诺卡氏菌(Nocardia spp.)属于细菌域，厚壁菌门，放线细菌纲(Actino bacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，诺卡氏菌科(Nocardiaceae)^[1]。它广泛分布于空气、土壤、活性污泥、水、腐烂的植被、动物的排泄物及人的组织中，以腐生为主^[2]，对鱼类^[3-6]、人^[7-9]、牛、犬、猫^[10-11]等哺乳动物都可致病，已经成为一种引人注目的人-兽-鱼共患病病原。鱼类诺卡氏菌病(Nocardiosis)是由诺卡氏菌属细菌所引起的慢性全身性疾病，症状包括皮肤的溃疡灶和内脏器官肉芽肿病变^[12-13]。尽管鱼类诺卡氏菌在水体中的含量并不高，为水体条件致病菌^[14]，但近年来由于种苗地区间交流增加和养殖环境的恶化，养殖鱼类诺卡氏菌病逐年升高。2005年~2012年笔者实验室从中国华南地区采样或送检的样品中多次检测到鱼类结节病，共分离到15株不同菌株，经鉴定均为鱼诺卡氏菌(N.seiolae)，呈蔓延趋势，其中以海水网箱养殖的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)感染最为严重，发病率为20% ~60%，死亡率为10% ~30%，未死鱼由于体表溃疡症状也严重影响其市场价值，带来了巨大的经济损失。虽然学界对诺卡氏菌病进行了多年研究，但大都限于不同发病鱼病原菌的分离、鉴定^{[4, 14-15]}、检测技术^[16-19]及常规组织病理^[20-21]的描述，对于鱼源致病性鱼诺卡氏菌分型的研究还未见报道。文章以16S rDNA基因序列、形态学特征、生理生化特征及抗生素敏感性为指标，将15株不同生长环境下鱼诺卡氏菌样品进行系统发育及聚类分析，旨在揭示菌株之间的差异性，为该病的有效检测与流行病学研究提供参考。

1.   材料与方法

1.1   疾病症状观察及病原菌的分离纯化

对采样或送检的自然发病鱼(垂死)发病情况进行调查，记录病鱼的来源、体表及内脏器官的病理变化特征；无菌操作采取脾、肾等脏器，分别划线接种于营养琼脂培养基、脑心浸萃琼脂培养基，并分别编号，置于28 ℃恒温培养箱内培养96 h检查结果。

1.2   16S rDNA序列测定与系统发育分析

用营养肉汤培养基分别在28 ℃震荡培养分离菌株5 d后，离心收集得到菌体，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌的总DNA，-20 ℃保存，作为PCR的模板。经细菌通用引物27F和1492R扩增后，将PCR产物送至上海英骏生物技术有限公司(广州分公司)测序。所得测序结果经BLAST在线比对后，用MEGA 4.0软件包中的Neighbor-Joining法构建系统进化树。

1.3   病原菌的形态观察与理化特性检测

观察并记录菌落形态，对其纯培养物进行革兰氏染色，镜检；并参考HOLT等^[22]、刘志恒和姜成林^[23]的方法对分离菌株进行系统的生理生化实验，包括酶类产生、水解活性、唯一碳源生长、温度、盐度、pH耐受性。

1.4   药物敏感试验

参照NCCL试验操作标准^[24]，采用纸片扩散法对分离菌株进行药物敏感试验。

1.5   聚类分析

对这些菌株的资料用SPSS 18.0软件进行聚类分析，聚类分析采用系统聚类法中的组间连接聚类法，菌株间的同类系相关性以欧式平方距离表示，把所有性状用“0”表示负反应，“1”表示正反应进行分析，以树状图的形式显示结果。

2.   结果

2.1   发病情况及临床症状

鱼诺卡氏菌病流行季节较长，3月~12月均有发生，发病高峰在6月~10月，自然发病率为15%~30%，严重的可达60%。发病鱼主要表现为真皮下形成脓疮，鳃上有棉絮状结节，脾脏和肾脏肿大，有大量白色或淡黄色结节出现，肝脏、心脏或膘上也偶尔可见。笔者所收集的15株鱼诺卡氏菌，其中有8株分离于卵形鲳鲹，分离菌株编号见表 1。

表  1  供试菌株一览表

Table  1.  List of tested strains

菌株序号 strain No.	菌株 strain	分离时间 date of sampling	感染对象 infected object	采样地点 location of sampling	养殖方式 breeding method
1	N07XC01	20060404	卵形鲳鲹(T.ovatus)	海南陵水	海水网箱
2	N07XC02	20060404	卵形鲳鲹	海南陵水	海水网箱
3	N07XC03	20060404	卵形鲳鲹	海南陵水	海水网箱
4	N07XC04	20060404	卵形鲳鲹	海南陵水	海水网箱
5	N10ZH01	20100612	鲈(Lateolabrax japonicus)	广东珠海	海水网箱
6	N11WN01	20110315	尖吻鲈(Lates calcarifer)	广西港北	海水网箱
7	N11QY01	20110517	大口黑鲈(Microptorus salmonoides)	广东清远	淡水池塘
8	N11NH01	20110616	乌鳢(Channa argus)	广东佛山	淡水池塘
9	N11YJ03	20110725	斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)	广东阳江	海水网箱
10	N11ZJ01	20110728	卵形鲳鲹	广东湛江	海水网箱
11	N11YJ01	20110913	卵形鲳鲹	广东阳江	海水网箱
12	N11NA01	20111011	(Seriola quinqueradiata)	广东南奥	海水网箱
13	N11HD01	20111024	杂交鲶(Silurus soldatovi×S.asotus)	广东花都	淡水池塘
14	N11YJ02	20111210	卵形鲳鲹	广东阳江	海水网箱
15	N12YJ03	20120710	卵形鲳鲹	广东阳江	海水网箱

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2.2   16S rDNA序列和系统发育分析

以分离菌株的总DNA为模板，经细菌通用引物27F和1492R扩增得到约1 500 bp的条带(图 1)。将测序得到的序列在GenBank中进行同源性检索，结果与诺卡氏菌属的细菌亲缘关系最近，与Nocardia seriolae strain JCM 3360的16S rDNA基因序列相似性达到99%。从N-J法建立的系统发育树上可以看出，此15株菌株与Nocardia seriolae strain JCM 3360位于用一个分支上，遗传距离为0.005，自举置信值达99%，据此鉴定这15株菌株均为鱼诺卡氏菌(图 2)。15株供试菌株聚成明显的2个分支，首先菌株N07XC01、N07XC02、N07XC03聚在一起，然后与菌株N10ZH01、N11HD01、N11NA01、N11NH01、N11QY01和N11WN01聚为一支；菌株N07XC04、N12YJ03、N11ZJ01、N11YJ03、N11YJ02和N11YJ01则聚为第2分支；均得到99%自举置信值的支持。

图  1  分离菌株16S rDNA的PCR扩增

M. DAN marker；1. N07XC01；2. N07XC02；3. N07XC03；4. N07XC04；5. N10ZH01；6. N11WN01；7. N11QY01；8. N11NH01；9. N11YJ03；10. N11ZJ01；11. N11YJ01；12. N11NA01；13. N11HD01；14. N11YJ02；15. N12YJ03

Figure  1.  PCR amplification of 16S rDNA from isolates

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图  2  基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树

Figure  2.  Phylogenetic tree of the tested strains based on 16S rDNA gene sequences

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2.3   性状测定结果

2.3.1   形态特征

培养5 d后在营养琼脂培养基、改良罗氏培养基、胰大豆蛋白琼脂培养基和脑心浸萃琼脂培养基上都出现明显的优势菌落，呈沙粒状，不透明。菌落颜色呈现白色或淡黄色，菌落有湿润型和干燥型2种，此外，菌落还呈现雪花状、圆形及不规则形3种形状(表 2)。显微镜下观察到15株菌菌落基丝发达，呈分枝状。革兰氏染色后，个体呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌(图 3)，在100倍油镜下观察到个体形态均呈杆状，基本上没有太大的区别。

表  2  菌落在营养琼脂培养基上的形态

Table  2.  Shape of the isolates on Nutrient Agar Medium

菌株序号 strain No.	菌落形态 colony morphology
	形状 shape	颜色 colour	干燥/湿润 dry/humid	透明/不透明 transparent/opaque	光滑/粗糙 smooth/rough
1	雪花状	白色	干燥	不透明	粗糙
2	圆形	淡黄色	湿润	不透明	光滑
4、9	不规则形	淡黄色	干燥	不透明	粗糙
3、7、8、10、12	圆形	白色	湿润	不透明	光滑
5、6、11、13、15	不规则形	白色	干燥	不透明	粗糙

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图  3  革兰氏染色下菌株N11QY01的形态(×1 000)

Figure  3.  Shape of N11QY01 by Gram staining

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2.3.2   生理生化特征

在生理生化性状测试中所有菌株均为氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，产生脲酶，水解七叶灵，不水解明胶、淀粉、酪素、酪氨酸、黄嘌呤，都不能利用阿拉伯糖、山梨醇及鼠李糖作为唯一碳源生长，在盐度分别为0和10的营养琼脂培养基，pH分别为5、6、7和8的营养琼脂培养基和20~43℃培养条件下，15株菌均能生长，但都不能在盐度为40的营养琼脂培养基、pH分别为4和10的营养琼脂培养基、45 ℃培养条件下生长。

2.3.3   抗生素试验

在抗生素敏感试验中，15株菌均对庆大霉素、恩诺沙星、链霉素及卡那霉素敏感，对氨苄西林耐药。

2.4   聚类结果

除去47项测试指标中33项全同性状，其余14个相异性状采用组间连接聚类法进行聚类分析，获得供试菌株的分类树状图(图 4)。T=23时分为2个组群，组群1包括菌株N11YJ01、N11HD01、N11YJ03、N07XC01、N11WN01、N07XC04、N10-ZH01、N12YJ03和N11YJ02；组群2包括菌株N07XC03、N11NA01、N11NH01、N11ZJ01、N11-QY01和N07XC02。组群1的菌株在营养琼脂培养基上的菌落表面均湿润、润滑，而组群2则干燥、粗糙。T=11时组群1可分为亚组群1.1和1.2，组群2可分为亚组群2.1，2.2，2.3和2.4。亚组群1.2菌株(N11YJ02)与亚组群1.1菌株(N11YJ01、N11HD01、N11YJ0、3N07XC01、N11WN01、N07XC04、N10ZH01、N12YJ03)的区别在于亚组群1.2的菌株可还原硝酸盐，并可利用甘露醇作为唯一碳源生长。菌株N07XC03和N11NA01聚为亚组群2.1，菌株N11NH01与N11ZJ01聚为亚组群2.2，菌株N11QY01与菌株N07XC02则分别独立聚为亚组群2.3和2.4。其中亚组群2.4的菌株对红霉素耐药，而亚组群2.1、2.2、2.3的菌株均对红霉素敏感；亚组群2.3的菌株对利福平耐药，而亚组群2.1、2.2的菌株均对利福平耐药；亚组群2.2的菌株均不能在pH=9的营养琼脂培养基上生长，而亚组群2.1的菌株则与之相反。

图  4  供试菌的聚类分析

Figure  4.  Dendrogram of the tested strains by cluster analysis

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3.   结论与讨论

诺卡氏菌是一种革兰氏阳性杆状菌，在海水中含量不高，在淡水中的含量未见报道，是一种机会致病菌^[14]，可感染多种水生动物。在水产养殖中，诺卡氏菌属中的粗形诺卡氏菌(N.crassostreae)、杀鲑诺卡氏菌(N.salmoncide)、星状诺卡氏菌(N.asteroides)及鱼诺卡氏菌引起水产动物疾病的报道在国内外已屡见不鲜。

2005年~2012年笔者实验室从中国华南地区采样或送检的样品中多次检测到鱼类结节病，共分离到15株不同菌株。该研究中用分离菌株的16S rDNA基因序列构建了系统发育树，结果显示供试菌株与鱼诺卡氏菌的进化关系密切，在系统发育树上与鱼诺卡氏菌聚为一个分支，同时结合形态学和生理生化特性，确定其均为鱼诺卡氏菌。尤其值得关注的是笔者研究首次发现斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)、杂交鲶(Silurus soldatovi×S.asotus)感染鱼诺卡氏菌的病症。中国近年来陆续报道了鱼诺卡氏菌引起多种水产动物的疾病，如鲈(Lateolabrax japonicus)^[25]、大黄鱼(Larimichthys crocea)^[26]、乌鳢(Channa argus)^[6]、卵形鲳鲹^[5]及大口黑鲈(Microptorus salmonoides)^[4]等，还有由星状诺卡氏菌引起乌鳢、大口黑鲈^[27]及招财鱼(Osphronemus goramy)^[28]的疾病，但在笔者研究中并没有检测到星状诺卡氏菌。可见鱼诺卡氏菌在中国华南鱼类养殖区广泛分布，其中以广东地区的鱼诺卡氏菌感染率最高；星状诺卡氏菌在中国华南鱼类养殖区分布不广泛或者感染率不高，病原发生的原因和流行病规律还不清楚，有待进一步研究。

进行流行病学方面的研究，除了鉴定病原菌的种别外，还需再鉴别同种菌株之间的差异性。早期诺卡氏菌分类的研究，大都采用菌株表现型做分类的依据^[29-30]，近年来发表的报道大都采用分子分类，而笔者研究对分离菌株不仅采用了表现型分类，还采用了分子分类。对于种间亲缘关系问题，基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树和利用形态特征、生理生化特征及抗生素敏感性进行的聚类得出的结果有所差异。分子方法得到的系统发育树显示，从同一地区分离的菌株存在不同的基因型，如来自海南陵水的N07XC04与N07XC01、N07XC02和N07XC03分别在2个分支。这种结果提示，在相同或不同环境下，同一个种的菌株之间存在基因多态性，这可能是由于鱼诺卡氏菌的种内差异较大，同一种内可能存在不同的亚种；而不同养鱼场中的分离株也可属于同一基因型，如从淡水池塘养殖的杂交鲶、乌鳢及大口黑鲈分离到的N11HD01、N11NH01和N11QY01与从海水鱼分离到的菌株聚为一个组群，这可能是因为在杂交鲶、乌鳢和大口黑鲈的养殖过程中，需要投喂冰鲜鱼，而诺卡氏菌以腐生为主，在腐烂的冰鲜海鱼中较多。而通过系统聚类，15株鱼诺卡氏菌聚成的亚组群较多，揭示了鱼诺卡氏菌有着丰富的表型多样性。同时分析发现，同一组群的菌株可以来源于不同的地区，而同一个地区分离到的菌株也可以聚在不同类群中。比较不同鱼种的分离株，笔者研究收集的卵形鲳鲹分离株涵盖了几乎所有的组群。可见鱼诺卡氏菌的类群和地理环境、宿主之间没有明确的对应关系。YAMAMURA等^[31]曾以rep-PCR技术分析了从土壤、池水底泥及临床采集到的星状诺卡氏菌，结果显示3种来源的菌株可区分成不同的组群。PROVOST等^[32]利用RAPD指纹图谱技术对从3名患有长期性诺卡氏菌症的病人所分离的星状诺卡氏菌进行分析，结果显示其中1名病患同时感染了2种不同来源的菌株，而其余2名病患感染的菌株属同一株，聚类分析对判定该病属于持续性或者为复发有很大的作用。LAURENT等^[33]评估RAPD指纹图谱技术的结果，认为通过分型能有效鉴别星状诺卡氏菌菌株基因之间的差异性，可用于研究病原菌的传播及来源，实践中BL VMEL等^[34]用分析各种来源的鼻疽诺卡菌(N.farcinica)分离株，也确实能找出造成感染的来源。

由于基因序列和形态特征、生理生化特征及抗生素敏感性具有相对的独立性，在进化过程中经受不同的自然选择压力，它们进化的方式是不同的，而且往往不平行^[35]。所以基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树和利用形态特征、生理生化特征及抗生素敏感性进行的聚类结果就可能导致矛盾。综上所述，笔者很难确定哪种分类方法更可靠，但此研究结果表明鱼诺卡氏菌种内可能存在不同的亚类，可以进一步将鱼诺卡氏菌分成不同的亚种，对于基因到表型鉴定具有一定的参考价值，且对鱼诺卡氏菌病的诊断和研究有一定的指导意义；同时聚类分析可用于研究病原菌的传播及来源，对鱼诺卡氏菌病流行病学的研究也奠定了一定的基础。