Studies on fin tissues cultivation, Ag-NORs and C-banding patterns of Pseudorasbora parva
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摘要:
采用组织块贴壁培养法探索麦穗鱼(Pseudorasbora parva)鳍组织细胞的短期培养，同时对其染色体Ag-NORs和C-带进行了初步研究。结果显示：1)麦穗鱼鳍组织培养的最适培养基为MEM培养基，细胞在组织块贴壁后第6天迁出，经传代后细胞形态呈成纤维状；2)其染色体具有1对Ag-NORs，位于第23对染色体短臂末端，其NORs具多态性，未见Ag-NORs联合现象；3)其染色体C-带主要为端粒和着丝点C-带，少数为居间C-带，其中第23对染色体的短臂大部分呈现C-带强阳性，与Ag-NORs区域对应。
Abstract:We investigated short-term fin tissues cultivation of Pseudorasbora parva by explant technique, and studied its Ag-NORs, and C-banding patterns at the same time. Results are as follows: 1) Cells from the fin tissues of P.parva migrate out around tissues at 6th day through MEM medium, the most suitable one, and are fibroblast-like during cultivation; 2) A pair of Ag-NORs is found on the end of No.23 chromosome short arm, and the NORs are polymorphic, while no Ag-NORs combination has happened in this fish; 3) C-bands are located mainly in the terminal and centromere regions of chromosomes, and a few in the interstitial regions. In particular, most of the short arm on chromosome No.23 shows strong positive C-bands, which is corresponded with Ag-NORs region.
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Keywords:
- Pseudorasbora parva /
- cell culture /
- chromosome /
- Ag-NORs /
- C-banding
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转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)超家族是一类多效应细胞因子，在抑制肿瘤、细胞增殖、细胞分化、组织形成、世系决定、细胞迁移和细胞凋亡等多种生理过程中发挥重要作用[1]。TGF-β超家族成员包括转化生长因子β(TGF-β)、活化素(activin)和节/骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)3个家族。狭义上的TGF-β通常指的是TGF-β家族。TGF-β既能促进细胞增殖，又能抑制细胞增殖；能控制细胞外基质的形成，如促进胶原蛋白的合成；通过调节细胞外基质诱导细胞凋亡和调控形态发生；TGF-β也是一种神经蛋白，能刺激神经生长因子的形成[2]。研究表明，TGF-β系统与人类多种疾病有重大关联，如心脏疾病[3]、微血管疾病[4]和癌症[5]等。在哺乳动物中对TGF-β及其受体的报道每年有数百篇，足以说明TGF-β系统的重要性。近年来，有许多学者在低等脊椎动物中对TGF-β系统进行了研究，而鱼类具有其独特的生活环境和进化历史上的特殊意义，因此TGF-β系统在低等脊椎动物中的研究又集中在鱼类上。
1. TGF-β介绍
TGF-β第一次是从人胎盘中发现的[6]，在哺乳动物中已发现了3种TGF-β(1/2/3)，其中TGF-β1在免疫系统中发挥主要功能[7]。在鸟类中发现有3种TGF-β(TGF-β2/3/4)，两栖类中发现有2种TGF-β(TGF-β2/5)，已有证据表明鸟类的TGF-β4和两栖类的TGF-β5是TGF-β1进化的前体，因此也称之为TGF-β1[8]。到目前为止，在硬骨鱼中发现了4种TGF-β(TGF-β1/2/3/6)。
哺乳动物TGF-β主要是由T细胞产生，但是在其他的细胞中都有表达。其他主要来源包括血小板、巨噬细胞、噬中性粒细胞、骨和软组织如胎盘、肾、子宫内膜和疾病细胞，通过自分泌和旁分泌的方式产生[2]。
哺乳动物中的3种TGF-β都可以在转录水平进行调控。TGF-β2和TGF-β3的启动子都包含有TATAA框和一个普通的近端CRE-ATF位点，这说明这些启动子都服从激素和发育调控[9]。TGF-β1的启动子缺少经典的TATAA框，但是有多元的调控位点，能够被c-jun、c-Fos和egr-1以及很多的致癌基因如abl、fos、jun、ras和src激活[10]。TGF-β1启动子的活性能被肿瘤抑制物所抑制[11]。低等脊椎动物中目前尚未见有关TGF-β转录调控方面的研究报道。
TGF-β是以前体蛋白的形式编码，每种TGF-β都是由一个单独的基因编码。TGF-β蛋白前体在细胞内经过一系列的加工过程后才分泌到细胞外。其中最重要的一步是前体蛋白的水解，将前体蛋白的N端切掉，是在高尔基体中由弗林蛋白酶(Furin-like peptidase)水解[12]。另有研究表明C型胶原蛋白酶也能裂解此位点[13]，切掉的N端多肽又会形成二聚体，称为潜在关联蛋白(latency-associated protein，LAP)，它与成熟TGF-β同型二聚体非共价结合，该复合体称为潜在的TGF-β(latent TGF-β，L-TGF-β)或小潜在复合体(small latent complex，SLC)。该复合体可以直接分泌到细胞外，或者再与潜在TGF-β结合蛋白(latent TGF-β binding protein，LTBP)相结合形成一个大的潜在复合体(large latent complex，LLC)而分泌，LTBP在使TGF-β靶向细胞外基质中发挥重要作用[14-15]。
哺乳类TGF-β1 LAP(LAP-1)的结构被广泛研究，LAP-1包含N端连接的糖链，其中2个含有甘露糖-6-磷酸基团，可以与细胞表面的甘露糖-6-磷酸盐/胰岛素样生长因子Ⅱ受体相互作用[16]。人类LAP-1含有3个半胱氨酸残基，223和225位置上的半胱氨酸对LAP形成链间二硫键十分重要。在223和225位置上的半胱氨酸用丝氨酸代替后，TGF-β1可直接以活性的形式分泌，表明这2个位置的半胱氨酸对LAP-1和TGF-β1的结合非常重要。此外，第33位的半胱氨酸与LTBP的结合有关[17]。LTBP具有15~19个表皮生长因子(EGF)样重复和多个半胱氨酸残基。LTBP的另一个功能是在高尔基体与L-TGF-β结合使SLC快速分泌。然而LTBP被广泛研究的功能是使L-TGF-β定位到细胞外基质，从而形成一个细胞外基质中的TGF-β库[18]。
TGF-β与LAP和LTBP结合时不能直接与受体结合，需要从复合物中释放出活性形式的TGF-β。在体外可以通过pH(2和8)、加热(100 ℃)或某些蛋白酶等条件使其释放[15]。至于在体环境是通过什么机制释放出活性的TGF-β，目前并没有确切的定论。但是学者们提出了几种假说，包括：1)通过反式谷氨酰胺酶水解活化假说[15]；2)通过与血小板反应素物理接触改变LAP构想假说[19]；3)表皮细胞αvβ6整联蛋白机械牵引假说[20-21]。
近期有报道MG63骨肉瘤细胞分泌到胞外的热休克蛋白HSP90β会抑制潜在TGF-β1的激活[22]。
2. TGF-β受体及信号通路
TGF-β受体的发现，最早是通过将125I-TGF-β化学交联到细胞表面的结合蛋白，再用凝胶电泳的方法分离交联上的配体受体复合体物，发现大多数细胞有3种膜表面的TGF-β结合蛋白，根据电泳的迁移率命名为Ⅰ型, Ⅱ型和Ⅲ型[23-24]。TGF-β Ⅰ型受体(TGF-β Receptor Ⅰ，TβRⅠ)和Ⅱ型受体(TGF-β Receptor Ⅱ，TβRⅡ)主要介导TGF-β的信号转导，这2种受体均为有单跨膜结构域的丝氨酸-苏氨酸激酶，氨基酸序列具有相当大的同源性[25]。一般TβRⅠ比TβRⅡ氨基酸序列要少。对人TβRⅡ氨基酸分析表明含有一个信号肽、一个136个氨基酸的N-糖基化的胞外结构域和一个主要是由激酶结构域组成的胞内结构域。2种受体胞外部分含有多个半胱氨酸，包括一个由3个半胱氨酸组成的半胱氨酸簇，表明受体自身的折叠和与配体的结合需要有很多二硫键。TβRⅠ和TβRⅡ均会形成同源二聚体，该二聚体的形成不依赖于配体结合。TβRⅠ在激酶结构域之前有一个SGSGSGLP的高度保守序列标签(GS结构域)[25]。TβRⅠ和TβRⅡ示意图见图 2-a。从目前研究结果来看，脊椎动物的TGF-β受体在结构上非常保守。
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图 2 TβRI/TβRⅡ四聚体示意图(a)，R-Smad 2和R-Smad 3结构示意图[26]，MH，Mad同源结构域(b)Figure 2. Proposed basic tetrameric complex of TβRI/TβRⅡ(a), basic schematic of R-Smad 2 and R-Smad 3 structure, MH, Mad Homology domain(b)TGF-β Ⅲ型受体(TGF-β Receptor Ⅲ，TβRⅢ)，又称β蛋白聚糖，在很多种类的细胞中都有表达，是表达量最高的TGF-β受体。TβRⅢ也是跨膜受体，但是缺少酶的基序，不能直接与配体结合。因此认为TβRⅢ在TGF-β信号中发挥间接功能[25]。
成熟的TGF-β二聚体到达目标细胞表面时，与TβRⅡ同源二聚体结合，TβRⅡ激酶活性使其自身磷酸化，TGF-β-TβRⅡ复合物向TβRⅠ二聚体靠近，并磷酸化TβRⅠ而激活其激酶活性。因此活化的配体受体复合物是一个异源的六聚体，由1个TGF-β二聚体以及TβRⅠ和TβRⅡ各自的同源二聚体组成[27]。随后TβRⅠ磷酸化细胞内的Smad蛋白。脊椎动物Smad蛋白可以分为3个亚族：受体活化型Smad(R-Smad)、通用介导型Smad 4(Co-Smad)和抑制型Smad(Ⅰ-Smad，Smad 6和Smad 7)[28]。R-Smad包括BMP活化型(Smad 1、Smad 5、Smad 8)和TGF-β活化型(Smad 2、Smad 3)。R-Smad和Co-Smad是由2个Mad同源结构域(MH 1和MH 2)组成，通过连接区连接(图 2-b)。Ⅰ-Smad没有明显的MH1结构域，只有MH2结构域。非洲爪蟾(Xenopus laevis)有2种Smad 4，Smad 4α和Smad 4β，由2个基因编码。虽然2种Smad 4的氨基酸具有80%的同源性，但是其发育表达模式、亚细胞定位(Smad 4α主要在细胞质中，Smad 4β主要在细胞核中)和磷酸化水平截然不同。非洲爪蟾Smad 4β具有强的腹部形成诱导功能[29]。TβRⅠ磷酸化激活后使R-Smad C端SSXS基序磷酸化，SSXS基序在所有R-Smad中都是高度保守的，随后R-Smad与TβRI分离，与Smad 4形成复合物后进入细胞核，再与一些转录因子结合激活基因的转录[2]。尽管Co-Smad 4能够帮助R-Smad进入细胞核，但是R-Smad在没有Co-Smad 4的情况下也能进入到细胞核[20, 30]。R-Smad蛋白招募至受体复合物是由辅助蛋白介导的，例如Smad锚向受体活化蛋白(SARA)[31]。TGF-β与受体结合后，Smad 2和Smad 3被TβRⅠ磷酸化激活，再与Smad 4一起形成复合体进入细胞核，作用于Smad结合元件(Smad Binding Elements，SBE)。Ⅰ-Smad抑制TGF-β信号通过以下几种途径：1)与R-Smad竞争结合TβRⅠ；2)招募E3泛素连接酶Smurf 1/2使TβRⅠ泛素化而随之降解；3)与Smad 4作用，阻止R-Smad-Smad 4复合物的形成；4)直接抑制Smad引起的转录应答[20, 31]。一种重要抑制Smad功能的方式是招募Smad协同抑制因子，如c-Ski和SnoN[32-33]。
TGF-β信号的负调控有如下几个方面：1)通过Smurf途径使TGF-β受体降解；2)抑制TGF-β受体的活性；3)通过磷酸酶终结Smad信号；4)通过E3泛素连接酶关闭R-Smad和Smad 4；5)隔离Smad使其不参与活化的信号通路；6)抑制Smad的转录活性；7)Smad转录后修饰之间的竞争以及稳定性和活力之间的相互作用[31]。有些TGF-β的负调节因子，如Ⅰ-Smad和SnoN都是TGF-β直接作用的目的基因。
TGF-β除了能激活Smad依赖性通路外，也可以激活其他一些Smad非依赖性信号通路。已经证明，TGF-β刺激细胞后能快速激活Ras-Erk、TAK-MKK4-JNK、TAKMKK3/6-p38、Rho-Rac-cdc42 MAPK和PI3K-Akt通路，但是详细的机制目前并没有阐明[20]。TGF-β引起的Erk和JNK途径的激活可以导致Smad的磷酸化并调节Smad的激活。此外，TGF-β引起的Ras/Erk MAPK通路的激活会刺激TGF-β的表达，从而放大TGF-β的应答和导致二次TGF-β应答[34]。TGF-β1在CD4+T细胞中对IFN-γ引起的信号和Th1基因表达的抑制作用是Smad 3非依赖性的，但是MEK/ERK依赖性的[35]。最近又在小鼠(Mus muscculus)中发现TGF-β诱导IKK，p38和JNK的激活需要TAK1赖氨酸158残基[36]。
3. TGF-β及其受体在鱼类中的研究进展
3.1 TGF-β1在鱼类中的研究进展
TGF-β在鱼类中的研究还处于初步阶段，但是最近几年有关的研究也逐步增多，主要集中在TGF-β1。
3.1.1 与免疫和疾病相关
目前研究表明，TGF-β1与鱼类的免疫功能有着巨大的关系。ZHAN等[37]从鲤(Cyprinus carpio)活化的头肾淋巴细胞中克隆得到第一个鱼类的TGF-β1基因，其ORF编码376个氨基酸，包括与其他TGF-β蛋白一样的保守半胱氨酸。鲤TGF-β1在头肾、脾、卵和肝脏的表达量很少，但是用伴刀豆球蛋白A(Con A)激活头肾淋巴细胞后TGF-β1 mRNA水平会明显上升。HARMS等[38]从杂交狼鲈(Morone saxatilis×M.chrysops)头肾单核细胞中克隆到TGF-β1基因，其mRNA表达水平在外周血单核细胞中比脾和头肾中要高，初步显示TGF-β1的功能与免疫机制相关。笔者实验室也发现用聚肌胞苷酸(Poly I: C)或Con A刺激斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)头肾淋巴细胞后，TGF-β1表达量明显上升，与在其他鱼中具有相似性[39]。YANG等[40]报道从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)中克隆到TGF-β1 cDNA全长，组织分布表明TGF-β1 mRNA主要在胸腺、头肾和脾中大量分布，并发现重组人TGF-β1蛋白能诱导外周血淋巴细胞(PBL)增殖，但是也能显著抑制植物血凝集素(PHA)和脂多糖(LPS)刺激的PBL增殖，而且和脂多糖一样能显著上调草鱼MHCⅠmRNA表达。HADDAD等[41]从金鱼(Carassius auratus)中克隆到TGF-β1 cDNA序列。重组表达的金鱼TGF-β1成熟肽以剂量依存的方式促进金鱼成纤维细胞系(CCL71)的增殖。此外，重组的金鱼TGF-β1能够下调TNF-α活化的巨噬细胞一氧化氮应答。这是首次对硬骨鱼TGF-β1功能的报道。CAI等[42]报道真鲷(Pagrus major)的TGF-β1在诱导淋巴细胞迁移中具有两极特性。重组真鲷TGF-β1以剂量依赖的方式显著促进头肾和外周血淋巴细胞的迁移，但又能够抑制由LPS激活的淋巴细胞迁移。这是首次在鱼类中报道TGF-β1在调节鱼类免疫功能中具有天生的两极特性。最近，YANG等[43]又报道在草鱼白细胞中TGF-β1表现出对立的效应。TGF-β1能持续刺激外周血白细胞的活力和促炎症因子(TNF-α和IFN-γ)与T/B细胞标签[Cd4-like (Cd4l)，Cd8α，Cd8β和Ig μ]的产生，但是在头肾白细胞中却相反。并表明TGF-β1可能通过下调ALK5 mRNA和蛋白水平，使草鱼白细胞对TGF-β1的敏感性下降。再次证明在硬骨鱼免疫功能中TGF-β1发挥正调控和负调控双重功能。
除了从理论上研究TGF-β1与免疫功能相关，有直接的研究表明TGF-β1与鱼类疾病有关。HARMS等[44]报道，用海鱼杆菌(Mycobacterium marinum)感染条纹狼鲈(M.saxatilis)，其脾单核细胞TGF-β1 mRNA表达比未感染组要低，但是感染的杂交罗非鱼(Oreochromis spp.)和未感染鱼之间没有明显的变化。JOHNSON等[45]报道给大西洋油鲱(Brevoortia tyrannus)体腔注射去炎松导致其脾单核细胞TGF-β1 mRNA水平受到抑制，提示可能与大西洋油鲱发育过程中溃疡性皮肤损害的机制有关。LILLEENG等[46]报道在用大豆粉饲养大西洋鲑(Salmo salar)时TGF-β1明显下调，提示有可能和大西洋鲑大豆肠病的发病机理有关。已经报道用来源于欧鲶(Silurus glanis)和褐篮子鱼(Siganus fuscescens)的虹彩病毒(family Iridoviridae)刺激鱼的上皮瘤细胞后，引起TGF-β1短暂上升[47]；嗜冷黄杆菌感染(Flavobacterium psychrophilum)的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脾脏TGF-β1下调，表明染病的鱼免疫系统变弱[48]。最近又发现TGF-β与藻毒素引起的免疫毒性效应有关，草鱼血和头肾淋巴细胞在藻毒素刺激后，TGF-β1 mRNA水平会上升[49]。这些证据表明很多鱼类在受到病害侵袭时，TGF-β1的表达水平都会有所变化，但是TGF-β1具体是如何参与到疾病的过程中，目前还没有阐明。
3.1.2 与生殖相关
TGF-β1除了与免疫和疾病相关之外，另一个主要功能是与生殖相关。KOULI等[50]从斑马鱼(Danio rerio)的卵巢中克隆到TGF-β1的cDNA序列，TGF-β1成熟肽区域与其他物种的相似度达到70%~85%。并发现TGF-β1能以剂量依赖和时间依赖的方式显著抑制促性腺激素和17α, 20β-二羟孕酮诱导的卵母细胞成熟，首次在鱼类中证明TGF-β1能调节卵母细胞的成熟。同时证明，TGF-β/Smad信号通路在斑马鱼卵巢中存在。TAN等[51]报道TGF-β1能够抑制膜黄体酮受体[membrane progestin receptors (mPRs)]β，而不能抑制受体α，以此来调节卵母细胞的成熟。JIN等[52]报道在斑马鱼卵泡细胞中TGF-β信号需要依赖动力蛋白轻链zkm23。研究TGF-β1在生殖中的作用对鱼类的繁殖育种有着重大意义。
3.1.3 与肝脏功能相关
最近，HOBBIE等[53]报道二甲基亚硝铵处理的青鳉(Oryzias latipes)，肝脏TGF-β1表达升高，并且随着二甲基亚硝铵处理浓度的升高，胆囊上皮细胞、中间细胞、不成熟肝细胞和少量的成熟肝细胞中TGF-β1蛋白水平上升，显示TGF-β1与肝功能有关。
3.1.4 TGF-β1序列特点
从已经克隆到的鱼类TGF-β1cDNA序列分析发现，序列具有很高的保守性，与其他脊椎动物相似。它们均具有保守的9个半胱氨酸(草鱼和鲤在第7个保守半胱氨酸位点处被精氨酸代替)，这也是TGF-β成员的一个标志性特征。其中的8个半胱氨酸以成对的方式形成分子中心区的4对链内二硫键，结合第9个半胱氨酸形成链间二硫键，一起形成TGF-β二聚体。前体肽均具有特征性标志成熟肽起始的KEX-Furin样蛋白酶识别位点RXXR。并且都具有整合素结合位点RGD，RGD能够与整合素特异结合，例如能够与αvβ6特异结合，从而使潜活型的TGF-β1活化[15]。而在大海马(Hippocampus kuda)TGF-β1序列中则由RSD取代了RGD[54]，其中丝氨酸和甘氨酸具有相似的物理性质，都为亲水性的中性氨基酸，但转换的具体原因还不清楚。
3.2 TGF-β其他成员在鱼类中的研究进展
TGF-β家族的成员除了TGF-β1，常见的还有TGF-β2和TGF-β3。SUMATHY等[55]第一次从鲤中克隆得到TGF-β2基因，根据推测的氨基端列与人的TGF-β2基因比对，显示鲤TGF-β2前体蛋白和成熟蛋白与人的TGF-β2的前体蛋白和成熟蛋白相似度分别为81%和93%。LAING等[56]从钝吻鲟(Acipenser baeri)、虹鳟和欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)中克隆到部分核苷酸序列，证明TGF-β3在辐鳍亚纲的硬骨鱼中存在。LAING等[57]进一步在鲽(Pleuronectes platessa)中证明同时存在多种TGF-β基因。CHEAH等[58]报道在斑马鱼中克隆到TGF-β3 cDNA全长，显示该基因是由7个外显子组成，定位在14q24号染色体连锁群17的一部分。在转录起始位点的上游具有1个刺激蛋白1[Stimulating protein 1 (Sp1)]和2个TATA结合蛋白(TBP)的结合位点。TGF-β3在发育的胸鳍中大量表达，而没有在哺乳动物前肢中有类似的报道，表明TGF-β3在鱼类早期发育中具有新的功能。FUNKENSTEIN等[59]报道在金鲷(Sparus aurata)中发现一种新的TGF-β，其基因由7个外显子组成，预测编码420个氨基酸。基因组成与小鼠和鸡的TGF-β2相似，但氨基酸比对发现是一种新的在鱼类中特有的TGF-β，命名为TGF-β6，并发现TGF-β6能通过营养水平调节骨骼肌生长。目前还没有在其他脊椎动物中有关于TGF-β6的报道。
3.3 TGF-β受体在鱼类中的研究进展
对于鱼类TGF-β受体的研究还很少。最早是KOHLI等[50]在斑马鱼卵巢中克隆到TGF-β1的同时也克隆出TβRⅡ的cDNA序列，这是第一次在鱼类中报道的TβRⅡ，其激酶结构域与其他物种高度保守。MAEHR等[60]报道在虹鳟中克隆到2种TGF-β受体(TβRI和TβRⅡ)。从得到的虹鳟TβRI和TβRⅡ序列发现，其具备TβRI和TβRⅡ受体家族的所有特点，包括1个富含半胱氨酸的胞外结构域、1个跨膜结构域和1个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，并且激酶结构域高度保守。组织分布显示TβRI在胸腺和脾脏高表达；TβRⅡ在皮肤、胸腺和后肾中高表达，表明2种受体与免疫功能相关。同时2种受体在肌肉中都有很高表达，说明其与生长发育有关。同时，研究了各种刺激剂(LPS、Poly I: C、PHA、PMA、CI)刺激头肾淋巴细胞后对2种受体mRNA水平的影响，显示PHA、PMA、CI能下调2种受体的表达，首次深入了解2种受体在鱼类免疫过程中的调节情况。但是对TGF-β受体在鱼类中的研究还有待进一步深入。
4. 小结
TGF-β是一类非常重要的细胞因子，在脊椎动物的多种生理活动中都有所涉及。每年在哺乳动物中关于TGF-β系统相关的研究数以百计，其重要性可见一斑。而目前在硬骨鱼中对TGF-β通路的研究还处于初级阶段，其中大部分的研究都集中在TGF-β家族中的成员TGF-β1。对TGF-β1的研究主要集中在免疫疾病和生殖方面，最近也有涉及肝脏方面，而对TGF-β家族其他成员的研究较少。到目前为止，对于TGF-β受体在硬骨鱼中的研究只有在斑马鱼和虹鳟中有过报道。
由于进化过程中基因组复制的原因，鱼类中很多基因的拷贝数不同于哺乳动物。笔者实验室在尼罗罗非鱼(O.niloticus)中分离出2种TGF-β2和2种TGF-β3，并且在功能上也有差异(待发表)。因此，硬骨鱼中TGF-β系统还有很多是没有涉及到的，有待进一步研究。
由于TGF-β系统的重要性，未来在硬骨鱼中的研究，应该在理论研究的同时，紧密联系实际生产，向着抗病、促生长和繁殖育种等方向发展。
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图 1 麦穗鱼鳍组织原代及传代细胞
a. 原代培养第15天迁出的细胞；b~c. 传代培养第2代细胞
Figure 1. Primary and subculture cells of fin tissues of P.parva
a. primary cells of P.parva fin at 15th day; b~c. subculture cells of P.parva fin at the 2nd passage
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图 3 麦穗鱼染色体Ag-NORs分裂相及核型(箭头示银染点)
a. 中期染色体Ag-NORs；b. 间期核Ag-NORs
Figure 3. The Ag-NORs metaphase chromosomes and karyotype of P.parva (arrow indicates silver dying sites)
a. Ag-NORs of metaphase chromosomes; b. Ag-NORs of interphase nucleus
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图 4 麦穗鱼染色体C-带分裂相及核型(箭头示第23号染色体)
Figure 4. The C-banding metaphase chromosomes and karyotype of P.parva (arrow indicates chromosome No.23)
表 1 培养于不同培养基中的麦穗鱼鳍组织迁出细胞比较
Table 1 Comparison of cell migrated proportion from fin tissues of P.parva when cultured in different media
M199 MEM DMEM-F12 L-15 RPIM-1640 +++ ++++++ +++ ++ 无 注：+. 14 d后组织块周围迁出的细胞占培养瓶底面面积的2%
Note：+. the area of cells around the tissue accounted for 2% of the bottle base area 14 days later.
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1. 刘春晓，吕为群，杨志刚，陈阿琴. TGF-β/Smad信号通路响应光周期变化参与调控斑马鱼卵巢发育. 南方水产科学. 2019(03): 68-75 . 
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