咔唑法与间苯三酚法测定硫酸软骨素比较研究

魏涯, 赵永强, 郝淑贤, 岑剑伟, 黄卉, 李来好

魏涯, 赵永强, 郝淑贤, 岑剑伟, 黄卉, 李来好. 咔唑法与间苯三酚法测定硫酸软骨素比较研究[J]. 南方水产科学, 2012, 8(6): 65-71. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.06.010
引用本文: 魏涯, 赵永强, 郝淑贤, 岑剑伟, 黄卉, 李来好. 咔唑法与间苯三酚法测定硫酸软骨素比较研究[J]. 南方水产科学, 2012, 8(6): 65-71. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.06.010
WEI Ya, ZHAO Yongqiang, HAO Shuxian, CEN Jianwei, HUANG Hui, LI Laihao. Comparison of carbazole method and phloroglucinol method for chondroitin sulfate determination[J]. South China Fisheries Science, 2012, 8(6): 65-71. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.06.010
Citation: WEI Ya, ZHAO Yongqiang, HAO Shuxian, CEN Jianwei, HUANG Hui, LI Laihao. Comparison of carbazole method and phloroglucinol method for chondroitin sulfate determination[J]. South China Fisheries Science, 2012, 8(6): 65-71. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.06.010

咔唑法与间苯三酚法测定硫酸软骨素比较研究

基金项目: 

公益性行业(农业)科研专项 201003055-06

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国水产科学研究院南海水产研究所)资助项目 2012YD01

详细信息
    作者简介:

    魏涯(1983-),女,硕士,研究实习员,从事水产品加工与质量安全研究。E-mail: weiya1009@gmail.com

    通讯作者:

    李来好,E-mail: laihaoli@163.com

  • 中图分类号: O657.32

Comparison of carbazole method and phloroglucinol method for chondroitin sulfate determination

  • 摘要:

    硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)经水解和显色后,分别采用咔唑法与间苯三酚法测定其质量浓度,并对这2种方法进行比较。结果显示,咔唑法ρ(CS)和间苯三酚法ρ(CS)分别在0.01~0.05 mg·mL-1和0.1~1.0 mg·mL-1范围内与其吸光度值呈良好的线性关系。对同一样品进行6次平行试验,咔唑法的相对标准偏差(RSD)为3.90%,间苯三酚法的RSD为4.28%,均具有较高的精密度。对这2种方法分别进行3个不同加标水平的回收率试验,咔唑法的加标回收率为98.0%~102.5%,间苯三酚法为83.2%~106.6%。因此,咔唑法与间苯三酚法均能准确测定CS的质量浓度。

    Abstract:

    We compared the determinations of the concentrations of hydrolyzed and colored chondroitin sulfate (CS) by carbazole method and phloroglucinol method. The results reveal that the CS concentration by carbazole method and phloroglucinol method showed good linear relationship with their absorbance values within the ranges of 0.01~0.05 mg·mL-1 and 0.1~1.0 mg·mL-1, respectively. After 6 parallel tests on the same sample, the relative standard deviations (RSD) by carbazole method and phloroglucinol method were 3.90% and 4.28%, respectively, both with high precision. The two methods were spiked with 3 levels; the recoveries of carbazole method and phloroglucinol method were 98.0%~102.5% and 83.2%~106.6%, respectively. Thus, both carbazole method and phloroglucinol method can determine CS concentration accurately.

  • 虾青素(astaxanthin)是具有超强抗氧化活性的类胡萝卜素,其脂溶性自由基淬灭活力是β-胡萝卜素的10倍、维生素E的100倍[1-2],同时具有抵御紫外线、抗肿瘤、提高免疫力、增强神经连通和改善生育等作用[3-7],在食品添加剂、水产养殖、化妆品及保健品等方面具有广阔的应用前景[8-9]。鉴于虾青素的诸多功能和用途,其已成为一种极受欢迎的产品,因而做好提取是保证应用的前提。中国具有大量的甲壳类废弃资源,虾青素在甲壳类水产品中主要以酯化形式存在,游离形式比例较少,仅占15%左右[10]。用有机溶剂直接提取虾青素的萃取率较低,酯化形式的存在增加了虾青素的提取难度,内源酶可通过酶解作用裂解酯键增加虾青素的萃取率。内源酶主要位于虾头中,是虾消化系统中不可或缺的重要成分。虾头内源酶以蛋白酶、酯酶、几丁质酶和多酚氧化酶为主,种类多达几十种[11],具有解离虾青素的作用,其中以蛋白酶的活性最高[12]。以虾仁加工的下脚料为原料,内源酶酶解后,选取影响酶解效果的主要因素,确定最佳酶解条件, 而最佳酶解条件的确定,是保证虾壳资源中虾青素高值开发利用的有效途径之一。

    虾壳,鲜活凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)购自广州华润万家超市;乙酸乙酯(分析纯);虾青素标准品(纯度95.8%,德国Dr);乙腈、甲醇、四氢呋喃(色谱纯);脂肪酶(5 000 U·g-1,深圳市数康威生物科技有限公司出品)。

    TD5自动平衡离心机(长沙英泰仪器有限责任公司出品);Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司出品);DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司出品);PHB-3便携式pH计(上海三信仪表厂出品);MMV-1000W震荡仪(托普仪器有限公司出品);Transsonic TI-H 10超声波清洗仪(德国Elma公司出品);N-1000旋转蒸发仪(日本EYELA出品);SUPELCO固相萃取装置(美国产);CNW C18固相萃取柱(上海安谱出品)。

    冷冻虾壳→绞碎→分装→冷冻保存→取样→调pH→恒温水浴酶解→灭活→萃取→净化→上机检测

    样品的处理及检测参照文献中虾青素的提取和检测方法[13-15],略作修改。取冷冻虾壳于绞肉机中快速绞碎,分装成若干个小袋,;置于-18 ℃的冰箱中冷冻保存,现取现用。取5 g虾壳在适当的条件下酶解一定的时间灭活后,再加入一定量的乙酸乙酯。具体操作是将其超声处理(35 kHz)30 min,再震荡15 min,离心(4 500 r·min-1,5 min),收集上清液,向料渣中加入提取剂,重复操作2次,合并所得上清液,60 ℃减压蒸馏,可得虾青素粗提品。甲醇复溶蒸馏残留物,CNW C18固相萃取柱净化处理后,过0.22 μm滤膜后依照色谱检测条件进行检测。

    净化。取5 mL甲醇活化CNW C18固相萃取柱,然后转移2 mL甲醇虾青素溶液至C18柱中,用10 mL甲醇洗脱,分4次添加到柱中,调节流速,使其以3 mL·min-1的流速流出,收集全部洗脱液,60 ℃减压蒸干。

    检测条件。色谱柱为GraceSmart RP-18 5u,250 mm×4.6 mm;id.5 μm;柱温30 ℃;流动相V(甲醇): V(乙腈)=75:25,流速1.0 mL·min-1;检测波长476 nm;进样量20 μL。

    酶解反应条件温和,对虾青素破坏小,是提取虾青素最有前途的方法之一。通过改变试验因素及其水平,可以确定最佳单因素水平。结合单因素试验结果,设计正交试验,优化提取工艺,按照表 1各因素水平进行L9(34)正交试验。

    表  1  内源酶酶解因素水平表[L9(34)]
    Table  1.  Factors and levels of[L9(34)] orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
    水平
    level
    因素 factor
    A: pH B: 温度/℃ C: 时间/h
    1 4.0 40 1.0
    2 5.0 45 1.5
    3 6.0 50 2.0
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    在虾壳原料中添加质量比为2%脂肪酶进行酶解反应,与空白比较脂肪酶对提取效果的影响。

    样品中虾青素的萃取率以液相测量值转化而来,即:

    $$ X=A \times \frac{V}{m} \times \frac{V_2}{V_1} $$

    式中X为样品中虾青素的萃取率(μg·g-1);A为萃取液中虾青素的质量浓度(μg·mL-1);m为样品的称取量(g);V为初次定容体积(mL);V1为过固相萃取柱溶液的体积(mL);V2为固相萃取柱洗脱液蒸干后复溶的体积(mL)。

    称取5 g绞碎的冷冻虾壳,用磷酸缓冲液调pH,保持其他因素不变,分别改变酶解温度进行处理。所选温度为30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和60 ℃共6个梯度作为因素水平,酶解1.0 h。80 ℃灭活后加入一定量的乙酸乙酯萃取,萃取液净化过膜后进行色谱检测。随着温度的升高,虾青素的萃取率逐渐提高,但温度达40 ℃以上时萃取率不再增加(图 1)。这可能由于温度的升高使酶活性开始降低,不利于内源酶的酶解,使虾青素的萃取率下降,也可能由于温度过高使内源酶活性丧失,游离虾青素释放难度加大。因此,内源酶解的最适温度约为40 ℃。

    图  1  温度对虾青素提取效果的影响
    Figure  1.  Effect of temperature on astaxanthin extraction

    称取5 g绞碎的冷冻虾壳,用磷酸缓冲液调pH为3.0、4.0、5.0、5.5、6.5和8.0,40 ℃温浴酶解l.0 h。80 ℃灭活后加入一定量的乙酸乙酯萃取,萃取液净化过膜后进行色谱检测,以确定酶解最适pH。由于虾青素对碱不稳定,酶解pH的选取范围为4.0~8.0。pH在4.0~6.0时效果较好,当pH大于6.0后酶解效果迅速下降(图 2),pH过高可能会破坏虾青素的结构。因而虾青素酶解的最适pH为4.0~6.0附近。

    图  2  pH对虾青素的提取效果
    Figure  2.  Effect of pH on astaxanthin extraction

    称取5 g绞碎的虾壳,用磷酸缓冲液调pH为6.0,设定温浴温度为40 ℃。在0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h进行酶解,加入一定量的乙酸乙酯萃取,萃取液净化过膜后进行色谱检测。在酶解的初期,随着酶解过程的进行,虾壳中虾青素萃取率逐渐上升,当酶解时间达2.0 h后虾青素萃取率开始下降(图 3)。这主要是因为随着反应的进行,酶解pH发生了变化,使部分酶活力降低,加上酶解产物反馈抑制作用等因素,使虾青素在萃取液中不稳定而降解。因此,内源酶酶解最佳时间为2.0 h。

    图  3  时间对虾青素提取效果的影响
    Figure  3.  Effect of time on astaxanthin extraction

    为了确定最佳酶解条件,选择酶解时间、酶解温度和酶解pH这3个因素分别采用3个水平进行正交试验,对内源酶的酶解条件优化。正交试验的酶解温度选取40 ℃、45 ℃和50 ℃;酶解pH选取4.0、5.0和6.0;酶解时间选取1.0 h、1.5 h和2.0 h。试验分别以乙酸乙酯为提取剂,以原料中虾青素的萃取率作为考核指标,其正交试验L9(34)结果见表 2,方差分析见表 3。在试验水平变化范围内,时间对内源酶解的影响显著,温度和酶解pH对酶解效果有一定的影响但不显著。正交表的极差分析显示,内源酶酶解虾壳虾青素的最佳工艺条件为A1B3C2,即酶解pH 4.0,酶解温度50 ℃,酶解时间1.5 h。因素主次为C>B>A,即酶解时间为主要因素,其次为酶解温度和酶解pH。鉴于正交试验表中已包括A1B3C2试验,直接从正交表即可看到最佳条件,而该结果也是该组试验中的最佳值。通过对比试验可知,未对样品进行酶解处理时,虾青素的萃取率约25 μg·g-1,酶解处理后约32.16 μg·g-1,可提高约28%。可见,酶解处理对提高虾青素萃取率具有较好的促进作用。

    表  2  L9(34)内源酶酶解正交试验表
    Table  2.  L9(34) orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
    试验号
    trial No.
    因素 factor 萃取率/μg·g-1
    yield
    A: pH B: 温度/℃ C: 时间/h
    1 1 1 1 26.68
    2 2 2 2 32.06
    3 3 3 3 28.29
    4 1 2 3 28.43
    5 2 3 1 28.28
    6 3 1 2 31.24
    7 1 3 2 32.16
    8 2 1 3 26.90
    9 3 2 1 27.61
    k1 29.09 28.28 27.53
    k2 29.08 29.37 31.82
    k3 29.05 29.58 27.88
    R 0.04 1.30 4.30
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    表  3  L9(34)内源酶解正交表方差分析
    Table  3.  L9(34) analysis of orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
    因素
    factor
    偏差平方和
    sum of square of deviations
    自由度
    degree of freedom
    F
    ratio of F
    F临界值
    critical value of F
    显著性
    significance
    pH 0 2 0 6.94
    温度 temperature 2.93 2 2.00 6.94
    时间 time 34.16 2 23.28 6.94 *
    误差 error 2.94 4
    注:*.水平显著(P < 0.05)
    Note: *. significant difference(P < 0.05)
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    向含有内源酶的虾壳中添加脂肪酶,以探究脂肪酶对虾青素提取效果的影响。脂肪酶活力约5 000 U·g-1,活力较高,添加量约占原料质量2%(表 4)。脂肪酶对虾青素的提取效果并无促进作用,因而脂肪酶不适宜用作虾青素的辅助提取酶。相对标准偏差较低,各水平稳定性较好,试验数据可靠。

    表  4  脂肪酶对虾青素提取效果的影响
    Table  4.  Effect of lipase on astaxanthin extraction
    脂肪酶量
    addition of lipase
    pH 温度/℃
    temperature
    时间/h
    time
    萃取率/μg·g-1
    yield
    平均萃取率/μg·g-1
    average yield
    相对标准偏差/%
    RSD
    0 4.0 50 1.5 32.85
    0 4.0 50 1.5 33.23 32.98 0.22
    0 4.0 50 1.5 32.86
    2% 4.0 50 1.5 30.62
    2% 4.0 50 1.5 34.36 32.63 1.89
    2% 4.0 50 1.5 32.91
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    顾晨光和王建军[12]报道,虾体内存在着活性很高的水解酶系即内源酶,这些酶有60%集中在头部。下脚料中的虾头占有很大的比例,内源酶丰富。内源酶来源于原料本身,具有方便易得、活性高的特点,能促使原料自溶。章超桦等[16]报道紫外线对虾头自溶具有较好的促进作用,但由于虾青素对防止紫外线的脂质过氧化具有较好的作用[17],这种作用是以自我降解为代价的,因而虾青素在紫外照射下很不稳定,紫外照射快速自溶技术不适用于虾青素的解离,故自溶酶解时仅选用温度、pH和酶解时间作为虾青素的酶解影响条件。

    脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶,可以催化一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应,脂肪酶在水-有机溶剂双向体系中催化油脂水解,则可大大提高油脂水解度[18]。该试验为了使处理条件和内源酶解条件一致,在磷酸缓冲液中加入了脂肪酶,通过仅用内源酶提取结果比较可知,脂肪酶对虾青素的提取影响不显著。原因可能是该缓冲液环境不适合脂肪酶活性的表达,也可能是脂肪酶对虾青素的酶解不起作用,具体情况有待进一步研究。

    赵仪等[19]以总类胡萝卜素的萃取率作为评价指标,得出木瓜蛋白酶处理组的萃取率比仅用有机溶剂提取提高19.88%。内源酶解萃取率比仅用有机试剂提取提高28%,可见内源酶解效果较好。笔者在虾青素有机提取工艺的基础上,进行内源酶酶解处理,得出温度50 ℃、pH 4.0、酶解1.5 h时,虾青素提取效果最佳。温度、pH和酶解时间是影响虾青素提取效果的主要因素。温度太高或太低都会影响虾壳中内源酶的活性,只有温度适宜才利于内源酶中蛋白酶活性的表达。正交结果表明,虾青素的萃取率在约50 ℃时最佳,该结果与钱飞等[20]的研究结果大致相符。pH影响提取效果的原因是蛋白酶中以碱性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶活性最高[20],在弱碱性条件下,碱性蛋白酶活性较高,但虾青素在弱碱性条件下易分解,所以虾青素萃取率有随碱性环境的提高而降低的趋势;同样虾青素在酸性条件下亦不稳定[21]。pH的单因素及正交试验结果表明,pH 4.0时虾青素的萃取率相对较高,pH 5.0时虾青素的萃取率较pH 4.0和pH 6.0低,钱飞等[20]对木瓜蛋白酶水解克氏原螯虾(Procambarus clarkia)虾壳提取虾青素的研究中也出现pH为5.0时类胡萝卜素萃取率较低的现象。这可能是由于该pH是两者发挥作用酶的等电点,不利于酶与底物的结合,具体原因有待研究。当然,上述2种因素的影响都是在一定的时间基础上才得以体现的。由正交试验的结果可知,酶解时间较短时,酶解作用不充分,酶解效果不好,酶解时间在约1.5 h时达到较佳值。当酶解时间大于1.5 h时,随着酶解时间的延长虾青素的提取效果逐渐下降,这可能是由于虾青素在这种条件下不稳定,逐渐分解。

    通过内源酶对蛋白的酶解试验可知,内源酶具有促进虾青素与结合蛋白解离的作用。该试验仅从影响酶活性的几个因素考虑酶解效果,其他增加内源酶酶解的因素还有待于进一步的探讨。

  • 图  1   不同体积浓盐酸对吸光度值的影响

    a. 0.5 mL浓盐酸;b. 1.0 mL浓盐酸;c. 1.5 mL浓盐酸;d. 2.0 mL浓盐酸;e. 2.5 mL浓盐酸

    Figure  1.   Effect of concentrated hydrochloric acid (HCl) at different volumes on absorbance value

    a. 0.5 mL HCl; b. 1.0 mL HCl; c. 1.5 mL HCl; d. 2.0 mL HCl; e. 2.5 mL HCl

    图  2   咔唑法(a)和间苯三酚法(b)不同水解时间对吸光度值的影响

    Figure  2.   Effect of different hydrolysis time on absorbance value for carbazole method (a) and phloroglucinol method (b)

    图  3   咔唑法(a)和间苯三酚法(b)显色时间对吸光度值的影响

    Figure  3.   Effect of different coloration time on absorbance value for carbazole method (a) and phloroglucinol method (b)

    图  4   咔唑法吸光度值(a)和间苯三酚法吸光度值(b)随时间变化规律

    Figure  4.   Law of absorbance value changed with time for carbazole method(a) and phloroglucinol method(b)

    图  5   咔唑法(a)和间苯三酚法(b)标准曲线

    Figure  5.   Standard curves of carbozole method (a) and phloroglucind method (b)

    表  1   咔唑法与间苯三酚法加标回收率试验结果

    Table  1   Recovery of standard addition of carbazole method and phloroglucinol method

    方法
    method
    本底值/mg
    background value
    加标量/mg
    spiked amount
    测定值/mg
    measured value
    回收率/%
    recovery
    咔唑法 carbazole method 0 0.04 0.041 102.5
    0.10 0.098 98.0
    0.20 0.199 99.5
    间苯三酚法 phloroglucinol method 0 0.50 0.416 83.2
    2.00 2.132 106.6
    4.00 3.834 95.9
    下载: 导出CSV

    表  2   咔唑法与间苯三酚法精密度试验结果

    Table  2   Precisions of carbazole method and phloroglucinol method

    方法
    method
    试验结果/mg·mL-1 result 平均数
    mean
    RSD/%
    1 2 3 4 5 6
    咔唑法 carbazole method 0.197 0.193 0.191 0.185 0.180 0.178 0.187±0.007 3.90
    间苯三酚法 phloroglucinol method 3.243 3.123 2.907 3.171 3.275 3.059 3.130±0.134 4.28
    下载: 导出CSV
  • [1] 李瑞国. 硫酸软骨素不同生产工艺的考察[J]. 中国医药工业杂志, 2003, 34(5): 221-222. https://www.doc88.com/p-4147988728578.html

    LI Ruiguo. Exploration of different process for production of chondroitin sulfate[J]. Chin J Pharm, 2003, 34(5): 221-222. (in Chinese) https://www.doc88.com/p-4147988728578.html

    [2] 齐敬总, 闫晓玲, 王凤山. 硫酸软骨素含量测定方法介绍[J]. 中国生化药物杂志, 2002, 23(3): 162-164. doi: 10.3969/j.issn.1005-1678.2002.03.025

    QI Jingzong, YAN Xiaoling, WANG Fengshan. Introduction of the determination methods of chondroitin sulfate[J]. Chin J Biochem Pharm, 2002, 23(3): 162-164. (in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1005-1678.2002.03.025

    [3]

    NISHIDA K. Tissue engineering of the cornea[J]. Cornea, 2003, 22(7): 28-34. doi: 10.1097/00003226-200310001-00005

    [4] 余洪华, 邓金印. 干眼诊治的临床研究[J]. 国际眼科杂志, 2006, 6(5): 1179-1180.

    YU Honghua, DENG Jinyin. The clinical research on diagnosis and treatment of dry eye[J]. Int J Ophthalmol, 2006, 6(5): 1179-1180. (in Chinese)

    [5]

    CLEGG D O, REDA D J, HARRIS C L, et al. Glucosamine, chondroitin sulfate, and the two in combination for painful knee osteoarthritis[J]. New Engl J Med, 2006, 354(8): 795-808. doi: 10.1056/NEJMoa052771

    [6]

    CAMEJO G, HURT E, WIKLUND O, et al. Modifications of low-density lipoprotein induced by arterial proteoglycans and chondroitin-6-sulfate[J]. Biochimicaet Biophysica Acta, 1991, 1069(3): 253-261. doi: 10.1016/0925-4439(91)90013-y

    [7] 李南. 硫酸软骨素的开发及生产工艺控制[J]. 上海水产大学学报, 1998, 7(1): 38-43. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=3139813

    LI Nan. Development and processing control of chondroitin sulfate[J]. J Shanghai Fish Univ, 1998, 7(1): 38-43. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=3139813

    [8]

    TÍMÁR J, DICZHÁZI C, BARTHA I, et al. Modulation of heparan-sulphate/chondroitin-sulphate ratio by glycosaminoglycan biosynthesis inhibitors affects liver metastatic potential of tumor cells[J]. Int J Cancer, 1995, 62(6): 755-761. doi: 10.1002/ijc.2910620618

    [9]

    CURATELLA B, BARTOLINI B, DI CARO A, et al. Sepharose-bound, highly sulfated glycosaminoglycans can capture HIV-1 from culture medium[J]. Carbohydr Res, 2005, 340(4): 759-764. doi: 10.1016/j.carres.2004.12.017

    [10] 俆庆阳, 黎兴荣, 石墨, 等, 硫酸软骨素研究现状[J]. 生物技术通讯, 2006, 15(6): 633-635. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=11738133&from=Qikan_Search_Index

    XU Qingyang, LI Xingrong, SHI Mo, et al. Chondroitin sulfate research[J]. Biotechnology, 2006, 15(6): 633-635. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=11738133&from=Qikan_Search_Index

    [11] 牛增元, 张小吐, 刘钢, 等. 反相离子对高效液相色谱法测定硫酸软骨素[J]. 化学分析计量, 2002, 11(4): 7-9. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=6544549&from=Qikan_Search_Index

    NIU Zengyuan, ZHANG Xiaotu, LIU Gang, et al. Reversed-phase ion-pair HPLC determination of chondroitin sulfate[J]. Chem Anal, 2002, 11(4): 7-9. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=6544549&from=Qikan_Search_Index

    [12] 夏传俊, 孟菁, 杨耿. 反相高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量[J]. 安徽师范大学学报: 自然科学版, 2000, 23(4): 354-355. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=4523987&from=Qikan_Search_Index

    XIA Chuanjun, MENG Jing, YANG Geng. RP-HPLC method for the determination of chondroitin sulfate[J]. Anhui Normal Univ: Natural Science, 2000, 23(4): 354-355. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=4523987&from=Qikan_Search_Index

    [13] 茅力. 离子色谱法测定硫酸软骨素的含量[J]. 中国药科大学学报, 1998, 29(5): 358-361. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=3305740&from=Qikan_Search_Index

    MAO Li. Ion chromatographic determination of the content of chondroitin sulfate[J]. China Pharm Univ, 1998, 29(5): 358-361. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=3305740&from=Qikan_Search_Index

    [14] 茅力, 吕志宏, 陈景衡. 间接原子吸收法测定鲨鱼软骨粉中硫酸软骨素[J]. 中华预防医学杂志, 1998, 32(3): 183-184. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=2991969&from=Qikan_Search_Index

    MAO Li, LV Zhihong, CHEN Jingheng. Indirect atomic absorption method for the determination of chondroitin sulfate, shark cartilage powder[J]. J Preventive Med, 1998, 32(3): 183-184. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=2991969&from=Qikan_Search_Index

    [15] 施文健, 祝信贤. 碱性艳蓝BO分光光度法测定硫酸软骨素[J]. 中国生化药物杂志, 2004, 25(1): 28-30. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=9190458&from=Qikan_Search_Index

    SHI Wenjian, ZHU Xinxian. Pure blue BO spectrophotometric determination of chondroitin sulfate[J]. Chin J Biochem Pharm, 2004, 25(1): 28-30. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=9190458&from=Qikan_Search_Index

    [16] 丁雅勤, 孙伟, 高瑞芳, 等. 吖啶橙分光光度法测定硫酸软骨素含量[J]. 中国生化药物杂志, 2006, 27(2): 68-70. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=21657970&from=Qikan_Search_Index

    DING Yaqin, SUN Wei, GAO Ruifang, et al. Acridine orange spectrophotometric determination of chondroitin sulfate[J]. Chin J Biochem Pharm, 2006, 27(2): 68-70. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=21657970&from=Qikan_Search_Index

    [17] 陈媛媛, 蒋治良, 李振中, 等. 维多利亚蓝B分光光度法测定硫酸软骨素[J]. 光谱学与光谱分析, 2006, 26(6): 1148-1150. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=22169541&from=Qikan_Search_Index

    CHEN Yuanyuan, JIANG Zhiliang, LI Zhenzhong, et al. Victoria blue B spectrophotometric determination of chondroitin sulfate[J]. Spectros Spect Anal, 2006, 26(6): 1148-1150. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=22169541&from=Qikan_Search_Index

    [18] 高照明, 张玉冰, 于永良. 核磁共振内标法定量分析肝素钠中多硫酸软骨素[J]. 分析化学, 2011, 39(4): 601-602. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=37332036&from=Qikan_Search_Index

    GAO Zhaoming, ZHANG Yubing, YU Yongliang. Analysis of oversulfated chondroitin sulfate in contaminated heparin by 1H-NMR internal standard method[J]. Chin J Anal Chem, 2011, 39(4): 601-602. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=37332036&from=Qikan_Search_Index

    [19]

    HOMERK A, DENBOW L, BEIGHTON D. Spectrophotometric method for assay of glycosam in-oglycans and glycosam inpglycan depolymerzin enzymes[J]. Anal Biochem, 1993, 214: 435-441.

    [20] 杜美菊, 凌翠霞, 丁秀云. 中性红光法度测定硫酸软骨素含量[J]. 理化检验-化学分册, 2006, 42(8): 662-663. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=22588262&from=Qikan_Search_Index

    DU Meiju, LING Cuixia, DING Xiuyun. Neutral red testimonies determination of chondroitin sulfate[J]. TESTING: Chem Anal, 2006, 42(8): 662-663. (in Chinese) https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=22588262&from=Qikan_Search_Index

    [21]

    LAUDER R, HUCKERBY T, NIEDUSZYNSK I J. A fingerprinting method for chondroit in dematan sulphate determination of hyaluronan and oligosaecharides[J]. Glyrobiology, 2000, 10(4): 393-401.

图(5)  /  表(2)
计量
  • 文章访问数: 
  • HTML全文浏览量: 
  • PDF下载量: 
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2012-03-06
  • 修回日期:  2012-06-20
  • 刊出日期:  2012-12-04

目录

/

返回文章
返回