Effect of Rhodopseudomonas palustris on the storage of Oocystis borgei at normal temperature
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摘要:
波吉卵囊藻(Oocystis borgei)是亚热带对虾高位池养殖水体常见的优势种，对于稳定池塘生态结构，保持良好水体环境具有重要的意义。研究常温下波吉卵囊藻的保存效果有利于波吉卵囊藻的简易保存和虾类养殖的直接投入使用，以便推动水产养殖行业的微藻生态调控。在25 ℃、30 ℃和35 ℃下研究了不同沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)浓度对波吉卵囊藻保存效果的影响。结果显示，在25 ℃、30 ℃和35 ℃下波吉卵囊藻保存的成活率、叶绿素a(Chl-a)质量浓度，以及恢复培养后的比增长率和ρ(Chl-a)与沼泽红假单胞菌添加浓度呈正相关，1.94×106个· mL-1为最佳浓度；25 ℃为最适保存温度，但是在30 ℃下保存后恢复生长时发现比增长率要比25 ℃下保存的高(0.432)。因此，25 ℃下添加沼泽红假单胞菌浓度为1.94×106个· mL-1时波吉卵囊藻的保存效果最佳，成活率达到87.5%，ρ(Chl-a)为31.14 μg · L-1，经恢复培养后比增长率为0.424，ρ(Chl-a)为55.94 μg · L-1。
Abstract:Oocystis borgei is dominant algae in subtropical prawn farming, which plays an important role in stabling pool ecological structure and regulating water quality. Study on the effect of O.borgei at normal temperature can promote simple storage and the application of O.borgei into shrimp and prawn culture, so as to promote technology of microalgae ecological management. We studied the effect of Rhodopseudomonas palustris with different concentration on the storage of O.borgei at 25 ℃, 30 ℃ and 35 ℃. The results show that, in each temperature the survival rate and chlorophyll a content of O.borgei are positively correlated withthe concentration of R.palustris, as well as itsspecific growth rate and chlorophyll a content after re-culturing. The best concentration of R.palustris is 1.94×106 cells · mL-1, and the optimal temperature for O.borgei storage is 25 ℃, while the specific growth rate of O.borgei after re-culturing at 30 ℃(0.432) is higher than that of at 25 ℃. To sum up, when 1.94×106 cells · mL-1 R.palustris added at 25 ℃, we may get the optimal O.borgei storage with thesurvival rate 87.5%and the chlorophyll a content 31.14 μg · L-1, anda good storage of O.borgei after reculturing with the specific growth rate 0.424 and the chlorophyll a 55.94 μg · L-1.
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Keywords:
- Rhodopseudomonas palustris /
- Oocystis borgei /
- storage
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罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)又名马来西亚大虾、淡水长臂大虾，隶属节肢动物门、甲壳纲、十足目、长臂虾科、沼虾属。原产于印度和东南亚，是重要的淡水经济虾类[1]。20世纪70年代，中国水产科学研究院珠江水产研究所从日本、马来西亚引进罗氏沼虾，先后采用“浓缩海水”与“人工海水”配方，人工繁殖虾苗获得成功，并向全国多个省市推广养殖。现在中国罗氏沼虾年产量为13.5×104 t，产值达30×109元[2]。近年在罗氏沼虾养殖中出现了生长速度减慢、性成熟时间提早、抗病力下降等问题，严重影响罗氏沼虾的养殖效益，也危及产品的质量安全。因此了解现有罗氏沼虾养殖种群的遗传多样性可为培育罗氏沼虾优良品种奠定基础。
近十年来针对罗氏沼虾种质遗传变异已有不少的研究报道。张海琪等[3]采用同工酶和RAPD分析缅甸罗氏沼虾野生群体和浙江养殖群体的生化遗传变异；蒋钦杨等[4]用线粒体16S rRNA基因部分片段和RFLP比较缅甸引进种子代、广西养殖群体及江苏养殖群体的遗传结构；杨学明等[5]用线粒体DNA的COI基因比较了缅甸原种F1代、江苏养殖群体和广西选育群体的遗传多样性；姚茜等[6]用线粒体控制区(D-loop)基因序列比较浙江湖州养殖群体和“南太湖1号”的遗传多样性；陈雪峰等[7]用核糖体转录间隔区2基因(ITS2)序列进行孟加拉和缅甸野生群体、浙江和广西养殖群体、以及“南太湖2号”选育群体的遗传多样性的比较。
应用微卫星标记进行罗氏沼虾遗传多样性的研究报道尚不多见，仅见CHAREONTAWEE等[8]用6个微卫星标记对泰国5个养殖群体和2个野生群体的遗传多样性进行了分析；朱其建等[9]用8个微卫星标记对16个来自于上海养殖群体的选育群体进行遗传多样性分析。广东与江苏是罗氏沼虾的两大主养区，两省的罗氏沼虾养殖产量占全国总养殖产量的近80%，同时也均为罗氏沼虾苗种主要培育基地[10]。由于罗氏沼虾引进中国的时间较长，虽然也有多次小规模的重新引种，但多数虾苗场尚缺乏科学的保种与选育技术，因此笔者研究选取广东、江苏以及泰国的罗氏沼虾养殖群体，采用微卫星标记技术进行种群遗传结构和遗传多样性的分析，旨在为罗氏沼虾的选育种工作提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验样品分别采自6个养殖场的普通养殖群体，均属非选育群体。其中在中国境内共有4个采样点，广东养殖群体1(GD1，32尾)，广东养殖群体2(GD2，30尾)，广东养殖群体3(GD3，32尾)，江苏养殖群体(JS，34尾)。在泰国境内有2个采样点，泰国养殖群体1(TG1，29尾)，泰国养殖群体2(TG2，25尾)。6个群体共计180尾。每个群体均为随机取样。分别剪取虾尾部肌肉组织，保存于95%的乙醇中。
根据GenBank上登录的罗氏沼虾微卫星序列[11-13]，选取、设计合成30对引物并进行预扩增，从中挑选12对特异性强、重复性好和多态性较高的微卫星引物(表 1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。各对引物分别带有FAM、TAMRA和HEX的特异性荧光标记用于测算扩增目的条带的大小。
表 1 用于罗氏沼虾微卫星扩增的引物序列及其退火温度Table 1. Primer sequence and annealing temperature for microsatellite marker amplification序号No. 位点loci 重复序列repeat sequence 引物序列primer sequence 片段大小production size 复性温度/℃ annealing 1 EMR-31B (CA)7 F: FAM-GCTGTGCTCCAAAATCTCTCTC
R: CTCACCCATACTTGACAACGAC210 58 2 EMR-55 (TTA)13 F: FAM-GAAGTCATCCGACAAACTTCAC
R: AGTAATCATGTGGCCTAGCCTAG200 58 3 EMR81 (CT)15 F: TAMRA-GGAACCAGTGAAAAAGCAATGA
R: GGGGTGCATTCAAAAATAGGT240 58 4 EMR85 (AG)12 F: FAM-GACGGACAGACATTCATTAGCC
R: ATTCACCCCACACTTTGACATT220 58 5 Mbr1 (GA)24 F: HEX-CCCACCATCAATTCTCACTTACC
R: TCCTTTTCACATCGTTTCCAGTC272~320 60 6 Mbr-2 (GT)22 F: HEX-TTCCCGACCAATTTCTCTTTCTC
R: GGCAAAAATGATCTTGGATTCAC298~336 60 7 Mbr-3 (AG)14 F: TAMRA-CAACTCTATGTTTCGGCATTTGG
R: GGGGAATTTTACCGATGTTTCTG232~284 62 8 Mbr-4 (GT)29 F: HEX-CCACCTACCGTACATTCCCAAAC
R: CGGGGCGACTTTTAGTATCGAC288~326 62 9 Mbr-5 (AG)25 F: HEX-CAAGGCTCGTGTCTCTTGTTTC
R: GCTTGTACTTGTTCAGCTTTTGC286~328 62 10 Mbr-9 (TG)5(AG)17 F: TAMRA-TTGTTTGCTTGTTTAGTGTCAAGG
R: CTCCAAAACCGAAAAATCCTCAC240~284 60 11 Mbr11 (AG)31 F: TAMRA-GTATTGAGAACAAAGGCGCACAG
R: ATCTCTTTCCAAAACAGGGCACA263~291 60 12 MRMB25 (CT)17 F: FAM-CCGGTCCAAAGGAATACAGA
R: GTGGGTGGTGTCCCTATGTT194~216 46 按照天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书提取罗氏沼虾肌肉组织的总DNA，并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA质量和浓度，-20 ℃保存备用。
1.2 PCR扩增与扩增产物检测
引物分为3类，分别用3种不同的荧光进行标记(FAM、TAMRA和HEX)(表 1)。PCR反应总体积为20 μL，含有10×buffer 2.0 μL、氯化镁(MgCl2)(25 mmol·L-1)0.8 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)0.4 μL、上下游引物(20 μmol·L-1)各0.4 μL、基因组DNA 40 ng、Taq酶[天根生化科技(北京)有限公司出品]1 U。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min后进入35个循环，94 ℃，30 s；55 ℃退火，30 s；72 ℃，30 s，循环结束后72 ℃再延伸10 min。
STR基因分型委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。使用DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司出品)、凝胶成像系统(Gene Genius公司出品)和3730XL测序分析仪(美国ABI公司出品)进行STR序列分析，根据每个扩增条带分子量的差异性，判断每个个体各基因座的基因型。
1.3 数据统计及分析
通过STR分型确定每个标记在每个个体中的基因型，根据条带(等位基因)的大小，按从大到小按字母排序，用POPGENE 32进行统计分析，计算各群体每一个微卫星位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、群体间遗传距离(Da)、遗传相似度(S)。FSTAT软件计算遗传分化指数(Fst)。根据Nei氏遗传距离通过MEGA 5软件利用非加权配对算术平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)构建系统树[14]。用CERVUS 3.0软件计算多态信息含量(polymorphism information content，PIC)[15]。群体间Fst、群体分子方差分析(AMOVA)采用ARLEQUIN 3.1软件进行[16]。利用STRUCTURE 2.3软件分析群体的遗传结构，再用最大似然性法分析最佳K值，即理论群体数[17]。
2. 结果
2.1 微卫星位点的多态性及群体遗传多样性
根据预扩增结果从30个微卫星位点中选取特异性强、重复性好和多态性较高的12对引物，对6个罗氏沼虾群体共180个个体的基因组DNA进行扩增，结果显示，各对引物在6个群体中均能扩增出目的条带，且表现出不同程度的多态性(表 2)。其中Na为13~28个，Ne为6.61~18.33，I为2.124~3.045，Ho为0.488~0.994，He为0.852~0.948；PIC为0.853~0.941，所检测的12个位点均属于高度多态位点(PIC＞0.5)。
表 2 罗氏沼虾12个微卫星位点的等位基因数、杂合度及多态信息含量Table 2. Number of alleles, heterozygosity and polymorphic information content of 12 microsatellite loci of M.rosenbergii位点locus 等位基因数Na 有效等位基因数Ne Shannon指数I 观测杂合度Ho 期望杂合度He 多态信息含量PIC EMR-31B 22 12.71 2.766 0.673 0.924 0.915 EMR-55 14 10.79 2.506 0.906 0.910 0.908 EMR81 23 13.72 2.853 0.980 0.930 0.919 EMR85 21 14.70 2.840 0.853 0.935 0.933 Mbr1 19 12.96 2.725 0.671 0.926 0.897 Mbr-2 13 6.61 2.124 0.691 0.852 0.853 Mbr-3 16 8.68 2.449 0.590 0.888 0.887 Mbr-4 24 18.33 3.024 0.723 0.948 0.941 Mbr-5 19 11.40 2.666 0.891 0.915 0.914 Mbr-9 28 16.57 3.045 0.713 0.943 0.939 Mbr11 17 8.41 2.439 0.488 0.884 0.886 MRMB25 14 7.88 2.321 0.994 0.876 0.876 均值mean 19.17 11.90 2.646 0.765 0.911 0.906 6个罗氏沼虾群体的遗传多样性见表 3。GD3群体的平均Na、平均Ne和I均为最高(Na=13.833，Ne=8.947，I=2.348)，而TG2的平均Na、平均Ne和I均为最低(Na=10.917，Ne=6.558，I=2.046)。Ho以GD1的最高(Ho=0.821)、TG2的最低(Ho=0.683)。He和多态信息含量则以GD3的最高(He=0.896，PIC=0.880)、TG2的最低(He=0.848，PIC=0.806)。综合上述各参数，可认为所检测的6个群体均具有较高的遗传多样性，并以广东群体3(GD3)的遗传多样性最高、泰国群体TG2的遗传多样性最低。
表 3 6个罗氏沼虾养殖群体的遗传多样性Table 3. Genetic diversity of six populations of M.rosenbergii参数index 广东1 GD1 江苏JS 广东2 GD2 广东3 GD3 泰国1 TG1 泰国2 TG2 等位基因数Na 13.000 12.750 12.000 13.833 12.500 10.917 有效等位基因数Ne 7.409 7.204 6.791 8.947 8.274 6.558 Shannon指数I 2.207 2.159 2.135 2.348 2.239 2.046 观测杂合度Ho 0.821 0.751 0.720 0.761 0.808 0.683 期望杂合度He 0.871 0.858 0.861 0.896 0.881 0.848 多态信息含量PIC 0.850 0.846 0.845 0.880 0.857 0.806 2.2 群体间的遗传分化及遗传距离分析
6个罗氏沼虾养殖群体间的Fst为0.006 1~0.093 1(表 4)，属于中低水平遗传分化(Fst＜0.15)。其中泰国群体1和泰国群体2之间遗传分化水平最低(Fst=0.006 1)，属于低程度的分化(Fst＜0.05)。而泰国群体2和广东群体1之间遗传分化水平最高(Fst=0.093 1)，两者间的分化为中等程度的分化(0.05＜Fst＜0.15)(表 4)。
表 4 6个罗氏沼虾养殖群体的遗传分化指数Table 4. Fixation index (Fst) of six populations of M.rosenbergii广东1 GD1 江苏JS 广东2 GD2 广东3 GD3 泰国1 TG1 泰国2 TG2 广东1 GD1 江苏JS 0.023 0 广东2 GD2 0.024 5 0.006 3 广东3 GD3 0.031 0 0.046 9 0.041 0 泰国1 TG1 0.071 3 0.073 4 0.074 9 0.058 4 泰国2 TG2 0.093 1 0.077 8 0.082 5 0.072 9 0.006 1 AMOVA分析结果表明，群体中仅有5.27%的遗传变异来自于群体间，94.73%的遗传变异来自于群体内(P＜0.01)，表明遗传变异主要存在于个体之间，个体间的遗传变异远大于群体间的遗传变异(表 5)。
表 5 6个罗氏沼虾养殖群体的AMOVA分析Table 5. AMOVA analysis among six populations of M.rosenbergii变异来源source of variation 自由度df 平方和sum of squares 方差组分variance component 百分率/% percentage 群体间among populations 5 108.518 0.296 76 5.273 51 群体内within populations 312 1663.064 5.330 52 94.726 49** 总变异total 317 1771.582 5.627 28 注：* *. 1 023次模拟检验后显示为极显著(P＜0.01)
Note：* *. very significance (P＜0.01) after 1 023 permutation tests6个群体间Nei氏Da为0.160 8~0.695 8，S为0.311 7~0.851 5(表 6)，其中江苏群体和广东群体2的Da最近(0.160 8)、S最高(0.851 5)，而广东群体1和泰国群体2间的Da最远(0.695 8)、S最低(0.311 7)。根据遗传距离构建的UPGMA聚类树显示6个罗氏沼虾群体聚为2个大支，3个广东群体与江苏群体聚为一支，2个泰国群体聚为另一支(图 1)。
表 6 6个罗氏沼虾养殖群体的遗传距离(对角线下)和遗传相似度(对角线上)Table 6. Nei′s genetic distance (below diagonal)and genetic similarity (above diagonal)of six populations of M.rosenbergii广东1 GD1 江苏JS 广东2 GD2 广东3 GD3 泰国1 TG1 泰国2 TG2 广东1 GD1 - 0.760 4 0.737 4 0.664 0 0.393 9 0.311 7 江苏JS 0.273 9 - 0.851 5 0.572 2 0.407 7 0.432 5 广东2 GD2 0.304 6 0.160 8 - 0.597 4 0.382 2 0.390 0 广东3 GD3 0.409 4 0.458 2 0.415 2 - 0.423 5 0.379 7 泰国1 TG1 0.611 7 0.597 1 0.661 8 0.559 3 - 0.814 2 泰国2 TG2 0.695 8 0.568 1 0.611 7 0.628 4 0.205 5 - ![]()
图 1 基于Nei′s遗传距离构建的6个罗氏沼虾群体的UPGMA聚类树Figure 1. UPGMA dendrograrn of six populations of M.rosenbergii based on Nei′s genetic distance2.3 群体遗传结构分析
利用STRUCTURE软件执行了2-7的假设K，设10次重复，根据K对应的参数、采用基于群体结构的贝叶斯分析法发现，K=4时出现平台期，推断笔者研究的所有参试个体最佳分组为4个理论群(图 2)。广东群体1、广东群体2和江苏群体群体聚为一组，广东群体3和2个泰国群体则各自成为一组。
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图 2 参试罗氏沼虾群体在K=4时的遗传结构图Figure 2. Cluster analysis based on 14 microsatellite loci for M.rosenbergii specimens from STRUCTURE (K=4)3. 讨论
微卫星标记是分布于真核生物基因组中的简单重复序列(simple sequence repeats，SSRs)，也称短串联重复序列(simple tandem repeats，STRs)。因其在基因组中分布广泛、具较高的多态性、呈共显性遗传，且由于分析方法相对简便快捷也被广泛应用于水产生物种群遗传多样性分析、种质资源保护、遗传图谱建立和QTL定位等研究中[18-20]。微卫星标记分析通常是通过PCR扩增、电泳检测和片段大小分离分析各等位基因。传统的片段分离采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合放射显影或银染的方法，其分辨率和效率均较低。笔者研究利用近年发展起来的STR分型新方法，通过荧光标记的PCR引物扩增微卫星位点区域序列，利用ABI遗传分析仪对荧光标记的DNA片段进行毛细管电泳检测，结合分子量内标计算DNA片段长度，使STR分型更高效与准确[21]。
多态信息含量(PIC)起衡量基因位点多态性的作用，通常PIC能反映出某个群体的遗传变异程度、位点多样性等[22]。笔者研究所用的12个微卫星位点的PIC介于0.853~0.941，根据BOTSTEIN等提出的划分标准，PIC＞0.5时该等位基因座位为高度多态性座位[22]，所采用的12个位点均属于高度多态(PIC＞0.5)，可用于罗氏沼虾群体的遗传多样性及遗传结构的评估。
杂合度(heterozygosity)是评价群体遗传变异的重要指标。Ho容易受样本大小的影响，而He更能够反映群体的遗传多样性，杂合度越高物种遗传多样性越丰富，对环境适应能力则越强[24-25]。CHAREONTAWEE等[8]用6个微卫星标记分析了泰国的5个养殖群体和2个野生群体，认为这些养殖群体仍具有较高的遗传多样性水平，其中2个养殖群体的遗传多样性(He均为0.73)甚至高于2个野生群体(He=0.71和0.68)。朱其建等[9]用8个微卫星标记分析采自上海地区的16个罗氏沼虾选育群体，结果显示各群体的He相差较大(0.551 9~0.733 2)。在应用微卫星标记进行生物遗传多样性分析时其结果可能受选用的标记在基因组中所处的位置、位点的多态性以及分型手段等的影响。相比于STR基因分型技术，聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率相对较低，可能会造成等位基因缺失、杂合度偏低[26]。笔者研究采用STR基因分型，结果显示6个罗氏沼虾养殖群体的平均He介于0.848~0.896，说明这6个群体均具有较高的遗传多样性与选育潜力。
遗传距离和遗传相似度是衡量群体间遗传关系的指标[27]。笔者研究结果发现，江苏群体和广东群体2的Da最近(0.160 8)、S最高(0.851 5)，说明其亲缘关系最近；而广东群体1和泰国群体2之间的遗传距离最远(0.695 8)、S最低(0.311 7)，说明其亲缘关系最远，且广东群体1和泰国群体2间的遗传分化水平也最高(Fst=0.093 1)。同时系统进化树更直观地表现出这种关系，中国的4个群体聚为一支，泰国的2个群体聚为另一支，说明泰国罗氏沼虾养殖群体和中国养殖群体的亲缘关系相对较远。
STRUCTURE软件是基于个体的遗传组成进行群体模拟分析，不受各群体样本数的影响，是群体遗传结构分析的理想工具[26, 28]。笔者研究的所有参试个体被划分为4个地理群，支持UPGMA树的聚类结果。同时遗传结构图的直观显示结果与遗传分化分析结果相吻合。广东群体1、广东群体2和江苏群体群体聚为一组，说明广东群体1、广东群体2和江苏群体之间的遗传结构相似，3个群体之间存在着一定程度的基因交换，这可能与江苏和广东两个罗氏沼虾养殖大省存在着一定程度的亲虾或苗种互相供给与交流有关。
文章所分析的罗氏沼虾养殖群体均具有较高的遗传多样性；中国养殖群体间遗传分化水平较低，但中国与泰国群体间的遗传分化程度达到中等水平，且遗传距离大、亲缘关系远，在下一步的罗氏沼虾选育种中可考虑引入泰国群体以提高选育群体的遗传多样性。
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图 1 不同沼泽红假单胞菌浓度下波吉卵囊藻的成活率(A)和叶绿素a质量浓度(B)
P1. 1.94×10个· mL-1；P2. 1.94×102个· mL-1；P3. 1.94×103个· mL-1；P4. 1.94×104个· mL-1；P5. 1.94×105个· mL-1；P6. 1.94×106个· mL-1；后图同此
Figure 1. Survival rate (A) and Chlorophyll a content (B) of O.borgei with different concentration of R.palustris
P1. 1.94×10 cells · mL-1; P2. 1.94×102 cells · mL-1; P3. 1.94×103 cells · mL-1; P4. 1.94×104 cells · mL-1; P5. 1.94×105 cells · mL-1; P6. 1.94×106 cells · mL-1; The same case in the following figures.
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图 2 恢复培养后波吉卵囊藻的比增长率(A)和叶绿素a质量浓度(B)
Figure 2. Specific growth rate (A) and chlorophyll a content (B) of O.borgei after re-culturing
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图 3 不同沼泽红假单胞菌浓度下波吉卵囊藻的成活率(A)和叶绿素a质量浓度(B)
Figure 3. Survival rate (A) and Chlorophyll a content (B) of O.borgei with different concentration of R.palustris
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图 4 恢复培养后波吉卵囊藻的比增长率(A)和叶绿素质量浓度(B)
Figure 4. Specific growth rate (A) and Chlorophyll a content (B) of O.borgei after re-culturing
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图 5 不同沼泽红假单胞菌浓度下波吉卵囊藻的成活率(A)和叶绿素a质量浓度(B)
Figure 5. Surivival rate (A) and Chlorophyll a content (B) of O.borgei with different concentration of R.palustris
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