Comparison between single factor design and orthogonal design to optimize reaction system for TRAP markers in tilapia
-
摘要:
靶位区域扩增多态性(target region amplification polymorphism，TRAP)是一种新型功能性分子标记，比较了L16(45)正交试验和单因素方法优化罗非鱼(Oreochromis spp.)TRAP反应体系。2种分析方法结果中dNTPs浓度、随机引物浓度、DNA浓度相同而镁离子(Mg2+)浓度和TaqDNA聚合酶浓度不同，不同因素间存在一定的交互作用。正交设计方法比单因素法更简单、科学、合理。该试验获得罗非鱼15 μL TRAP最优反应体系为DNA模板浓度为60 ng、Mg2+浓度为1.5 mmol·L-1、dNTPs浓度为0.3 mmol·L-1、TaqDNA聚合酶0.5 U、随机引物浓度为7 pmol·L-1和固定引物浓度为10 pmol·L-1。该反应体系在4个罗非鱼群体中验证，表现出良好的稳定性和重复性，该反应体系的建立为TRAP标记应用于罗非鱼遗传多样性评价、种质鉴定、分子标记辅助育种等研究提供了新的手段。
Abstract:The target region amplification polymorphism (TRAP) marker is a novel functional molecular marker. In present study, we compared the optimization of the reaction system for TRAP markers in tilapia (Oreochromis spp.) between L16(45) orthogonal design and single-factor design. The results of the two approaches showed that the concentrations of dNTPs, random primer and DNA were the same, while those of Mg2 + and TaqDNA polymerase dosage varied, and interaction among different factors were observed. The orthogonal design is simpler, more scientific and reasonable than single factor design. The optimal TRAP reaction system for tilapia includes 60 ng DNA template, 1.5 mmol·L-1 Mg2+, 0.3 mmol·L-1 dNTPs, 0.5 U TaqDNA polymerase, 7 pmol·L-1 random primers and 10 pmol·L-1 fixed primer. The stability and repeatability of the reaction system had been verified in 4 tilapia populations. The TRAP marker provides new insights into evaluation of genetic diversity, germplasm identification, molecular marker-assisted breeding and other related researches of tilapia.
-
Keywords:
- tilapia /
- TRAP /
- orthogonal design /
- single-factor test /
- optimization
-
日本鳀(Engraulis japonicus)是一种高蛋白、高脂肪的低值鱼类，为集群性小型中上层鱼类。中国鳀资源较丰富，多分布于东海、黄海，主要产地在浙、闽2省的近海水域[1]。鳀的内源酶活性强，脂肪含量较高，捕捞后易变质，因此离水后须立刻加工处理。近年随着船上加工技术的改进，在浙江已有多艘海上加工船采用“捕捞加工一体化”的海上移动加工模式生产鳀干制品，年产量达3 000 t。在干制鳀的船上移动加工技术中，蒸煮是关键步骤之一，由于鳀本身的性质特点，有大量的蛋白质、游离氨基酸和核苷酸等营养成分和风味物质溶解在蒸煮液中。目前，对该部分蒸煮液进行直接排放入海的处理，不仅对蛋白质资源造成浪费还会污染海域环境，因此，对鳀蒸煮液进行深加工，制成蛋白强化剂、调味品及药膳具有很好的市场前景[2-4]。
目前，已有研究采用真空浓缩工艺对鳀蒸煮液进行浓缩[5]，但是膜技术的采用尚未在该领域展开，未见相关的报道。该试验以鳀蒸煮液为原料，采取超滤技术浓缩回收蛋白质和氨基酸，主要研究了聚醚砜膜浓缩蛋白质和氨基酸的工艺条件，包括膜孔径的大小、压力、流速和样品pH，为工业化生产提供设计参数。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
原料为浙江瑞安市华盛水产品加工厂提供的鳀蒸煮液。膜超滤装置为美国密理博中国有限公司生产的Labscale研发型切向流系统，及其Pellicon盒式膜包，包括5、10、30、50和100 kDa 5种孔径的聚醚砜膜。
1.2 测定方法
蛋白质质量浓度测定用凯式定氮法，采用瑞士福斯的蛋白质测定仪，参照GB/T 5009.39-2003；氨基酸质量浓度测定用酸碱滴定法，采用瑞士万通的自动电位滴定仪，参照GB/T 5009.39-2003方法；氯化钠质量浓度的测定用沉淀滴定法，采用瑞士万通的自动电位滴定仪，参照GB/T 12457-2008方法；不溶性固形物质量浓度的测定用重量法，参照GB/T 12296-1990方法。
1.3 试验方法
该试验采用切向流过滤(TFF)技术，与常规的垂直过滤(NFF)不同，在切向流过滤中，液体切向流过膜表面，流体产生的跨膜压力将部分溶液压过滤膜，截留部分则在系统中循环过滤。整个过程中液体以一定的速度连续流过膜表面，过滤的同时也对滤膜表面进行冲刷，使膜表面保持干净不易形成凝胶层，从而保持稳定且较高的过滤速度。
1.3.1 样品预处理方法的选择
该试验的样品是含有大量颗粒杂质的鳀蒸煮液，为降低样品对超滤膜的污染、保持超滤膜良好的分离特性和通量、克服浓差极化，因此，在超滤前必须对样品进行预处理，除去不溶性固形物。离心分离虽然能很好地分离其中的不溶性杂质，但是其能耗较大，不适合大规模生产，故该试验采用滤纸抽滤和0.2 μm微滤膜过滤2种方法处理，以确定最佳预处理方法。
1.3.2 膜孔径的确定
膜孔径的大小不仅影响膜分离的效果，而且还影响膜分离的效率，因此，首先要选择合适孔径的超滤膜。该试验选取膜孔径为5、10、30、50和100 kDa的5种聚醚砜膜，温度30 ℃，样品pH 8.5，进样流速1.56 mL · s-1，压力206.85 kPa，对200 mL样品进行浓缩，浓缩倍数为1，分别测定浓缩液和滤出液的各参数，以确定最佳膜孔径。
1.3.3 超滤压力的确定
选用30 kDa孔径的聚醚砜膜，测定不同压力下的膜通量和超滤压力的关系。在30 ℃下，样品pH 8.5，进水流速1.56 mL· s-1，超滤30 min，测定滤出液的体积，以确定最佳操作压力。
1.3.4 进样流速的确定
选用30 kDa孔径的聚醚砜膜，测定不同进样流速下的膜通量和流速的关系。在30 ℃下，样品pH 8.5，压力137.90 kPa，超滤30 min，测定滤出液的体积，以确定最佳进样流速。
1.3.5 样品pH的确定
在30 ℃、最佳的操作压力和进样流速条件下，测定不同pH条件下膜通量的变化，以确定合适的pH。
2. 结果与分析
2.1 超滤前样品的预处理
样品预处理的主要目的是去除其中的固体颗粒，降低对超滤膜的污染，减少对膜通量的影响，使超滤膜保持良好的分离特性。采用常规的抽滤和微滤法过滤，样品中不溶性固形物的质量浓度从原来的2.26 g · L-1分别降至0.05和0.03 g ·L-1，基本可以除去样品中的固体颗粒，达到预期的目的(表 1)。将处理完的样品放于4 ℃冰箱保存，过一段时间后观察，微滤处理的样品比较清澈，而抽滤处理的样品出现轻微的浑浊现象。由于氨基酸的分子量较小，因此，2种方法对氨基酸基本上无截留，与原液中的质量浓度基本一致。微滤法可以更好地保留蛋白质，而且对盐分有较好的去除能力。而滤纸抽滤不仅去除盐分不明显，而且对蛋白质的保留能力不足。综上所述，选用微滤技术作为样品的预处理方法。
表 1 不同预处理结果比较(n=3，X ±SD)Table 1. Results of different pretreatmentsg · L-1 ρ(蛋白质) protein ρ(氨基酸态氮) amino acid nitrogen ρ(氯化钠) sodium chloride ρ(不溶性固形物) insoluble solid 原料raw material 4.99±0.04c 0.57±0.01a 21.49±0.17b 2.26±0.09b 抽滤air pump filtration 3.72±0.16a 0.55±0.01a 21.80±0.20b 0.05±0.00a 过微滤microfilter 4.45±0.02b 0.53±0.01b 18.18±0.09a 0.03±0.01a 注：同一列中具不同字母标记的数值表示差异显著(P＜0.05)，后表同此
Note：Values with different letters in the same column are significantly different from each other (P＜0.05); the same case in the following table.2.2 膜孔径对膜浓缩过程的影响
对膜孔径为5、10、30、50和100 kDa的5种聚醚砜膜进行对比试验，研究膜孔径对浓缩效果和膜通量的影响。样品在pH 8.5、进样流速1.56 mL ·s-1、操作压力206.85 kPa、浓缩1倍的条件下，随着分子截留量的增大膜通量也增大，当膜孔径增至30 kDa时，膜通量为76.3 L · (m2 · h)-1，增幅较明显，但当膜孔径继续增大时，膜通量的增幅变缓慢(图 1)。蛋白质和氨基酸态氮的截留量也随着分子截留量的减小而提高，其中对蛋白质的截留量相对较高，最高分别为5.33和0.58 g · L-1，质量浓度分别为处理前的1.63和1.18倍；但是，5种膜对氯化钠的分离作用都不显著且相差较少，浓缩液中氯化钠的质量浓度都在21.1 g · L-1左右，过滤液中氯化钠质量浓度都在20.6 g · L-1左右，与原料液中的22.24 g · L-1相差较小(表 2)。综合各方面因素，孔径为30 kDa的膜具有较高的蛋白质等物质的截留量，膜通量也较高，所以该试验选取孔径为30 kDa的聚醚砜膜进行下步研究。
表 2 不同孔径超滤膜处理浓缩液中各成分质量浓度的变化(n=3，X ±SD)Table 2. Variation in concentration of each ingredient with ultrafiltration membrane at different pore sizeg · L-1 成分ingredient 处理前before treatment 浓缩液concentrated solution 过滤液filtering solution 5 kDa 10 kDa 30 kDa 50 kDa 100 kDa 5 kDa 10 kDa 30 kDa 50 kDa 100 kDa 蛋白质protein 3.27±0.39b 5.33±0.07c 5.31±0.06c 5.24±0.07c 5.07±0.16c 4.87±0.41c 0.10±0.02b 0.10±0.01a 0.11±0.01a 0.12±0.02a 0.13±0.01a 氨基酸态氮amino acid nitrogen 0.49±0.01e 0.58±0.00h 0.57±0.01g 0.55±0.01f 0.53±0.00e 0.51±0.00d 0.46±0.00a 0.47±0.00ab 0.47±0.00bc 0.48±0.00c 0.50±0.01d 氯化钠sodium chloride 22.24±0.41c 21.29±0.15b 21.17±0.26ab 21.14±0.18ab 21.13±0.26ab 21.11±0.10ab 20.57±0.07a 20.67±0.03ab 20.70±0.14ab 20.70±0.07ab 20.77±0.61ab 2.3 操作压力对膜通量的影响
在操作压力小于68.95 kPa时，随着压力的增大膜通量也随之增大，并且呈一定的线性关系；当压力从68.95 kPa上升至172.38 kPa时，膜通量随着压力的增大缓慢增加，且在172.38 kPa时达到最大值69.5 L · (m2 · h)-1；当压力超过172.38 kPa时，膜通量开始下降，之后达到平衡(图 2)。由此可见，操作压力过高也是导致膜污染的原因之一。因此，综合膜通量和保护膜的考虑，选取低于临界压力的137.90 kPa为最佳的操作压力(由于该仪器压力计的最大量程为413.70 kPa，出于对仪器的保护，当压力达到344.75 kPa时不再加压)。
2.4 进样流速对膜通量的影响
随着进样流速的增大，膜通量也增大，且增幅较大。当进样流速达3.33 mL · s-1时，再增加进样流速，膜通量趋于平衡(图 3)。虽然流速从2.50 mL · s-1升至3.33 mL · s-1时，膜通量由60.8 L · (m2 · h)-1上升至80.0 L · (m2 · h)-1，但是为了保护仪器，延长仪器的使用寿命，同时减少能耗，选取最佳的进样流速为2.50 mL · s-1。
2.5 pH对膜通量的影响
使用30 kDa的膜对样品进行超滤，样品pH的变化对膜通量具有较显著的影响。样品在酸性条件下超滤的膜通量较低，当pH由4升至7时，膜通量几乎呈线性增长，pH继续上升，膜通量的变化不明显(图 4)。由于样品本身的pH为8.5，此时的膜通量94.4 L · (m2 · h)-1，稍低于pH为10时的96.0 L · (m2 · h)-1。鉴于样品处理量大和调节样品pH需要消耗大量的试剂，选择最佳的pH为8.5。在最佳的超滤条件操作下，样品体积浓缩倍数为1时，蛋白质浓缩倍数为1.61，蛋白质的截留率为80.6%，对氨基酸和氯化钠的截留效果不显著。
3. 讨论
3.1 样品预处理的探讨
超滤膜对样品的要求较高，样品中不能含有不溶性固形物等可见颗粒，防止超滤过程中对膜孔造成不可逆的污染，影响膜分离性能和膜通量。超滤前需对样品进行预处理，常用的方法是离心和过滤。对比了程坷伟等[6]和陈寿鹏[7]的离心预处理发现，由于样品的性质不同以及离心的转速等因素对预处理的效果有很大的影响，需进行进一步研究。鉴于样品处理量较大，采用离心处理能耗较大，且不能进行连续的处理，该试验将样品静置后，分别进行抽滤和微滤处理，结果显示微滤对样品中固体颗粒的去除效果更显著。高红宁等[8]的试验也证明微滤处理能有效除去悬浮杂物，而且微滤处理后样品中蛋白质的保留量较高，此结果与左勇等[9]的试验结果一致，并且微滤处理的脱盐效果也较好，故研究选用微滤法对样品进行预处理。
3.2 超滤膜孔径的选择
超滤膜根据膜材料及膜孔径的不同，对超滤过程的分离能力和性能都有较大的影响。最优的超滤膜应该具有蛋白质截留率高、氨基酸截留率高、氯化物截留率低以及平均膜通量大的特点。分子截留量较大时，超滤的平均膜通量较大，但是对蛋白质、氨基酸的截留效果不理想；分子截留量较小时，虽然对于蛋白质、氨基酸的截留效果较好，但是平均膜通量小，耗时且能耗较大，并且可能截留较多的氯化物。文章研究了5种不同孔径的聚醚砜膜(100、50、30、10和5 kDa)对样品的浓缩效果，以确定最佳的分子截留孔径。分子截留量为50和100 kDa的膜平均滤通量较大，但对蛋白质等的截留效果不好；而10和5 kDa的膜对蛋白质等的截留效果好，但通量太低；只有分子截留量为30 kDa的膜，在膜通量和截留率间取得很好的平衡，在5种膜中其超滤性能最佳，故选择截留孔径为30 kDa的膜进行超滤工艺的相关试验。
3.3 孔径为30 kDa膜最佳超滤工艺条件的确定
影响超滤效果的因素有很多，主要包括操作的压力、进样流速、样品pH和操作温度4个方面，为了达到较好的超滤效果，需对不同的超滤条件进行分析，以确定最优的工艺方案。
随着温度的升高，蛋白质的粘度降低，溶液扩散增强，浓差极化现象减弱，超滤膜的滤速必然增大，但过高的温度会造成蛋白质凝胶化[10-11]，且聚醚砜超滤膜的允许温度应低于50 ℃；同时，考虑到改变样品温度的能耗和保持样品温度的复杂操作，该试验选择30 ℃(室温)[12]为最佳的操作温度，仅对其余3个方面进行研究。
3.3.1 膜通量与操作压力的关系
从试验结果可见，操作压力对膜通量的影响很显著，随着操作压力的增大，膜通量也增大，但是当操作压力达一定程度后，再增大压力，膜通量反而下降。该结果与程坷伟等[6]的研究结果类似。这是因为当压力较小时，在膜表面及膜孔内只形成少量的吸附和凝胶层，这时候物料中压向凝胶层内的溶质和由物料切线流动和扩散带走的溶质基本能够保持动态平衡，增大压力产生的压差会使膜通量增大；而在压力达到一定程度后，吸附和凝胶层迅速加大，增大压力只会使凝胶层变厚压实，所以通量不再随着压力的增大而增大，这时的压力称为临界压力[13]。而且如果继续增加压力，会将与膜孔大小相近的分子压进膜孔，造成膜的污染、膜通量下降，严重者会使膜造成不可逆的破坏。KISHIHARA等[14]的研究还表明，操作压力较大时，膜的初始通量也较大，但是衰减也相对较快，这是因为通量越大，膜表面截留的物质浓度增大较快，更容易形成凝胶层，当凝胶层稳定后，膜通量主要受到凝胶层的控制，导致膜通量的变化与压力变化无关[15]。该试验在此方面的研究尚不足，以后需对工艺的研究进行完善。
3.3.2 膜通量与进样流速的关系
从图 3可以看出，随着进样流速的增大，膜通量也增大，这是因为流速增大导致物料在膜表面形成凝胶层以及凝胶层上的边界层的能力下降，从而减弱了浓差极化和边界层的阻力，导致膜通量增大。但是继续增加流速，膜通量的变化不明显。BALAKRISHNAN等[16]曾在糖蔗汁超滤过程中发现同样的现象，并把其分为2部分：1)对应于浓差极化的加重和凝胶层的不断形成，膜表面切向流速的增加更有利于切割掉膜表面的沉积层，以及减轻浓差极化和程度；2)对应于凝胶层稳定后的过滤，此时进样的切割力不足以减轻渗透阻力，所以滤速由凝胶层控制而不再受到流速的影响。虽然高的进样流速会增大膜通量，但是较高的流速对泵的损伤较大，故该试验选择最佳的进样流速为2.50 mL · s-1。
3.3.3 膜通量与pH的关系
pH的变化会改变蛋白质分子表面所带电荷的极性和蛋白质分子间的静电作用[17]，进而影响蛋白质分子的存在状态以及蛋白质与膜之间吸附作用的强弱，相应地对超滤膜通量产生影响。吕斯濠[18]认为，从分离蛋白质的角度考虑，蛋白质在pH 4.5其溶解度低，易于形成较大的蛋白颗粒而被超滤膜截留，且不易堵塞在膜孔中，并且此时蛋白质的粘度最低，在切向流的条件下，膜表面的剪切力更易于把膜表面沉积的物质剪切掉，从而减薄了沉积层的厚度，有利于保持较高的膜通量，但此结论与试验结果存在差异。该试验结果表明，pH越高，超滤通量越大，但在pH大于7时，增幅不明显。当把pH调到7以下时，可用肉眼观察到原来澄清的料液逐渐出现乳白色混浊，且随pH的下降，混浊度越来越高。这是由于在低pH时，蛋白质颗粒带正电荷；在中等pH时，蛋白质颗粒不带电荷，以两性离子形成存在；在高pH时，其带负电荷。聚醚砜膜表面带负电荷，当pH较高时，蛋白质颗粒和膜表面相互之间的静电斥力将会减轻吸附污染的影响，所以，采用中性或者弱碱性pH进行过滤时，膜通量更大[19]。
由于样品pH大于7时，膜通量的变化不显著，且保持在较高的水平，而样品本身的pH为8.5，此时的膜通量为94.4 L · (m2 · h)-1，较理想，因此保持样品原来的pH为最佳。
4. 小结
采用超滤技术浓缩蒸煮液，能最大限度地保持其营养成分，并且减少其品质变化。通过试验，确定了先将样品进行微滤预处理后进行超滤，且超滤的最佳操作条件为膜孔径30 kDa，操作压力137.90 kPa，进样流速2.50 mL · s-1，pH 8.5，温度30 ℃。将200 mL样品蒸煮液进行浓缩，体积浓缩倍数为1时，蛋白质浓缩倍数为1.61，蛋白质的截留率为80.6%，膜通量达94.4 L · (m2 · h)-1。该试验采取超滤技术浓缩提取蛋白质和氨基酸，主要研究了聚醚砜膜浓缩蛋白质和氨基酸的工艺条件，为工业化生产提供设计参数。膜分离技术具有设备简单和操作方便的特点，在常温下操作，避免了加工中的热过程，保持了产品的色香味及各种营养成分；分离过程不发生相变，挥发性成分损失较少；能耗低，选择性好，分离范围广。
-
![]()
图 1 罗非鱼TRAP反应体系正交试验优化结果
从左到右依次为正交表L16(45)的1~16个处理；M.100 bp DNA ladder
Figure 1. Result of TRAP reaction system for tilapia optimized with orthogonal design
Number 1~16 represent 16 treatments of L16(45); M. 100 bp DNA ladder
![]()
图 2 罗非鱼TRAP反应体系正交试验直观分析
Figure 2. Direct analysis of TRAP reaction system for tilapia optimized with orthogonal design
![]()
图 3 dNTPs浓度、随机引物浓度和DNA浓度对罗非鱼TRAP的影响
M. 100 bp DNA ladder；1~12. dNTPs浓度、随机引物浓度和DNA浓度各自1~4处理水平
Figure 3. Effects of concentrations of dNTPs, arbitrary primers and template on TRAP reaction system for tilapia
M. 100 bp DNA ladder; 1~12. 1~4 levels of concentrations of dNTPs, random primers and template
![]()
图 4 Mg2+浓度和TaqDNA聚合酶浓度对罗非鱼TRAP的影响
M. 100 bp DNA ladder；1~8. Mg2+浓度和TaqDNA聚合酶浓度各自1~4处理水平
Figure 4. Effects of concentrations of Mg2+ and TaqDNA on TRAP reaction system for tilapia
M. 100 bp DNA ladder; 1~8. 1~4 levels of concentrations of Mg2+ and TaqDNA
![]()
图 5 比较正交设计和单因素优化罗非鱼TRAP扩增图
M. 100 bp DNA ladder；O. 正交设计；S. 单因素；1~5. 不同罗非鱼个体
Figure 5. Comparison of amplification results of TRAP reaction system for tilapia between orthogonal design and single factor design
M. 100 bp of DNA ladder; O. orthogonal design; S. single factor; 1~5. different tilapia individuals
![]()
图 6 4个不同罗非鱼群体的TRAP扩增图
M. 100 bp DNA ladder；1~4. 马来西亚红罗非鱼；5~8. 新吉富罗非鱼；9~12. 吉富罗非鱼；13~16. 奥尼罗非鱼
Figure 6. Amplification result of TRAP reaction system for 4 different tilapia populations
M. 100 bp DNA ladder; 1~4. red tilapia; 5~8. New GIFT strain Nile tilapia; 9~12. GIFT strain Nile tilapia; 13~16. O.niloticus×O.aureus
表 1 试验采用的4个固定引物和6个随机引物序列
Table 1 Sequences of 4 fixed primers and 6 arbitrary primers used in present study
引物 primer 序列 sequence (5′→3′) 固定引物fixed primer E1 AGATTTCACCAAGGCTGT E2 TTATGAATTGCTGGCTTG E3 TGAATCCGTCTTCATTCA E4 ATCGATGCCTTTGATTTT 随机引物arbitrary primer Ga3-800 TCATCTCAAACCATCTACAC Odd26-700 CTATCTCTCGGGACCAAAC Sa12-700 TTCTAGGTAATCCAACAACA Trap03-700 CGTAGCGCGTCAATTATG Trap13-800 GCGCGATGATAAATTATC Em1 GGAACCAAACACATGAAGA 
下载: 导出CSV
表 2 红罗非鱼TRAP反应体系L16(45)正交设计
Table 2 L16(45) orthogonal design of red tilapia TRAP reaction system
编号
No.DNA模板/ng
DNA template镁离子/mmol·L-1
Mg2+脱氧核苷酸/mmol·L-1
dNTPs随机引物/pmol·L-1
arbitrary primerTaqNDA聚合酶/U
Taq NDA polymerase1 30 1.0 0.20 0.5 0.3 2 30 1.5 0.25 2.0 0.5 3 30 2.5 0.30 7.0 0.8 4 30 3.0 0.35 10.0 1.1 5 60 1.0 0.25 7.0 1.1 6 60 1.5 0.20 10.0 0.8 7 60 2.5 0.35 0.5 0.5 8 60 3.0 0.30 2.0 0.3 9 90 1.0 0.30 10.0 0.5 10 90 1.5 0.35 7.0 0.3 11 90 2.5 0.20 2.0 1.1 12 90 3.0 0.25 0.5 0.8 13 120 1.0 0.35 2.0 0.8 14 120 1.5 0.30 0.5 1.1 15 120 2.5 0.25 10.0 0.3 16 120 3.0 0.20 7.0 0.5
下载: 导出CSV
表 3 罗非鱼TRAP反应体系正交设计方差分析
Table 3 Variance analysis of TRAP reaction system for tilapia optimized with orthogonal design
变异来源
source极差
range方差
SSF 均方
MS标准差
X±SD模板 template 6.750 153.188 2.428 51.063 12.37 二价镁离子 Mg2+ 4.750 54.688 0.867 18.229 7.39 三磷脱氧核糖核酸 dNTPs 2.500 13.688 0.217 4.563 3.70 随机引物 arbitrary primer 4.750 50.688 0.803 16.896 7.12 TaqDNA聚合酶 TaqDNA 4.250 43.188 0.685 14.396 6.57 共计 total 315.440
下载: 导出CSV
-
[1] MURTHY L N, PANDA S K, SHAMAUNDAR B A. Physico-chemical and functional properties of proteins of tilapia (Oreochromis mossambicus)[J]. J Food Process Engin, 2011, 34(1): 83-107. doi: 10.1111/j.1745-4530.2008.00338.x
[2] 卢迈新, 黄樟翰. 罗非鱼遗传育种研究[J]. 上海水产大学学报, 2005, 14(2): 186-191. doi: 10.3969/j.issn.1004-7271.2005.02.016 [3] THODESEN J, RYE M, WANG Y X, et al. Genetic improvement of tilapias in China: genetic parameters and selection responses in growth of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) after six generations of multi-trait selection for growth and fillet yield[J]. Aquaculture, 2011, 322/323: 51-64. doi: 10.1016/j.aquaculture.2011.10.010
[4] 储霞玲, 曹俊明, 白雪娜, 等. 2011年广东罗非鱼产业发展现状分析[J]. 广东农业科学, 2012(8): 12-14. doi: 10.3969/j.issn.1004-874X.2009.07.083 [5] 杜诚, 卢迈新, 叶星, 等. 5个罗非鱼群体的遗传分析与分子标记[J]. 大连水产学院学报, 2005, 20(1): 25-28. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=1b5k02g03c4e00d01j2p06v0e6236380&site=xueshu_se&hitarticle=1 [6] 王忠华, 董西征, 钱国英. DNA分子标记技术在水生动物遗传多样性研究中的应用[J]. 科技通报, 2008, 24(5): 623-630. doi: 10.3969/j.issn.1001-7119.2008.05.007 [7] GOLDBERG D, JACKSON K, YEHUDA Y, et al. Application of RAPD in the study of genetic variations between African and American Cichlidae[J]. Indian J Fish, 2011, 46(3): 307-312. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=83bc4f7119b155e5964a745269b67cae&site=xueshu_se
[8] CHIU T H, SU Y C, PAI J Y, et al. Molecular markers for detection and diagnosis of the giant grouper (Epinephelus lanceolatus)[J]. Food Control, 2011, 24(1/2): 29-37. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956713511003549
[9] 熊发前, 蒋菁, 钟瑞春, 等. 分子标记技术的两种新分类思路及目标分子标记技术的提出[J]. 中国农学通报, 2010, 26(10): 60-64. [10] 姚红伟, 张立冬, 孙金阳, 等. DNA分子标记技术概述[J]. 河北渔业, 2010(7): 42-46. doi: 10.3969/j.issn.1004-6755.2010.07.020 [11] HU J, VICK B. Target region amplification polymorphism: a novel marker technique for plant genotyping[J]. Plant Mol Biol Rep, 2003, 21(3): 289-294. doi: 10.1007/BF02772804
[12] 边银丙, 宋小亚. 几种新型DNA分子标记及其在食用菌研究中的应用[J]. 食用菌学报, 2006, 13(1): 78-87. doi: 10.3969/j.issn.1005-9873.2006.01.010 [13] LIU Z H, ANDERSON J A, HU J, et al. A wheat intervarietal genetic linkage map based on microsatellite and target region amplified polymorphism markers and its utility for detecting quantitative trait loci[J]. Theor Appl Genet, 2005, 111(4): 782-794. doi: 10.1007/s00122-005-2064-y
[14] HU J, OCHOA O E, TRUCO M J, et al. Application of the TRAP technique to lettuce (Lactuca sativa L. ) genotyping[J]. Euphytica, 2005, 144(3): 225-235. doi: 10.1007/s10681-005-6431-1
[15] MIKLAS P N, HU J, GRUNWALD N J, et al. Potential application of TRAP (targeted region amplified polymorphism) markers for mapping and tagging disease resistance traits in common bean[J]. Crop Sci, 2006, 46(2): 910-916. doi: 10.2135/cropsci2005.08-0242
[16] 朱志凯, 方良俊, 招倩婷, 等. 水稻TRAP-PCR反应体系优化与P-糖蛋白基因片段的分析[J]. 分子植物育种, 2008, 6(1): 65-70. doi: 10.3969/j.issn.1672-416X.2008.01.010 [17] AL-DOSS A A, ELSHAFEI A A, MOUSTAFA K A, et al. Comparative analysis of diversity based on morpho-agronomic traits and molecular markers in durum wheat under heat stress[J]. Afr J Biotechnol, 2011, 10(19): 3671-3681. doi: 10.1007/s10681-009-9965-9
[18] 梅秋兰. 鳜原种群体和养殖群体遗传多样性的TRAP及SSR标记分析[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2010. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=33823794&from=Qikan_Article_Detail [19] 曲疆奇, 苏胜彦, 董在杰, 等. 鲤TRAP分子标记反应体系的建立与优化[J]. 动物学杂志, 2010, 45(3): 72-78. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=34103419&from=Qikan_Search_Index [20] 葛学亮, 孙中武, 尹洪滨. 人工养殖鲶的TRAP遗传分析[J]. 大连水产学院学报, 2010, 25(1): 76-79. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=33030070&from=Qikan_Search_Index [21] 何正文, 刘运生, 陈立华, 等. 正交设计直观分析法优化PCR条件[J]. 湖南医科大学学报, 1998(4): 76-77. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=3168505&from=Qikan_Search_Index [22] 张君玉, 郭大龙, 龚莹, 等. 葡萄目标起始密码子多态性反应体系的优化[J]. 果树学报, 2011(2): 209-214. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=37026487&from=Qikan_Search_Index [23] 张慧, 孙中武, 刘伟, 等. 大麻哈鱼SRAP反应体系正交设计及优化[J]. 水产学杂志, 2010, 23(2): 6-10. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=34491823&from=Qikan_Search_Index [24] 张志伟, 韩曜平, 曹哲明. 草鱼TRAP-PCR反应体系的建立[J]. 生物技术, 2006, 16(2): 31-34. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=21699731&from=Qikan_Search_Index [25] HU J. Defining the sunflower (Helianthus annuus L. ) linkage group ends with the Arabidopsis-type telomere sequence repeat-derived markers[J]. Chromosome Res, 2006, 14(5): 535-548.
[26] 苗培明, 罗淑萍, 范玲. 棉花TRAP-PCR扩增体系的建立[J]. 新疆农业科学, 2009, 45(6): 1007-1011. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=28921460&from=Qikan_Search_Index [27] CHAUHAN T, RAJIV K. Molecular markers and their applications in fisheries and aquaculture[J]. Adv Biosci Biotechnol, 2010, 1(4): 281-291. doi: 10.4236/abb.2010.14037
[28] 李莉好, 喻达辉, 黄桂菊, 等. 吉富罗非鱼不同选育群体的遗传多样性[J]. 南方水产, 2007, 3(5): 40-48. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=27484867&from=Qikan_Search_Index [29] 董在杰, 曲疆奇, 袁新华, 等. 鲤改良品系与体质量、体长性状相关的TRAP标记筛选[J]. 中国水产科学, 2011, 18(4): 801-808. https://cstj.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=38618368&from=Qikan_Search_Index [30] 李渝成, 李康, 周暾. 十四种淡水鱼的DNA含量[J]. 遗传学报, 1983, 10(5): 384-389. -
期刊类型引用(0)
其他类型引用(2)
计量
- 文章访问数:
- HTML全文浏览量:
- PDF下载量:
- 被引次数: 2
粤公网安备 44010502001741号
