Observation of gonad at different development stages and expression analysis of Kiss2/Kiss2r genes in Megalobrama amblycephala
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摘要:
Kiss基因(Kisspeptin)及其受体Kissr基因(Kiss receptor)组成的系统参与下丘脑-垂体-性腺轴功能的调节，在脊椎动物青春期启动的过程中发挥重要作用。该研究通过组织切片技术观察了团头鲂(Megalobrama amblycephala)卵巢和精巢的不同分期，进一步采用荧光定量PCR技术分析比较了团头鲂Kiss2和Kiss2r基因在雌、雄性腺不同时期对应的脑、垂体、性腺组织中的表达量。组织切片观察明确鉴别出团头鲂卵巢和精巢发育Ⅰ期至Ⅵ期的性腺组织结构，基因荧光定量PCR分析结果表明Kiss2/Kiss2r系统主要是通过增加团头鲂卵巢发育Ⅱ期时脑和垂体的表达量以及Ⅲ期精巢的表达量来发挥生殖启动作用。
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关键词:
- 团头鲂 /
- Kiss2/Kiss2r系统 /
- 性腺发育 /
- 基因表达
Abstract:Lots of studies have proved that Kiss gene and its receptor gene Kissr play an important role in the regulation of the gonadotropic axis, especially in the timing of puberty in vertebrates. We identified the gonad development of blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) from stage Ⅰ to stage Ⅵ using tissue slice technology, detected the Kiss2 and Kiss2r gene transcription in the brain through quantitative real time PCR (qPCR), and collected pituitary and gonad tissues of the samples during different stages. The qPCR results show that Kiss2/Kiss2r play roles in the onset of puberty in M.amblycephala by increasing the expression of pituitary and gonad during ovary development in stage Ⅱ, and the expression of testis in stage Ⅲ.
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Keywords:
- Megalobrama amblycephala /
- Kiss2/Kiss2r system /
- gonad development /
- gene expression
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脊椎动物的性成熟表现为一个复杂的调控过程，通过下丘脑-脑垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonad，HPG)这个生殖内分泌调控轴来调控其性腺发育、成熟、排精和产卵。下丘脑通过分泌促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)刺激卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黄体生成激素(luteinizing hormone，LH)的释放来实现生殖调控中的功能。近年来，越来越多的研究显示Kiss(Kisspeptin)及其受体Kissr(Kiss receptor)组成的系统通过参与调控GnRH的分泌在哺乳动物和鱼类的生殖启动、繁殖的代谢调控中发挥着重要作用[1-4]。青春期开始前后下丘脑中Kiss及其受体基因表达升高，引起受体信号转导增强，从而可以激活GnRH依赖性的LH和FSH的释放，进而诱导促性腺轴的性早熟激活。Kiss/Kissr基因具有多种同源基因和不同亚型[5]，它们在生殖调控中的作用具有物种特异性。如塞内加尔鳎(Solea senegalensis)具有2种不同剪切体Ss Kiss1r v1和Ss Kiss1r v2，它们的表达具有组织特异性。在脑部Ss Kiss1r v1的表达量远高于Ss Kiss1r v2，但是从青春期发育到成熟的过程其表达量都逐渐下降，这与鲦鱼(Pimephales promelas)和斑马鱼(Danio rerio)Kiss1ra的表达趋势一致[6-8]；在罗非鱼(Oreochromis niloticus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的青春期发育中Kiss2r的表达量却不断增加[9-10]。在塞内加尔鳎性成熟过程中性腺组织的Ss Kiss1r v1和Ss Kiss1r v2表达量并没有显著性差异，而鲻鱼(Mugil cephalus)卵巢Kiss2r的表达量在青春期发育过程逐渐增加[11]。成熟雄性罗非鱼Kiss2r表达量远高于非成熟个体[9]；条纹鲈[12](Morone)的Kiss1/Kiss1r, Kiss2/Kiss2r在青春期前都没有增加表达量，但是在雌性成熟个体中都显著增加，其中Kiss2在成熟雄性中的表达量也升高；在青春期发育早期，鲻鱼、军曹鱼、庸鲽(Hippoglossus hippoglossus)、鲦鱼脑部的Kiss2r表达量均有增加[6, 10-11, 13]。在雌性斑马鱼脑中Kiss1rb的表达量随着青春期的到来达到高峰；无论雌性还是雄性个体Kiss1ra在春期发生之前开始升高并一直保持较高状态[7]。日本鲭(Scomber japonicus)雄性个体Kiss1，Kiss2的表达量从未性成熟到精子排出一直处于下降状态，在繁殖后达到最低水平；Kiss1在雌性个体脑组织的表达量没有波动，而Kiss2的表达从非成熟时期到繁殖后一直下降；垂体Kiss1的表达量也变化不大，同时与未成熟和产卵后相比性腺中Kiss1的表达量在精子排出和卵黄形成后期明显升高[14]。在一些鱼类中也检测了Kiss/Kissr基因在不同季节的表达变化。暗纹东方鲀(Takifugu niphobles)Kiss2和Kiss2r在垂体的表达量繁殖季节高于非繁殖季节[15]；Kiss2在红海鲤(Pagrus major)的研究结果与暗纹东方鲀类似[16]。目前已对多种鱼类Kiss2/Kiss2r系统在青春期启动作用进行了研究，但国内的相关研究报道还很少。
团头鲂(Megalobrama amblycephala)属于鲤形目，鲤科，鲂属，又名武昌鱼，是中国特有的重要草食性经济鱼类之一[17]。然而因其自然分布较窄，遗传多样性基础弱小，在多年人工养殖过程中养殖群体出现了性成熟提早的不良趋势[18]。鱼类的性早熟间接影响其生长速度和肉质，对团头鲂的选育工作造成不利影响。该研究通过分析Kiss2/Kiss2r基因在团头鲂性腺发育不同阶段的表达情况，明确其在团头鲂生殖调控中的作用，为揭示团头鲂性早熟分子机制提供参考，同时为筛选团头鲂生殖内分泌调控相关功能基因提供基础信息。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验鱼取自鄂州团头鲂(武昌鱼)原种场。采集2月龄、6月龄、12月龄以及性成熟的团头鲂的性腺，采集样品的一侧性腺固定保存在Bouin′s液，用于组织切片；另一侧性腺及个体的脑和垂体先放在液氮中保存，然后转到-80 ℃冰箱，用于总RNA提取。其中Ⅰ期性腺采自2月龄团头鲂，Ⅱ期性腺采自6月龄团头鲂，Ⅲ、Ⅳ期性腺采自12月龄团头鲂，在繁殖时期以及繁殖后从性成熟团头鲂采集Ⅴ、Ⅵ期性腺。该试验对性腺发育Ⅰ到Ⅵ期的组织样品进行基因荧光定量表达分析，而成熟系数只分析性腺分期为Ⅱ到Ⅳ期的12月龄团头鲂样品。
1.2 试验方法
1.2.1 性腺组织切片
固定好的样品用梯度酒精脱水，甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度5~6 μm，H·E染色，中性树胶封片，Olympus显微观察并摄影。通过组织学观察判断性腺分期，并拍照记录，参照施瑔芳等[19]的方法进行性腺分期。从腹腔两侧分离出性腺并称质量，按此公式计算成熟系数(gonadosomatic index，GSI)成熟系数=(性腺质量/体质量)×100%。
1.2.2 Real time PCR定量分析
采集同一性腺分化时期的脑、垂体和性腺组织，每3条鱼同一组织混合在一起，雌雄分开，用于提取RNA。提取后的RNA溶于DEPC处理水后，首先采用1%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，然后使用NanoDrop 2000来检测其浓度，选取质量较好的RNA，按照TaKaRa公司TPrimeScriptⓇ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒提供的方法合成cDNA，随后以cDNA为模板使用表达引物进行PCR扩增，经琼脂糖检测合格后储存于-20 ℃备用。
使用Real time PCR方法检测性腺发育不同阶段Kiss2和Kiss2r的表达，real-time PCR在Rotor-GeneⓇ Q实时荧光定量PCR分析仪(QIAGEN)上进行。PCR反应体系20 μL，包括5倍梯度稀释的cDNA模板2 μL，10 μmol·L-1基因特异性的正反向引物各0.5 μmol·L-1，10 μL SYBR@ Premix Ex TagTM II，ddH2O 7 μL。反应条件为95 ℃，1 min；95 ℃，5 s；49.5℃ (Kiss2)/50.4 ℃ (Kiss2r) 20 s；72 ℃，25 s，并随之采集荧光信号，40个循环；随后进行融解曲线的扩增，试验设3次重复。相对定量的解析使用标准曲线的定量方法，内参基因选择β-actin，基因表达所用引物应用Primer 5.0设计(表 1)。试验数据分析采用SPSS 19.0软件的单样本t检验，当P < 0.05时为差异显著，相关图表通过Excel 2003和SigmaPlot 12.0进行制作。
表 1 基因荧光定量PCR所用引物序列Table 1. Sequences of primers used for genes qPCR基因 genes 引物序列 primer sequence (5′→3′) Kiss2 (GenBank: KC136218) F: CGTCAGAGTCCGTAGTTGTC R: ACTCCAAGCAGCACTATCTC Kiss2r (GenBank: KC146704) F: GGCCACTAACTTCTACATTGC R: ATGGCCATTGTCCTTGAAA β-actin (GenBank: AY170122.2) F: CGGACAGGTCATCACCATTG R: CGCAAGACTCCATACCCAAGA 2. 结果
2.1 精巢发育组织结构
Ⅰ期精巢外观呈细线状，精小叶未形成，精巢中分布有大量精原细胞，精原细胞圆形，细胞质为弱嗜碱性(图 1-a)。Ⅱ期精巢，细带状，不透明，血管不发达，精小叶形成，细胞时相仍是精原细胞(图 1-b)。Ⅲ期精巢外观呈棒状，血管发达，精小叶出现腔，生殖细胞包含精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞以及少量精子细胞。初级精母细胞沿精小叶边缘单层或多层排列(图 1-c)。Ⅳ期精巢乳白色，表面有血管分布。此期晚期能挤出白色精液。切片观察可以看到精小叶腔内充满大量染色很深的精子(图 1-d)。Ⅴ期精巢发育很成熟，乳白色，精小叶腔扩大，提起头部或轻压腹部时有大量精液流出。显微镜下看到大量成片染成紫色的精子(图 1-e)。Ⅵ期精巢由于精子排出，所以呈松弛的细带状。切片显示，精巢壁增厚，精小叶边缘的精小囊萎缩，精小叶腔中只有少量精子(图 1-f)。
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图 1 团头鲂精巢发育各时期的切片组织结构a. Ⅰ期精巢(×400)；b. Ⅱ期精巢(×400)；c. Ⅲ期精巢(×400)；d. Ⅳ期精巢(×100)；e. Ⅴ期精巢(×100)；f. Ⅵ期精巢(×100)；SG. 精原细胞，SL. 精小叶，PSC. 初级精母细胞，SSC. 次级精母细胞Figure 1. Microstructure of M.amblycephala in different testis development stagesa. testis at stage Ⅰ(×400);b. testis at stage Ⅱ(×400);c. testis at stage Ⅲ(×400);d. testis at stage Ⅳ(×100);e. testis at stage Ⅴ(×100);f. testis at stage Ⅵ(×100);SG. spermatogonium; SL. seminal lobule; PSC. primary spermatocytes; SSC. seeondary speratoeytes2.2 卵巢发育组织结构
Ⅰ期卵巢的整体外部形态是细线状，胞体最小，胞质最少，核大而明显，具有活跃的分裂能力(图 2-a)。Ⅱ期卵巢透明，扁平带状，肉眼看不到卵粒。这一时期的初级卵母细胞呈多角形，核仁数增加，靠近核膜内侧分布。在细胞质中出现卵黄核(图 2-b)。Ⅲ期卵巢明显变大呈棒状，肉眼可见细小的卵粒。显微镜下观察卵巢中以Ⅲ时相的卵母细胞为主，出现液泡，卵母细胞开始沉积卵黄且直径不断扩大，卵质中尚未完全充塞卵黄，卵膜变厚，外周出现辐射带(图 2-c)。Ⅳ期卵巢明显膨胀，呈囊状，肉眼可见增大的卵粒；卵黄颗粒几乎充满核外空间。细胞核开始由中央直接移向动物极(图 2-d)。Ⅴ期卵巢完全成熟，卵巢松软，卵已排于卵巢腔中，轻压腹部即有成熟卵流出。这一时相的细胞由初级卵母细胞向次级卵母细胞过渡阶段。细胞质中充满粗大的卵黄颗粒(图 2-e)。Ⅵ期卵巢囊状，组织松软，体积缩小。卵巢中含有大量空滤泡以及Ⅱ和Ⅲ时相的卵母细胞(图 2-f)。
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图 2 团头鲂卵巢发育各时期的切片组织结构a. Ⅰ期卵巢(×100)；b. Ⅱ期卵巢(×400)；c. Ⅲ期卵巢(×400)；d. Ⅳ期卵巢(×100)；e. Ⅴ期卵巢(×100)；f. Ⅵ期卵巢(×100)；Og. 卵原细胞；YN. 卵黄核；ZR. 辐射带；V. 液泡；DF. 空滤泡Figure 2. Microstructure of M.amblycephala in different testis development stagesa. ovary at stage Ⅰ(×100);b. ovary at stage Ⅱ(×400);c. ovary at stage Ⅲ(×400);d. ovary at stage Ⅳ(×100);e. ovary at stage Ⅴ(×100);f. ovary at stage Ⅵ(×100);Og. oogonium; YN. yolk nucleus; ZR. zona radiata; V. vesicles; DF. discharged follicles2.3 Kiss2/Kiss2r在性腺不同发育时期的表达
提取的组织样品RNA经过1%的琼脂糖电泳检测，完整性良好，无明显降解现象，能够用于下一步试验(图 3)。Kiss2在雄鱼性腺不同发育时期对应的脑和垂体组织中的表达变化趋势基本一致，在Ⅱ期和Ⅴ期出现峰值，精巢中的表达量趋势也类似，但在Ⅲ期表达量出现最大值；而在雌鱼卵巢/垂体和脑组织中表达模式一致，都是在性腺发育Ⅱ期时表达量最高；并且Kiss2在雌、雄个体脑和垂体组织中的表达模式类似(图 4)。Kiss2r在雄鱼性腺发育Ⅰ期的脑和垂体的表达量较高，此后一直下降，但是在精巢组织中的表达却处于不断的波动状态，并在Ⅲ期表达量出现最大值；在雌鱼脑和垂体的表达变化较为明显，脑和垂体在Ⅱ期和Ⅵ期表达较高；而在卵巢中一直比较平稳(图 5)。总体来说，Kiss2/Kiss2r在雄鱼不同组织中的表达模式不同，但是在性腺发育到Ⅲ期时都具有较高的表达量；而在雌鱼脑和垂体的表达模式类似，只是Kiss2r在卵巢中的表达较为平稳，在所检测的表达时期其表达变化具有显著性差异(P < 0.05)。
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图 4 Kiss2基因在团头鲂雌性(a)和雄性(b)个体性腺发育不同时期的表达分析Figure 4. qPCR expression level of Kiss2 during different gonad development stages in females (a) and males (b) M.amblycephala![]()
图 5 Kiss2r基因在团头鲂雌性(a)和雄性(b)个体性腺发育不同时期的表达分析Figure 5. qPCR expression level of Kiss2r during different gonad development stages in females (a) and males (b) M.amblycephala3. 讨论
团头鲂正常性成熟年龄为2~3龄，该研究通过对采集的团头鲂样品进行性腺组织切片观察，结果显示12月龄的团头鲂存在性早熟现象，其性腺已经发育到Ⅳ期，部分个体的成熟系数达到5.58% 甚至9.52%。统计分析显示12月龄团头鲂个体生长速度与性腺发育程度是显著相关的(P < 0.05)，说明性成熟前团头鲂12月龄个体的性腺发育进程与营养生长是正相关的(表 2)，生长控制因素和生殖调控因素是互相促进，共同实现生长和生殖的发育；也说明性早熟个体的生长速度减慢是发生在其性早熟之后。
表 2 12月龄团头鲂样品信息表Table 2. Characteristics of collected one year old M.amblycephala编号
No.体质量/g
body weight体长/cm
body length性腺质量/g
gonad weight性腺分期
gonad stage成熟系数/%
GSI1 35.69 13.40 0.12 Ⅱ 0.30 2 31.28 12.70 0.18 Ⅱ 0.58 3 102.37 16.83 0.57 Ⅱ 0.56 4 39.14 13.51 0.50 Ⅱ 1.28 5 90.42 16.21 0.70 Ⅱ 0.77 6 146.69 18.70 0.64 Ⅱ 0.44 7 39.47 13.21 0.66 Ⅲ 1.67 8 113.30 18.12 1.18 Ⅲ 1.04 9 170.32 20.19 0.38 Ⅲ 0.22 10 78.96 15.32 1.68 Ⅲ 2.13 11 156.70 19.54 3.85 Ⅲ 2.46 12 134.60 18.52 2.58 Ⅲ 1.92 13 108.59 17.43 2.41 Ⅲ 2.22 14 79.56 15.60 1.98 Ⅲ 2.49 15 115.69 17.40 1.89 Ⅲ 1.63 16 111.42 16.80 1.96 Ⅲ 1.76 17 62.38 14.80 0.64 Ⅲ 1.03 18 120.12 17.80 0.60 Ⅲ 0.50 19 122.89 18.50 0.92 Ⅲ 0.75 20 75.05 15.21 1.54 Ⅲ 2.05 21 73.27 15.09 1.46 Ⅲ 1.99 22 75.15 15.22 1.67 Ⅲ 2.22 23 63.32 14.51 0.96 Ⅲ 1.52 24 64.67 14.45 0.73 Ⅲ 1.13 25 82.60 16.40 4.61 Ⅳ 5.58 26 128.49 18.20 5.04 Ⅳ 3.92 27 129.28 18.70 4.50 Ⅳ 3.48 28 137.86 19.30 4.84 Ⅳ 3.51 29 132.80 19.60 12.64 Ⅳ 9.52 30 136.04 18.90 4.98 Ⅳ 3.66 笔者研究应用qPCR检测了团头鲂性发育、成熟过程中Kiss2/Kiss2r基因cDNA在性腺、脑、垂体组织中的表达变化情况。结果显示Kiss2在雄性个体Ⅲ精巢组织中的表达量出现较高峰值，说明Kiss2在团头鲂雄性生殖启动中发挥重要作用[20]。但是，Kiss2基因在雌性个体性腺、脑和垂体中的表达量在卵巢发育Ⅱ期出现高表达，而后逐渐下降，提示Kiss2在雌性生殖轴中的功能主要是在生殖启动早期，在斑马鱼、鲦鱼中的研究结果也发现类似的表达模式[7-8]；在性腺Ⅵ期表达量明显升高，进一步说明其对Ⅱ时相生殖细胞的发育具有调控作用。Kiss2r在雄性个体的生殖发育过程其脑和垂体的表达量一直在降低，而在雌性个体的Ⅰ期性腺表达量处于较低值，说明Kiss2r基因在脑部的表达具有雌雄差异[21](P < 0.05)；但是在Ⅲ期精巢的表达量出现最大值，也提示精巢是Kiss2r对雄性团头鲂体现其生殖启动功能的主要靶组织；在雌性团头鲂的性成熟过程中，Kiss2r在脑和垂体的表达量出现波动，在Ⅱ期和Ⅵ期较高，表明脑和垂体是其主要功能区域，其对生殖启动的调控作用主要是在生殖细胞发育到Ⅱ时相时进行；但是Kiss2r在卵巢组织中Ⅰ到Ⅴ期都没有表达，可能对团头鲂第一次性成熟前的生殖启动不发挥作用，在小鼠(Mus musculus)的性腺发育过程中也有同样的发现[22]。Kiss2/Kiss2r在Ⅲ期精巢组织和卵巢发育到Ⅱ期时的团头鲂脑和垂体组织中的高表达说明Kiss2和Kiss2r是协同作用，共同实现生殖启动功能。Kiss2/Kiss2r在团头鲂雌雄生殖细胞从不成熟到生殖成熟的生殖启动过程发挥作用，能够刺激卵黄形成和精子发生；有学者认为雄鱼进入生殖启动时期是以精子的发生为标志，而雌鱼是以卵黄形成为标志[23]，笔者研究显示Kiss2/Kiss2r系统对团头鲂生殖启动调控的作用机制与这一观点是完全相符的。从生殖启动开始, 机体的主要能量也逐渐转移到生殖发育上去，因此Kiss2/Kiss2r可能涉及团头鲂性早熟相关调控机制，但其具体的作用机制还需要进一步的研究。
笔者研究结合团头鲂性腺发育组织切片观察及Kiss2/Kiss2r基因cDNA在其性腺发育不同时期的表达量分析，认为Kiss2/Kiss2r系统对团头鲂生殖调控的作用机制主要是在卵巢发育到Ⅱ期和精巢Ⅲ期时发挥作用，并且该基因系统可能涉及性早熟的调控机制。该研究结果为今后筛选团头鲂生殖内分泌调控相关功能基因以及相关选育研究提供了基础数据。
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图 1 团头鲂精巢发育各时期的切片组织结构
a. Ⅰ期精巢(×400)；b. Ⅱ期精巢(×400)；c. Ⅲ期精巢(×400)；d. Ⅳ期精巢(×100)；e. Ⅴ期精巢(×100)；f. Ⅵ期精巢(×100)；SG. 精原细胞，SL. 精小叶，PSC. 初级精母细胞，SSC. 次级精母细胞
Figure 1. Microstructure of M.amblycephala in different testis development stages
a. testis at stage Ⅰ(×400);b. testis at stage Ⅱ(×400);c. testis at stage Ⅲ(×400);d. testis at stage Ⅳ(×100);e. testis at stage Ⅴ(×100);f. testis at stage Ⅵ(×100);SG. spermatogonium; SL. seminal lobule; PSC. primary spermatocytes; SSC. seeondary speratoeytes
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图 2 团头鲂卵巢发育各时期的切片组织结构
a. Ⅰ期卵巢(×100)；b. Ⅱ期卵巢(×400)；c. Ⅲ期卵巢(×400)；d. Ⅳ期卵巢(×100)；e. Ⅴ期卵巢(×100)；f. Ⅵ期卵巢(×100)；Og. 卵原细胞；YN. 卵黄核；ZR. 辐射带；V. 液泡；DF. 空滤泡
Figure 2. Microstructure of M.amblycephala in different testis development stages
a. ovary at stage Ⅰ(×100);b. ovary at stage Ⅱ(×400);c. ovary at stage Ⅲ(×400);d. ovary at stage Ⅳ(×100);e. ovary at stage Ⅴ(×100);f. ovary at stage Ⅵ(×100);Og. oogonium; YN. yolk nucleus; ZR. zona radiata; V. vesicles; DF. discharged follicles
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图 4 Kiss2基因在团头鲂雌性(a)和雄性(b)个体性腺发育不同时期的表达分析
Figure 4. qPCR expression level of Kiss2 during different gonad development stages in females (a) and males (b) M.amblycephala
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图 5 Kiss2r基因在团头鲂雌性(a)和雄性(b)个体性腺发育不同时期的表达分析
Figure 5. qPCR expression level of Kiss2r during different gonad development stages in females (a) and males (b) M.amblycephala
表 1 基因荧光定量PCR所用引物序列
Table 1 Sequences of primers used for genes qPCR
基因 genes 引物序列 primer sequence (5′→3′) Kiss2 (GenBank: KC136218) F: CGTCAGAGTCCGTAGTTGTC R: ACTCCAAGCAGCACTATCTC Kiss2r (GenBank: KC146704) F: GGCCACTAACTTCTACATTGC R: ATGGCCATTGTCCTTGAAA β-actin (GenBank: AY170122.2) F: CGGACAGGTCATCACCATTG R: CGCAAGACTCCATACCCAAGA 
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表 2 12月龄团头鲂样品信息表
Table 2 Characteristics of collected one year old M.amblycephala
编号
No.体质量/g
body weight体长/cm
body length性腺质量/g
gonad weight性腺分期
gonad stage成熟系数/%
GSI1 35.69 13.40 0.12 Ⅱ 0.30 2 31.28 12.70 0.18 Ⅱ 0.58 3 102.37 16.83 0.57 Ⅱ 0.56 4 39.14 13.51 0.50 Ⅱ 1.28 5 90.42 16.21 0.70 Ⅱ 0.77 6 146.69 18.70 0.64 Ⅱ 0.44 7 39.47 13.21 0.66 Ⅲ 1.67 8 113.30 18.12 1.18 Ⅲ 1.04 9 170.32 20.19 0.38 Ⅲ 0.22 10 78.96 15.32 1.68 Ⅲ 2.13 11 156.70 19.54 3.85 Ⅲ 2.46 12 134.60 18.52 2.58 Ⅲ 1.92 13 108.59 17.43 2.41 Ⅲ 2.22 14 79.56 15.60 1.98 Ⅲ 2.49 15 115.69 17.40 1.89 Ⅲ 1.63 16 111.42 16.80 1.96 Ⅲ 1.76 17 62.38 14.80 0.64 Ⅲ 1.03 18 120.12 17.80 0.60 Ⅲ 0.50 19 122.89 18.50 0.92 Ⅲ 0.75 20 75.05 15.21 1.54 Ⅲ 2.05 21 73.27 15.09 1.46 Ⅲ 1.99 22 75.15 15.22 1.67 Ⅲ 2.22 23 63.32 14.51 0.96 Ⅲ 1.52 24 64.67 14.45 0.73 Ⅲ 1.13 25 82.60 16.40 4.61 Ⅳ 5.58 26 128.49 18.20 5.04 Ⅳ 3.92 27 129.28 18.70 4.50 Ⅳ 3.48 28 137.86 19.30 4.84 Ⅳ 3.51 29 132.80 19.60 12.64 Ⅳ 9.52 30 136.04 18.90 4.98 Ⅳ 3.66
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期刊类型引用(1)
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