有一些序列与GenBank库中分离自鱼体、鱼肠道的序列最相似，而笔者研究的饲料样品也是小杂鱼，说明一些细菌特异地存在于鱼体上或鱼体内，饲喂后也可能会对大黄鱼鱼体上和肠道菌群产生影响。

值得注意的是，在大黄鱼冰鲜杂鱼饲料中检测到一些病原菌相关序列，如奶酪中的潜在风险致病菌、分离自病鱼的细菌序列，以及大菱鲆病原菌序列等，这些致病菌可能会对大黄鱼健康养殖带来潜在风险。因此，在养殖中投喂冰鲜杂鱼饲料要尽可能地保证饲料的新鲜健康，最好能对冰鲜杂鱼饲料进行初步加工，以减少或杀死其中的病原菌，减少大黄鱼发病的可能性。

此研究中的杂鱼饲料是在养殖区及附近海区捕获的杂鱼，主要种类有龙头鱼(Harpadon nehereus)、小带鱼(Eupleurogrammus muticus)以及各种小鱼、小虾，不同时期捕捞的杂鱼种类会有一定差异，而杂鱼的种类构成显然也会影响杂鱼饲料中的菌群结构。今后研究中应在大黄鱼不同发育时期多批次采集不同饲料样品，研究其细菌组成，使研究结果更全面、更有代表性。此外，笔者研究构建的克隆文库覆盖率(coverage)为48%，克隆子数目有限，但研究在挑选克隆子时是随机进行的，结合测序及系统发育分析，可以得到大黄鱼冰鲜杂鱼饲料中主要细菌类群的信息，研究结果将为大黄鱼的健康养殖等方面提供基础数据。