Effect of No.0 diesel oil water-soluble fraction on CYP4 gene expression in green mussel (Perna viridis)
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摘要:
在室内半静水的试验条件下，应用实时荧光定量PCR技术研究了不同质量浓度(0 μg · L-1、5 μg · L-1、10 μg · L-1、50 μg · L-1和100 μg · L-1)的0#柴油水溶液(WSF)胁迫15 d和清洁海水恢复7 d中翡翠贻贝(Perna viridis)外套膜与内脏团组织中CYP4基因的相对表达水平变化。2-△△Ct法分析结果表明，CYP4基因在翡翠贻贝外套膜和内脏团中均有表达，WSF胁迫对其表达水平有明显的诱导作用，且表达水平具有组织差异性；内脏团表达水平明显高于外套膜，两组织CYP4基因相对表达水平随着WSF胁迫时间的延长，整体呈现出先诱导后抑制再诱导的波动变化趋势，其中50 μg · L-1浓度组表现最为显著(P < 0.01)。WSF胁迫解除后外套膜与内脏团CYP4基因相对表达水平迅速下降，部分浓度组逐渐恢复到正常水平。
Abstract:Green mussels (Perna viridis), exposed to 0 μg · L-1, 5 μg · L-1, 10 μg · L-1, 50 μg · L-1 and 100 μg · L-1 No.0 diesel oil water-soluble fraction (WSF) for 15 d under semi-hydrostatic simulation, were transferred to clean sea water for 7 d to analyze the gene expression levels of CYP4 by the method of 2-△△Ct combining with real-time quantitative PCR. Results show that WSF obviously induced CYP4 up-regulation and was differentially expressed in both visceral mass and mantle in P.viridis. The expression level of CYP4 was obviously higher in visceral mass than in mantle. The relative gene expression level initially increased then decreased and increased again as time elapsed in those two kinds of tissues. The most significant difference was observed in 50 μg · L-1concentration group (P < 0.01)compared to the control. At the last 7 d, the expression level in visceral mass and mantle decreased quickly and that in some groups gradually returned to normal level by being transferred to clean sea water.
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超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)被FRIDOVICH等国内外学者[1-4]统称为保护酶系统。细胞内自由基的产生与消除是因为SOD、CAT及POD 3种酶协调一致，处于一种动态平衡状态，使自由基维持在一个低水平，从而防止自由基毒害，一旦这种平衡受到破坏，就可能产生伤害作用。所以研究保护酶活性在药物胁迫下发生的变化可以作为灵敏指示动物受药物胁迫的生化指标，尝试以这些抗氧化防御系统成分的变化作为氧化胁迫的生化指标的研究，正在成为毒理学研究的新热点，而国内这一领域的研究较少[5-7]。
三唑磷是一种有机磷农药，曾经作为有机氯的替代产品在我国农林业生产、水产养殖业中作为杀虫剂广泛使用。它在浙江沿岸，主要用于池塘的清理，杀灭大型甲壳类，其杀灭作用强，但残留时间较长，有时候在虾蟹饲养过程中也用三唑磷控制桡足类的大量繁殖。1996年以来，由于三唑磷污染造成死虾、死鱼、死贝的事故时有发生[8]，其对海洋生物资源、水产养殖品种和生态环境的影响颇令人担忧，已引起有关专家的重视。本文通过研究日本
1. 材料与方法
1.1 实验材料
本实验所用的日本
1.2 实验设计和方法
1.2.1 毒性实验
首先采用常规急性毒性实验的方法以确定三唑磷对日本
1.2.2 药物积累试验
根据急性毒性实验的结果，把三唑磷对日本
1.2.3 样品处理
从毒性实验开始的当日起，每2 d取样1次，每组取4只个体(2雌2雄)，活体解剖，分别取出肌肉，鳃、肝胰脏，心脏、性腺等组织器官，用生理盐水洗过后放进-70℃冰箱备用。测量前取出组织称重，按0.1 g组织加入0.5 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.0)的比例，放入玻璃匀浆器在冰浴条件下研磨，然后置冰冻离心机内以14 000 r · min-1的速度离心25 min，然后取其上清液进行酶活性测定。另取暂养后的健康蟹10只用来分析日本
1.2.4 酶活性测定
SOD活性测定采用FRIDVICH[1]建立略有改进的氮蓝四唑光化学反应法，一个SOD活力单位定义为能引起反应初速度(指不加酶时)半抑制时的酶用量；CAT活性采用紫外吸收法测定，以1 min内吸光度减少0.1的酶量为一个酶活单位；POD活性参照蒋继宏等[9]方法，略有改进，以每分钟光密度变化值来表示酶活性的大小。每个样品做5个平行，取其平均值。
1.2.5 数据处理
以“酶活单位”表示酶活性的大小，为了更清楚表示药物作用下酶活性的变化，去除饥饿等其它因素对酶活力的影响，用酶比活力(酶活单位相对值，即把处理组酶活单位同对照组酶活单位进行比较)表示酶活性变化。数据处理采用SPSS统计软件。
2. 实验结果
2.1 急性毒性试验结果
急性毒性试验结果见表 1。
表 1 三唑磷对日本
Table 1. LC50 and safe concentration of triazopnios on C.japonicamg · L-1 影响
effect浓度
concentration影响
effect浓度
concentration24 h半致死浓度
LC50(24 h)8.76 96 h半致死浓度
LC50(96 h)2.70 48 h半致死浓度
LC50(48 h)5.94 安全浓度safe concentration 0.27 72 h半致死浓度
LC50(72 h)3.94 2.2 三唑磷对日本
试验期间对照组日本
U · (g · mL)-1 5种组织five tissues 时间/d time 0 2 4 6 8 10 12 14 16 鳃(对照/试验)
gill(control/test)73.89/
75.4168.95/
48.5691/
74.8258.79/
56.2449.75/
122.32116.56/
137.63107.43/
144.36118.07/
141.36120.3/
86.74肝胰脏(对照/试验)
hepatopancreas (control/test)30.29/
29.2927.16/
35.7427.34/
35.1224.9/
49.55251.16/
62.5424.83/
60.33154.61/
80.64114.78/
39.66135.8/
28.25心脏(对照/试验)
heart(control/test)160.58/
160.84160.92/
151.55186.35/
253.83166.67/
147.1326.75/
214.49269.3/
263.17300.14/
243.82227.86/
282.62229.68/
247.11肌肉(对照/试验)
muscle(control/test)82.22/
86.2277.6/
74.0479.68/
72.0784.08/
91.32111.24/
139.78136.07/
145.64170.88/
155.23124.4/
143.09109.87/
94.27性腺(对照/试验)
sex gland(control/test)42.58/
46.5842.92/
165.13174.48/
298.35251.84/
377.14339.58/
324.32409.68/
572.06613.9/
431.03238/
414.79224.6/
288.15![]()
图 1 三唑磷对日本2.3 三唑磷对日本
试验期间对照组日本
U · (g · mL)-1 5种组织five tissues 时间/d time 0 2 4 6 8 10 12 14 16 鳃(对照/试验)
gill(control/test)14.71/
16.7112.87/
19.0211.22/
11.126.63/
7.635.88/
8.716.78/
7.398.16/
2.219.52/
15.611.78/
13.17肝胰脏(对照/试验)
hepatopancreas (control/test)66.64/
66.6766.74/
16.6923.05/
3.3223.05/
49.19126.63/
120.24156.29/
74.3369.57/
121.8164.67/
98.2196.75/
63.52心脏(对照/试验)
heart(control/test)38.64/
36.6350. 62/
53.9930.98/
18.1020.65/
17.6242.41/
31.2630/
26.4923.11/
26.5528.34/
34.8132.28/
43.06肌肉(对照/试验)
muscle(control/test)10.11/
11.009.06/
29.3219.93/
9.4515.99/
6.4011.12/
17.9913.05/
9.4411.2/
11.459.93/
11.8010.13/
19.88性腺(对照/试验)
sex gland(control/test)73.92/
93.8217.96/
54.9714.8/
63.3714.14/
53.4712.46/
19.3354.32/
46.6746.92/
32.9418.5/
14.3618.96/
39.84![]()
图 2 三唑磷对日本3. 讨论
3.1 5种组织中保护酶系统分析
本实验中检测了日本
关于甲壳动物POD的研究并不多见，仅见有关鱼和昆虫的报道[2-4, 10-14]。本实验未在日本
3.2 5种组织对三唑磷敏感性分析
从实验结果可以看到，5种组织中对三唑磷最为敏感的组织是肝胰脏、性腺和鳃(F*>F0.05，P < 0.05)，肌肉和心脏比较稳定，这和白洁等[15]、唐学玺和张培玉[16]、贾秀英和陈志伟[17]的研究结果相似。组织对毒物的敏感性不同和各组织结构以及所执行的功能有关。鳃是日本
此外，同一组织中SOD和CAT活性在三唑磷胁迫下的变化趋势也不尽相同，这说明机体的保护酶系统是一个相互制约、协同作用的有机整体，它们可以达到一种动态的平衡以抵御外界的损害。
3.3 药浴时间对保护酶活性的影响及其机制
药浴时间的长短对酶活性的影响不同，组织细胞酶活性的大小是药物作用和保护酶系统自身防御共同的结果。肝胰脏、性腺中SOD和肌肉中CAT在实验前2 d和对照组相比均有不同程度的升高，然后逐渐降低，到实验结束时大部分酶活性已经基本和对照组的相当，但有的仍在波动中(图 1、图 2)。STEBBING[18]认为毒物在低浓度下出现的这种增益现象是其在无毒情况下的刺激效应，把这一现象称为“毒物兴奋效应”。许多研究证明“毒物兴奋效应”具有普遍性，本实验也证明了这一点。
动物细胞在低浓度毒物的胁迫下产生大量的自由基，保护酶SOD、CAT活性也在自由基的诱导下随之升高，以清除过量的自由基，因此便出现了酶活性在处理2 d后逐渐升高并超出对照组水平的现象。但自由基反应速度非常快，有些未得到及时清除的自由基就对细胞产生了伤害，细胞结构也受到一定程度的损伤。此外，当毒物长时间作用于机体后，大量的活性氧中间体超过了机体清除活性氧的能力，结果大量的活性氧中间体作用于酶蛋白质分子的关键性氨基酸残基，使酶活性受到抑制，即把CAT上的-SH巯基氧化成SO2，从而改变CAT的结构，抑制其活性。因此，酶活性又会逐渐回落。国内外大量研究证明[7, 16-17, 19-20]，低度污染胁迫下的生物机体SOD、CAT的活性显著上升，但随着毒物浓度的升高，或者暴露时间的延长其活性又被显著抑制。
随着实验时间的延长，受毒物胁迫低的细胞在生物体内各种酶机制的相互作用下还可以渐渐恢复到对照组的水平，如性腺中CAT和SOD以及肌肉中CAT，这说明机体本身对外界的轻微胁迫具有一定的防御能力，生物体可以通过调节抗氧化酶的水平来增强其清除活性氧的能力，以减轻污染物的伤害。但是，肝胰脏中SOD和CAT的活性都表现出了不同程度的紊乱，说明这些组织的细胞已经受到了较深的毒害，不能恢复到对照组的水平，同时也说明机体对抗外界环境污染胁迫的能力是有限的，一旦污染物超过某一限度，便会导致细胞代谢失调和细胞结构的破坏[21]。
4. 结语
日本
毒理学研究者一致认为，污染物对生物体的作用归根结底是在分子水平上进行的，是污染物分子和生物大分子的相互作用引起的。保护酶的变化是污染物在生物体内代谢过程中与生物大分子相互作用的一种表现，要想对毒害机制做进一步的研究必须利用生物化学或分子生物学的方法。
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图 1 CYP4在翡翠贻贝内脏团和外套膜中的相对表达水平测定(以beta-actin为内参)
*、* *. 分别与空白组比较(0.01≤P < 0.05、P < 0.01)
Figure 1. Relative level of CYP4 gene expression in visceral mass and mantle of P.viridis (use beta-actin as internal control gene)
*, * *. compared with the control, respectively (0.01≤P < 0.05, P < 0.01)
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