罗非鱼TRAP分子标记反应体系优化设计方案的比较

马庆男; 董在杰; 朱文彬; 苏胜彦; 张宁; 袁新华; 杨弘

doi:10.3969/j.issn.2095-0780.2013.01.005

罗非鱼TRAP分子标记反应体系优化设计方案的比较

马庆男^1,,
董在杰^{1, 2, ,},
朱文彬²,
苏胜彦²,
张宁¹,
袁新华^{1, 2},
杨弘^{1, 2}

1.
南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081
2.
中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏无锡 214081

基金项目:

现代农业产业技术体系建设专项资金项目 CARS-49

现代农业人才支撑计划项目 2130106

详细信息

作者简介:
马庆男(1985-)，男，硕士研究生，从事鱼类遗传育种研究。E-mail: ma_qingnan@163.com

通讯作者:
董在杰，E-mail: dongzj@ffrc.cn

中图分类号: Q953⁺.3
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出版历程
- 收稿日期: 2012-06-04
- 修回日期: 2012-07-19
- 刊出日期: 2013-02-04

Comparison between single factor design and orthogonal design to optimize reaction system for TRAP markers in tilapia

MA Qingnan^1,,
DONG Zaijie^{1, 2, ,},
ZHU Wenbin²,
SU Shengyan²,
ZHANG Ning¹,
YUAN Xinhua^{1, 2},
YANG Hong^{1, 2}

1.
Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China
2.
Key Lab. of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture; Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China

摘要

摘要:
靶位区域扩增多态性(target region amplification polymorphism，TRAP)是一种新型功能性分子标记，比较了L₁₆(4⁵)正交试验和单因素方法优化罗非鱼(Oreochromis spp.)TRAP反应体系。2种分析方法结果中dNTPs浓度、随机引物浓度、DNA浓度相同而镁离子(Mg²⁺)浓度和TaqDNA聚合酶浓度不同，不同因素间存在一定的交互作用。正交设计方法比单因素法更简单、科学、合理。该试验获得罗非鱼15 μL TRAP最优反应体系为DNA模板浓度为60 ng、Mg²⁺浓度为1.5 mmol·L^-1、dNTPs浓度为0.3 mmol·L^-1、TaqDNA聚合酶0.5 U、随机引物浓度为7 pmol·L^-1和固定引物浓度为10 pmol·L^-1。该反应体系在4个罗非鱼群体中验证，表现出良好的稳定性和重复性，该反应体系的建立为TRAP标记应用于罗非鱼遗传多样性评价、种质鉴定、分子标记辅助育种等研究提供了新的手段。
- 罗非鱼 /
- TRAP /
- 正交设计 /
- 单因素试验 /
- 优化
Abstract:
The target region amplification polymorphism (TRAP) marker is a novel functional molecular marker. In present study, we compared the optimization of the reaction system for TRAP markers in tilapia (Oreochromis spp.) between L₁₆(4⁵) orthogonal design and single-factor design. The results of the two approaches showed that the concentrations of dNTPs, random primer and DNA were the same, while those of Mg^{2 +} and TaqDNA polymerase dosage varied, and interaction among different factors were observed. The orthogonal design is simpler, more scientific and reasonable than single factor design. The optimal TRAP reaction system for tilapia includes 60 ng DNA template, 1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺, 0.3 mmol·L^-1 dNTPs, 0.5 U TaqDNA polymerase, 7 pmol·L^-1 random primers and 10 pmol·L^-1 fixed primer. The stability and repeatability of the reaction system had been verified in 4 tilapia populations. The TRAP marker provides new insights into evaluation of genetic diversity, germplasm identification, molecular marker-assisted breeding and other related researches of tilapia.
- tilapia /
- TRAP /
- orthogonal design /
- single-factor test /
- optimization

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在天然环境和养殖池塘中，对虾摄食的饵料种类非常多，食谱广泛^[1-7]，但同时对虾对某些饵料种类表现出明显的偏好，在多种饵料同时存在时表现出明显的选择性^{[8, 9]}。以往的研究发现饵料密度、寻觅的难易、处理的难易等因素会影响动物对饵料的选择性^[10-16]，这种选择性部分或全部地受到使摄食过程中获得的能量净值与处理食物消耗能量的比值最大化规律的支配^{[12, 17, 18]}。在实验条件下，不同饵料均过量同时提供时，尽管对虾偏好某种饵料，对虾也摄食其它饵料^[8]。对虾的这种杂食性行为显然具有某些优势，如Chamberlain和Lawrene^[20](1981)发现南美白对虾同时摄食鱿鱼、虾类、多毛纲动物和蛤肉时生长要比单独摄食其中任何一种饵料时生长要快。日本对虾同时摄食鳀鱼和蛤时生长比仅摄食其中一种饵料好^[8]。对虾杂食性可能具有的其它优点包括通过不同饵料的搭配来改善摄入食物的营养平衡和能量特征，从而达到对饵料资源的节约和更有效利用。本实验以中国明对虾Fenneropenaeus chinensis为研究对象，对这些可能的优越性进行探讨。

1. 材料和方法

1.1 饵料的准备

实验用的5种饵料分别为沙丁鱼肌肉(FF，除去头、内脏、骨、鳞、鳍的鱼)、鹰爪虾肌肉(SF，除去头、壳、内脏)、菲律宾蛤仔足肌(CF，蛤蜊的斧足)、沙蚕(PW，日本刺沙蚕)和配合饲料(FD，海马牌配合饲料)。每种饵料在投喂前都切成和配合饲料大小(长4 mm，直径2 mm左右)一致的小块。5种饵料的营养和能量特征见表 1。

表 1 5种饵料及混合摄入饵料的成分(平均值±SE)

Table 1. Composition of five provided diets and ingested mixed diets (mean±SE)

饵料种类 diets	水分/% moisture	蛋白质/% protein	脂肪/% lipid	能量/kJ·g^-1 energy	能蛋比(E/P) energy/protein	脂蛋比(L/P) lipid/protein
FF	82.62±1.50	91.41±0.017^h	2.40±0.14^a	22.61±0.02^f	24.74±0.21^a	0.026±0.001^a
SF	88.25±0.44	86.88±0.08^g	3.84±0.18^b	22.87±0.04^g	26.32±0.35^b	0.044±0.001^b
CF	78.19±0.77	66.49±0.06^cd	4.31±0.47^c	20.99±0.09^cd	31.57±0.48^de	0.065±0.001^c
PW	75.66±0.54	70.93±0.11^f	11.00±0.18^g	21.31±0.10^e	30.04±0.78^c	0.155±0.011^ef
FD	8.00±1.04	45.97±0.05^a	9.16±0.17^d	19.37±0.03^a	42.12±0.16^g	0.199±0.006^e
CF+PW	……	70.64±0.04^f	10.53±0.06^fg	21.29±0.01^e	30.13±0.01^c	0.149±0.001^d
CF+FD	……	53.92±1.41^b	7.28±0.33^d	20.00±0.11^b	37.14±0.79^f	0.136±0.010^f
PW+FD	……	64.81±0.73^c	10.53±0.05^fg	20.83±0.06^c	32.15±0.23^e	0.162±0.001^ef
CF+FD+PW	……	67.92±1.01^de	10.42±0.16^f	21.08±0.08^d	31.04±0.35^cd	0.153±0.002^ef
FF+CF+PW+FD	……	67.75±1.09^de	9.90±0.32^e	21.04±0.08^d	31.07±0.37^cd	0.146±0.005^de
FF+SF+CF+PW+FD	……	68.92±1.17^ef	9.45±0.15^de	21.15±0.09^de	30.70±0.39^cd	0.137±0.002^d
注：同一列中未标有相同字母的数值相互之间存在显著差异。混合投喂处理的各项指标根据实际不同饵料摄入比例加权计算获得 Note: Values without same letter in the same column are different from each other. The values of mixed diet were weighed in accordance with the portion of each diet in total ingested diet.

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1.2 实验养殖设施及条件

实验在中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室进行。对虾按每个水族箱4尾的密度(45 cm×30 cm×30 cm，水体35 L)养殖，室内温度用空调控制；连续充气，每2天换水1/2，所用海水用筛绢过滤；水族箱内溶氧保持在5.5 mg · L^-1以上，氨氮含量不高于2.2 mg · L^-1，海水温度为25±0.5℃，盐度为30~32，pH值为7.8±0.3；光照周期为14L：10D。

1.3 实验用虾来源及驯化

实验所用对虾从山东省胶南市购买，运回实验室后分至水族箱内按实验条件进行为期7 d的驯化。驯化期间每天过量投饵2次(早上6：00和晚上6：00)，投饵后2.5~3 h时间段内清除水族箱内的残饵和粪便。

1.4 实验设计

驯化结束后，对虾禁食24 h，挑选规格一致的对虾用精确到0.1 mg的电子天平称重，每一水族箱内放入体重(湿重)为0.805±0.005 g (平均值±SE)的对虾4尾。实验共持续30 d。实验共设11个处理，分别投喂不同的饵料，前5个处理分别投喂过量的沙丁鱼肉(FF)、虾肉(SF)、蛤蜊肉(CF)、沙蚕(PW)和配合饲料(FD)，后6个处理的饵料组合分别为CF+PW、CF+FD、PW+FD、CF+FD+PW、FF+FD+PW+FD、FF+SF+CF+PW+FD，每一种都过量投喂，使每种饵料的剩余量达到投喂量的一半以上。每一处理设4个重复，共用44个水族箱，水族箱的排列采用完全随机化区组设计进行排列。

1.5 样品的收集和测定

挑选实验用对虾的同时取对虾样品3个，每个样品8尾虾，分析对虾初始成分。每种饵料也分别随机取样3个，作为分析饵料成分的样品。每天投喂的饵料都精确称重，投喂后在2.5~3 h时间段内收集残饵，并对每种饵料进行溶失实验，用于校正最后收集的残饵的量。实验结束后，每个水族箱内的虾分别称量湿重，作为一个样品。收集的样品均用烘箱在65℃下烘干至恒重，计算对虾和饵料样品的水分含量。除残饵外，所有样品用凯氏定氮法测定氮含量并换算成粗蛋白质(P)含量(凯氏氮×6.25)。对虾和饵料的粗脂肪含量(L)用索氏抽提法测定。样品的灰份含量用马福炉在550℃下燃烧至恒重测得^[21]。样品的能量值(GE)用PARR1281型卡路里计测定。每个样品测定3次。

1.6 数据计算

对虾的增重率(WG, %初始体重)和饵料转化效率(FCE，%)的计算公式分别如下：

$$ \begin{aligned} & W G=100 \times\left(W_t-W_o\right) / W_o \\ & F C E=100 \times\left(W_t-W_o\right) / C \end{aligned} $$

其中对虾体重为湿重(W，g)，而饵料均为干重。W_t为实验结束时对虾的体重，W_o为实验开始时对虾的体重，T为实验持续时间(d)，C为摄食量。

相应地，所有样品以干物质(D，g)、蛋白质(P，g)和能量(E，kJ)表示的特定生长率、增重率、饵料转化效率也按以上公式进行计算^[22]。

饵料的能量蛋白比(GE/P，kJ · g^-1)、脂肪蛋白比(L/P)按如下公式进行计算：

$$ \begin{aligned} & \mathrm{GE} / \mathrm{P}=\mathrm{GE} \div \mathrm{P} \\ & \mathrm{~L} / \mathrm{P}=\mathrm{L} \div \mathrm{P} \end{aligned} $$

在假设不同单种饵料对混合饵料的转化效率没有相互作用的前提下，预测混合饵料转化效率计算公式如下：

$$ \mathrm{e} F C E=\sum\limits_{i=1}^5 F C E_i \times R_i $$

其中FCE_i为单种饵料投喂时某种饵料的实际饵料转化效率，R_i表示相应饵料在总饵料摄入量中的比例。

1.7 数据的统计分析

对数据的统计分析用SPSS 10.0进行。对数据进行了单因子方差分析和Duncan氏多重比较，以P＜0.05作为差异显著的标准。

2. 实验结果

2.1 中国明对虾的生长

实验结束时不同处理的中国明对虾在湿重、干重、蛋白质、能量等方面都存在显著差异，以FF处理最小，相应的湿重、干重、蛋白质、能量分别为0.993、0.189、0.134 g和3.31 kJ，CF+PW处理最大，相应的湿重、干重、蛋白质、能量分别为2.089、0.501、0.343 g和9.13 kJ；对虾以湿重、干重、蛋白质、能量表示的增重率也表现为相同的趋势(表 2)。

表 2 不同形式表示的放养对虾和收获对虾的重量和增长率(平均值±SE)

Table 2. The weight of initial shrimp and final shrimp and weight gain (mean±SE)

饵料搭配 diets combination	放养对虾initial shrimp				收获对虾final shrimp				增重率/% weight gain
饵料搭配 diets combination	WW/g	DW/g	P/g	E/kJ	WW/g	DW/g	P/g	E/kJ	WW	DW	P	E
FF	0.807±0.006	0.175±0.001	0.127±0.001	3.26±0.05	0.993±0.063^a	0.189±0.001^a	0.134±0.001^a	3.31±0.17^a	22.76±6.37^a	7.60±1.56^a	5.45±0.59^a	1.30±0.13^a
SF	0.803±0.007	0.174±0.001	0.126±0.001	3.25±0.01	1.090±0.071^ab	0.200±0.010^a	0.141±0.001^a	3.51±0.01^a	35.76±3.09^ab	14.81±1.82^a	11.24±1.77^a	8.30±0.1.72^a
CF	0.805±0.005	0.174±0.002	0.127±0.001	3.25±0.02	1.324±0.007^abc	0.270±0.004^ab	0.194±0.001^ab	4.90±0.13^ab	64.55±3.76^abc	54.66±3.62^ab	53.23±3.58^ab	50.76±3.53^ab
PW	0.807±0.004	0.175±0.001	0.127±0.001	3.26±0.01	1.970±0.175^ef	0.472±0.099^de	0.326±0.002^de	9.13±0.16^e	144.19±8.67^ef	169.91±9.68^de	157.01±9.67^de	180.33±9.52^e
FD	0.801±0.009	0.174±0.001	0.126±0.001	3.24±0.09	1.408±0.097^bcd	0.286±0.068^ab	0.203±0.008^ab	5.32±0.31^abc	76.00±6.25^bcd	64.90±5.37^e	61.43±3.95^abc	64.65±4.03^abc
CF+PW	0.802±0.006	0.174±0.002	0.126±0.001	3.24±0.03	2.089±0.175^f	0.501±0.051^e	0.343±0.007^e	9.42±0.14^e	160.88±9.31^f	188.68±9.34^bcd	172.13±9.89^e	191.23±8.74^e
CF+FD	0.802±0.008	0.174±0.001	0.126±0.001	3.24±0.05	1.607±0.109^cde	0.378±0.078^bcd	0.268±0.007^bcde	7.38±0.48^cde	100.39±5.29^cde	117.79±6.58^de	112.33±6.37^bcde	127.86±5.36^cde
PW+FD	0.803±0.001	0.174±0.001	0.126±0.001	3.24±0.07	1.848±0.171^ef	0.430±0.041^de	0.301±0.001^de	8.38±0.51^de	129.86±9.18^ef	147.02±7.23^bcd	138.41±7.54^de	158.16±5.78^de
CF+PW+FD	0.804±0.002	0.174±0.001	0.126±0.001	3.25±0.03	1.670±0.031^cde	0.367±0.095^bcd	0.260±0.004^bcd	6.72±0.41^bcd	107.62±9.57^cde	110.82±5.36^bcd	105.54±4.29^bcd	106.97±4.19^bcd
FF+CF+PW+FD	0.807±0.004	0.175±0.001	0.127±0.001	3.26±0.01	1.676±0.109^cde	0.395±0.035^cde	0.277±0.001^cde	7.45±0.50^cde	107.60±8.65^cde	125.67±4.31^cde	118.27±4.68^cde	128.48±4.33^cde
FF+SF+CF+PW+FD	0.809±0.001	0.175±0.001	0.127±0.001	3.26±0.01	1.732±0.076^def	0.356±0.069^cde	0.275±0.009^cde	7.31±0.36^cde	113.96±9.76^de	122.81±7.69^cde	116.02±5.17^bcde	123.41±4.69^cde
注：同一列中没有相同字母上标的数值相互之间存在显著差异。WW、DW、P、E分别表示数值以湿重、干重、蛋白质、能量表示 Note: Values without same letter in the same column are different from each other. WW, DW, P, and E mean values expressed in wet weight, dry weight, protein and energy, respectively.

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2.2 不同处理中中国明对虾对不同饵料的总摄食量及组成

中国明对虾在不同处理中摄入的各种饵料的比例不同，在所有与PW同时投喂的处理中，PW以干重、蛋白质、能量形式表示时都占总摄入量的大部分，超过65%(表 3)。而在CF+FD处理中，FD占摄入饵料的大部分，以干重、蛋白质、能量表示时分别为61.27%、52.80%、59.43%(表 3)。在所有其它与FD同时投喂的处理中，FD都占总摄食量的一定比例，超过7%(表 3)。

表 3 不同处理中不同饵料的百分比例(平均值±SE)

Table 3. Percentages of different diets in different treatments (mean±SE)

饵料搭配 diets combination	干重dry weight					蛋白质protein					能量energy
饵料搭配 diets combination	FF	SF	CF	PW	FD	FF	SF	CF	PW	FD	FF	SF	CF	PW	FD
FF	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a
SF	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a
CF	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a
PW	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a
FD	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b	0^a	0^a	0^a	0^a	100^b
CF+PW	0^a	0^a	6.64±0.87^b	93.39±0.86^c	0^a	0^a	0^a	6.25±0.82^b	93.75±0.82^c	0^a	0^a	0^a	6.55±0.86^b	93.45±0.86^c	0^a
CF+FD	0^a	0^a	38.76±6.87^b	0^a	61.27±6.89^c	0^a	0^a	47.20±7.48^b	0^a	52.80±7.48^b	0^a	0^a	40.57±7.03^b	0^a	59.43±7.03^c
PW+FD	0^a	0^a	0^a	75.49±2.92^c	24.50±2.92^b	0^a	0^a	0^a	82.542.27^c	17.46±2.27^b	0^a	0^a	0^a	77.20±2.77^c	22.80±2.77^b
CF+PW+FD	0^a	0^a	5.23±1.95^ab	83.64±4.75^c	11.13±3.98^b	0^a	0^a	5.19±1.93^ab	87.153.75^d	7.66±2.79^c	0^a	0^a	5.26±1.95^ab	84.47±4.49^c	10.27±3.69^b
FF+CF+PW+FD	7.09±2.65^ab	0^a	2.06±0.85^a	72.58±6.58^c	18.19±4.42^b	9.55±3.49^ab	0^a	2.04±0.23^ab	75.926.32^c	12.49±3.19^b	7.62±2.83^ab	0^a	2.06±1.19^a	73.52±6.51^c	16.80±4.14^b
FF+SF+CF+PW+FD	8.52±1.02^a	5.51±0.49^a	0.98±0.15^a	66.61±5.28^c	18.37±4.74^b	11.29±1.30^b	6.97±0.69^ab	0.96±0.31^a	68.364.35^c	12.42±3.35^b	9.11±1.08^ab	5.96±0.54^a	0.98±0.57^a	67.07±5.05^c	16.88±4.40^b
注：同一行中没有相同字母上标的数值相互之间存在显著差异 Note: Values without same letter in the same column are different from each other.

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中国明对虾在不同处理中的总摄食量不同，以单独投喂PW的处理最大，以干重、蛋白质、能量表示时分别为1.352、0.959 g、28.810 kJ；单独投喂FF时摄食量最小，相应的量分别为0.197、0.180 g、4.444 kJ；6个混合投喂处理的摄食量都没有超过单独投喂PW处理的摄食量(表 4)。

表 4 不同处理中对虾摄入的饵料干重、蛋白质和能量(平均值±SE)

Table 4. Total dry weight, protein, and energy of ingested diets in different treatments (mean±SE)

处理treatment	干重/g dry weight	蛋白质/g protein	能量/kJ energy
FF	0.197±0.027^a	0.180±0.024^a	4.444±0.603^a
SF	0.527±0.044^b	0.458±0.038^b	12.047±1.012^b
CF	0.733±0.044^bc	0.487±0.029^bc	15.379±0.922^bc
PW	1.352±0.125^e	0.959±0.089^e	28.810±2.660^f
FD	1.144±0.033^de	0.526±0.015^bcd	22.162±0.647^de
CF+PW	1.150±0.069^de	0.813±0.049^de	24.490±1.478^cde
CF+FD	0.976±0.124^cd	0.528±0.070^bcd	19.530±2.498^bc
PW+FD	1.250±0.086^e	0.809±0.048^de	26.028±1.732^ef
CF+FD+PW	0.933±0.079^cd	0.633±0.052^cd	19.660±1.648^cd
FF +CF+PW+FD	0.909±0.114^cd	0.614±0.074^bcd	19.111±2.356^cd
FF+SF+CF+PW+FD	0.983±0.068^cd	0.676±0.039^cd	20.776±1.375^cde
注：同一列中未标有相同字母的数值相互之间存在显著差异 Note: Values without same letter in the same column are different from each other.

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2.3 不同处理中国明对虾对饵料转化效率(FCE)的预测值与实际值

中国明对虾摄食不同饵料后的实际饵料转化效率(FCE)不同，CF+PW处理的FCE最高，以干重、蛋白质、能量表示时分别为27.86%、26.08%、24.47%，单独投喂FF和SF的处理最低，以3种形式表示时都低于7%(表 5)。在不同饵料搭配的处理中，饵料的实际转化效率除在PW+FD和CF+FD+PW两个处理以干重形式表示时略小于单独投喂PW处理外，均高于所有单独投喂一种饵料的处理(表 5)。所有混合投喂处理的实际饵料转化效率都比预测值高，并且除了PW+FD和CF+FD+PW两个处理的实际值与预测值差异不显著外，其它处理的饵料转化效率实际值都显著高于预测值。

表 5 不同处理中的预测饵料转化效率与实际饵料转化效率(平均值±SE)

Table 5. The estimated food conversion efficiencies and observed food conversion efficiencies of different treatments(mean±SE) %

处理 treatment	干重dry weigh		蛋白质protein		能量energy
处理 treatment	预测值 estimated	实际值 observed	预测值 estimated	实际值 observed	预测值 estimated	实际值 observed
FF	6.37	6.37±0.47^a	3.50	3.50±0.43^a	0.48	0.48±0.13^a
SF	4.92	4.92±0.54^a	3.10	3.10±0.44^a	2.22	2.22±0.45^ab
CF	13.07	13.07±0.86^ab	13.89	13.89±0.92^ab	10.78	10.78±0.73^bcd
PW	21.25	21.25±2.75^bc	20.05	20.05±2.74^bc	19.76	19.76±2.46^de
FD	9.85	9.85±1.59^a	14.71	14.71±2.45^ab	9.44	9.44±1.53^bc
CF+PW	20.71±0.07	^*27.86±3.43^c	19.66±0.05	^*26.08±3.38^bc	19.17±0.08	^*24.74±3.02^e
CF+FD	11.10±0.22	^*22.03±5.63^bc	14.32±0.06	^*28.90±4.56^c	9.99±0.09	^*22.39±5.71^e
PW+FD	18.45±0.33	20.10±2.41^bc	19.12±0.12	21.26±2.82^bc	17.41±0.29	19.39±2.27^de
CF+FD+PW	19.56±0.51	21.11±2.93^bc	19.32±0.21	21.58±3.28^bc	18.23±0.45	18.05±2.58^cde
FF +CF+PW+FD	17.93±0.79	^*24.67±4.13^c	17.68±0.70	^*24.92±4.41^bc	16.37±0.86	^*22.37±3.75^e
FF+SF+CF+PW+FD	16.91±0.62	^*21.91±2.31^bc	16.28±0.39	^*21.84±2.51^bc	15.13±0.58	^*19.43±2.07^de
注：同一列没有相同字母标记的数值相互之间存在显著差异。标有“”的实测值显著比预测值大(P < 0.05) Note: Values without same letter in the same column are different from each other. Observed values with‘’ were significantly higher than the estimated.

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3. 讨论

3.1 中国明对虾同时摄食不同饵料的优势

中国明对虾摄食不同的混合饵料后，在生长速度上都比除了PW外的任何单种饵料投喂的处理有了不同程度的提高，并且CF+PW处理的对虾生长比单独投喂PW快(表 2)，这与南美白对虾^[20]和日本对虾^[9]摄食混合饵料时生长比摄食单种饵料时生长快的现象相同，表明对虾通过不同饵料的搭配，能够提高生长速度，并且这些较高的生长速度不是通过摄食量的显著增加来获得的(表 4)。同时，对虾摄食不同的混合饵料后，饵料转化效率绝大多数比摄食单种饵料时有不同程度的提高，并比假设不同饵料同时投喂时相互之间对饵料转化效率无影响前提下预测的饵料转化效率高(表 5)，而且这种转化效率的提高不是以提高摄食量来实现的(表 4)，表明不同饵料之间存在一种积极的相互作用。这种积极相互作用对对虾摄食策略可能有重要影响，可能是导致对虾杂食性的主要原因之一。一般认为由于喜食饵料的缺乏和季节波动^{[23, 24]}，对虾为减少饥饿和营养不良的胁迫而摄入不十分喜食的饵料。但实验条件下发现即使是喜食饵料过量存在时，对虾也摄入部分不十分喜食的饵料^[8]。由于对虾在天然环境中最喜食的饵料是有限的，如果只摄食某种饵料就需要花较多的能量觅食，而采用不同饵料同时摄入的策略，同样可以获得与摄食单种较好饵料的相当生长速度和饵料转化效率，这样不仅可以节约觅食的能量消耗，也能更有效地利用饵料资源。

3.2 不同饵料搭配对饵料营养和能量特征的影响

不同饵料同时投喂对虾时，对虾在生长和饵料转化效率比投喂单种饵料时好，这种相互作用的产生有可能是由于不同饵料中的氨基酸组成不同，混合摄入后相互补充了必需氨基酸，产生蛋白质的互补作用或氨基酸互补作用^[25]，从而提高了整体的转化效率，也有可能是饵料的其它因素起了重要的作用。尽管饵料中哪些因素对这些积极作用起了主要作用还不十分清楚，但在中国明对虾摄入的饵料中，不同混合饵料的营养和能量特征与单种饵料相比都发生变化(表 1)。值得注意的是在混合饵料中饵料的能量蛋白比(E/P)发生了变化，E/P较高的FD与PW混合后，E/P由42.12降低到37.14 kJ · g^-1，而其它混合组的E/P都为30.70~32.15 kJ · g^-1，这与薛敏等^[26]得到的体重为0.368~0.699和1.025~1.525 g的中国明对虾幼虾最适可消化能量与可消化蛋白(DE/DP)比分别为30.88和28.93 kJ · g^-1的结果非常接近，也与本实验中使对虾生长最好的单种饵料PW的E/P(30.04 kJ · g^-1)非常接近。混合饵料的脂肪含量也比脂肪含量较低的FF、SF、CF有显著提高，达到7.28%~10.53%；并使饵料的脂肪蛋白比(L/P)比FF、SF、CF显著提高，达到0.136~0.162的范围，与使对虾生长最好和饵料转化效率最高的单种饵料PW的L/P值0.155非常接近。而在以往的研究中，都发现了甲壳动物有一个最适的饵料能量蛋白比(E/P)或脂肪蛋白比(L/P)，使动物摄入的饵料能量最大限度地转化为生长能^[26-29]，并且发现在蛋白质得到满足的前提下，能量和脂肪含量的提高都能够显著提高动物对蛋白质的利用率，产生蛋白质的节约作用^{[19, 26, 29, 30]}。在本实验中，可能是由于对虾选择性摄食后，混合饵料中能量蛋白比、脂肪含量和脂肪蛋白比的得到调整，使中国明对虾对饵料的蛋白质利用率提高，从而提高了饵料的转化效率，并获得了不同饵料搭配的积极相互作用。

图 1 罗非鱼TRAP反应体系正交试验优化结果

从左到右依次为正交表L₁₆(4⁵)的1~16个处理；M.100 bp DNA ladder

Figure 1. Result of TRAP reaction system for tilapia optimized with orthogonal design

Number 1~16 represent 16 treatments of L₁₆(4⁵); M. 100 bp DNA ladder

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图 2 罗非鱼TRAP反应体系正交试验直观分析

Figure 2. Direct analysis of TRAP reaction system for tilapia optimized with orthogonal design

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图 3 dNTPs浓度、随机引物浓度和DNA浓度对罗非鱼TRAP的影响

M. 100 bp DNA ladder；1~12. dNTPs浓度、随机引物浓度和DNA浓度各自1~4处理水平

Figure 3. Effects of concentrations of dNTPs, arbitrary primers and template on TRAP reaction system for tilapia

M. 100 bp DNA ladder; 1~12. 1~4 levels of concentrations of dNTPs, random primers and template

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图 4 Mg²⁺浓度和TaqDNA聚合酶浓度对罗非鱼TRAP的影响

M. 100 bp DNA ladder；1~8. Mg²⁺浓度和TaqDNA聚合酶浓度各自1~4处理水平

Figure 4. Effects of concentrations of Mg²⁺ and TaqDNA on TRAP reaction system for tilapia

M. 100 bp DNA ladder; 1~8. 1~4 levels of concentrations of Mg²⁺ and TaqDNA

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图 5 比较正交设计和单因素优化罗非鱼TRAP扩增图

M. 100 bp DNA ladder；O. 正交设计；S. 单因素；1~5. 不同罗非鱼个体

Figure 5. Comparison of amplification results of TRAP reaction system for tilapia between orthogonal design and single factor design

M. 100 bp of DNA ladder; O. orthogonal design; S. single factor; 1~5. different tilapia individuals

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图 6 4个不同罗非鱼群体的TRAP扩增图

M. 100 bp DNA ladder；1~4. 马来西亚红罗非鱼；5~8. 新吉富罗非鱼；9~12. 吉富罗非鱼；13~16. 奥尼罗非鱼

Figure 6. Amplification result of TRAP reaction system for 4 different tilapia populations

M. 100 bp DNA ladder; 1~4. red tilapia; 5~8. New GIFT strain Nile tilapia; 9~12. GIFT strain Nile tilapia; 13~16. O.niloticus×O.aureus

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表 1 试验采用的4个固定引物和6个随机引物序列

Table 1 Sequences of 4 fixed primers and 6 arbitrary primers used in present study

引物 primer		序列 sequence (5′→3′)
固定引物fixed primer	E1	AGATTTCACCAAGGCTGT
	E2	TTATGAATTGCTGGCTTG
	E3	TGAATCCGTCTTCATTCA
	E4	ATCGATGCCTTTGATTTT
随机引物arbitrary primer	Ga3-800	TCATCTCAAACCATCTACAC
	Odd26-700	CTATCTCTCGGGACCAAAC
	Sa12-700	TTCTAGGTAATCCAACAACA
	Trap03-700	CGTAGCGCGTCAATTATG
	Trap13-800	GCGCGATGATAAATTATC
	Em1	GGAACCAAACACATGAAGA

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表 2 红罗非鱼TRAP反应体系L₁₆(4⁵)正交设计

Table 2 L₁₆(4⁵) orthogonal design of red tilapia TRAP reaction system

编号 No.	DNA模板/ng DNA template	镁离子/mmol·L^-1 Mg²⁺	脱氧核苷酸/mmol·L^-1 dNTPs	随机引物/pmol·L^-1 arbitrary primer	TaqNDA聚合酶/U Taq NDA polymerase
1	30	1.0	0.20	0.5	0.3
2	30	1.5	0.25	2.0	0.5
3	30	2.5	0.30	7.0	0.8
4	30	3.0	0.35	10.0	1.1
5	60	1.0	0.25	7.0	1.1
6	60	1.5	0.20	10.0	0.8
7	60	2.5	0.35	0.5	0.5
8	60	3.0	0.30	2.0	0.3
9	90	1.0	0.30	10.0	0.5
10	90	1.5	0.35	7.0	0.3
11	90	2.5	0.20	2.0	1.1
12	90	3.0	0.25	0.5	0.8
13	120	1.0	0.35	2.0	0.8
14	120	1.5	0.30	0.5	1.1
15	120	2.5	0.25	10.0	0.3
16	120	3.0	0.20	7.0	0.5

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表 3 罗非鱼TRAP反应体系正交设计方差分析

Table 3 Variance analysis of TRAP reaction system for tilapia optimized with orthogonal design

变异来源 source	极差 range	方差 SS	F	均方 MS	标准差 X±SD
模板 template	6.750	153.188	2.428	51.063	12.37
二价镁离子 Mg²⁺	4.750	54.688	0.867	18.229	7.39
三磷脱氧核糖核酸 dNTPs	2.500	13.688	0.217	4.563	3.70
随机引物 arbitrary primer	4.750	50.688	0.803	16.896	7.12
TaqDNA聚合酶 TaqDNA	4.250	43.188	0.685	14.396	6.57
共计 total		315.440

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1. 材料和方法
1.1 饵料的准备
1.2 实验养殖设施及条件
1.3 实验用虾来源及驯化
1.4 实验设计
1.5 样品的收集和测定
1.6 数据计算
1.7 数据的统计分析
2. 实验结果
2.1 中国明对虾的生长
2.2 不同处理中中国明对虾对不同饵料的总摄食量及组成
2.3 不同处理中国明对虾对饵料转化效率(FCE)的预测值与实际值
3. 讨论
3.1 中国明对虾同时摄食不同饵料的优势
3.2 不同饵料搭配对饵料营养和能量特征的影响

1. 材料和方法
1.1 饵料的准备
1.2 实验养殖设施及条件
1.3 实验用虾来源及驯化
1.4 实验设计
1.5 样品的收集和测定
1.6 数据计算
1.7 数据的统计分析
2. 实验结果
2.1 中国明对虾的生长
2.2 不同处理中中国明对虾对不同饵料的总摄食量及组成
2.3 不同处理中国明对虾对饵料转化效率(FCE)的预测值与实际值
3. 讨论
3.1 中国明对虾同时摄食不同饵料的优势
3.2 不同饵料搭配对饵料营养和能量特征的影响

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罗非鱼TRAP分子标记反应体系优化设计方案的比较

作者简介: 马庆男(1985-)，男，硕士研究生，从事鱼类遗传育种研究。E-mail: ma_qingnan@163.com

通讯作者: 董在杰，E-mail: dongzj@ffrc.cn

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