喹诺酮(Quinolones)类药物是近年来使用广泛的一类新型抗菌药物^[1]，因具有抗菌谱广、抗菌活性强、组织穿透力强、价格低廉及与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点而广泛应用于动物和人类多种感染性疾病的预防和治疗。但药物的使用不可避免在动物体内产生一定的残留，从而对人类食用动物源性食品带来安全隐患，因此，各国对喹诺酮类药物的检查一直都非常严格^[2-3]。笔者建立了同时检测水产品中19种喹诺酮类药物残留量的液质联用法，并对分析测试结果的不确定度进行评定，以验证方法的准确性。

测量不确定度用来表征被测量值在某一个范围内的一个估计，是一种可以替代误差、能够更加合理地表征测量值分散性的评定表示方法^[4]。《实验室资质认定评审准则》^[5]中也有规定，当不确定度与检测和校准结果的有效性或应用性有关、或客户要求、或不确定度影响到对结果符合性的判定时，报告中都需要包括不确定度信息。因此，对新建立的检测方法进行不确定度分析十分必要。

目前针对水产品中多种喹诺酮类药物残留量检测结果进行的不确定度评定文献较少，笔者参考《测量不确定度评定与表示指南》^[6]中的理论依据和建立不确定度数学模型的步骤以及相关文献资料^[7-12]，对试验测得的结果进行不确定度评定，给出测量结果的不确定度报告，找出试验过程中对结果影响较大的因素，以便在今后的试验过程中避免或减小其对测量结果的不确定度影响，使试验结果具有更高的精确度，方法更加可靠。

1.   试验与方法

1.1   仪器与试剂

Accela TSQ Quantum Access高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司出品)；1 mL移液管；移液枪；分析天平感量为0.000 1 g和0.01 g(梅特勒-托利多有限公司出品)；10 mL、100 mL容量瓶。

19种喹诺酮类药物标准品，纯度均大于98%(德国Dr. Ehrenstofer公司出品)；正己烷、乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司出品)；去离子水。

1.2   标准品配制

准确称取适量标准品，加入200 μL甲酸，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，此溶液质量浓度为100 μg · mL^-1。

1.3   样品提取净化

称取5 g(精确至0.01 g)试样，于100 mL塑料离心管中，加入10 g无水硫酸钠，涡旋混匀，再加入20 mL甲酸-乙腈溶液[V(甲酸) : V(乙腈溶液)=1 : 99]，涡旋混合1 min，超声提取8 min。于2 500 r · min^-1离心5 min，取上清液于分液漏斗内；样品残渣再加入20 mL甲酸-乙腈溶液[V(甲酸) : V(乙腈溶液)=1 : 99]，重复上述操作，合并上清液于分液漏斗中。

向分液漏斗中加入30 mL乙腈饱和正己烷，剧烈震荡2 min后静置，取下层清液于50 mL圆底烧瓶中，于40 ℃下旋蒸至近干，再于40 ℃下氮气吹干。1.5 mL初始配比的流动相定容，1 mL乙腈饱和正己烷除脂，13 000 r · min^-1离心，取下层清液，过0.22 μm滤膜，滤液待测。

2.   被测量值的数学模型

试验过程中各分量不确定度来源见图 1。

图  1  不确定度分量来源图

Figure  1.  Source of uncertainty components

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水产品中19种喹诺酮类药物(氟甲喹、噁喹酸、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、双氟沙星、西诺沙星、奥比沙星、麻保沙星、萘啶酸、氟罗沙星和吡哌酸)质量分数计算的数学模型为：

式中X为试样中被测组分的质量分数(μg · kg^-1)；c为回归方程拟合得到的样品溶液质量浓度(μg · mL^-1)；V为试样最终定容体积(mL)；m为称取试样质量(g)；f_r为所测样品中待测物质回收率；f_Q为液质联用仪定量校正影响因子。

以上各种因素都会对测量结果的不确定度产生影响，其最终合成不确定度的计算公式为：

3.   各分量不确定度计算(以噁喹酸为例计算)

3.1   标准溶液配制引入的不确定度

3.1.1   原始标准物质引入的不确定度

19种标准物质的来源、纯度及扩展不确定度见表 1。

表  1  19种标准物质的来源、纯度及扩展不确定度

Table  1.  Source, purity and expand uncertainty of 19 standard substances

标准品standard substance	来源source	纯度/% purity	扩展不确定度/% expand uncertainty
噁喹酸Oxolinic acid	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
氟甲喹Flumequin	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
诺氟沙星Norfloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	99.5	0.5
依诺沙星Enoxacin	美国Sigma-Aldrich	99.5	0.5
环丙沙星Ciprofloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	95.0	1.0
培氟沙星Pefloxacin	美国Sigma-Aldrich	99.0	0.5
洛美沙星Lomefloxacin	美国Sigma-Aldrich	99.0	0.5
丹诺沙星Danofloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	94.0	1.0
恩诺沙星Enrofloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
氧氟沙星Ofloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
沙拉沙星Sarafloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	94.0	1.0
司帕沙星Sparfloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
双氟沙星Difloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
西诺沙星Cinoxacin	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
萘啶酸Nalidixic	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
奥比沙星Obifloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
麻保沙星Marbofloxacin	德国Dr.Ehrenstofer	98.5	0.5
氟罗沙星Fleroxcacin	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5
吡哌酸Pipemidic	德国Dr.Ehrenstofer	99.0	0.5

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标准物质给出的是扩展不确定度，属正态分布，置信概率P=95%，包含因子k=2，为B类评定，其相对标准不确定度分别为(以噁喹酸为例计算)：

噁喹酸：$u_{p_1}=\frac{0.5}{2}=0.25$

根据上述计算公式可求得各标准物质的相对标准不确定度，其中环丙沙星和洛美沙星为0.005，其余17种物质为0.002 5。

3.1.2   称量引入的不确定度

标准物质的称量质量为0.010 0 g，称量天平是分度值为0.1 mg的分析天平，称量的扩展不确定度为0.05 mg，包含因子k=2，为B类评定。其不确定为：$u_{m_x}=\frac{U}{k}=\frac{0.05}{2}=0.025$，相对标准不确定为：$u_{m_x \text { rel }}=\frac{u_{m_x}}{m_x} \times 100 \%=\frac{0.025}{0.01 \times 10^3} \times 100 \%=0.25 \%$。

3.1.3   标准溶液定容引入的不确定度

按照JJG196-1990《常用玻璃量具检定规程》^[13]，100 mL容量瓶(A级)最大允许误差为±0.10 mL，满足矩形分布，$k=\sqrt{3}$，为B类评定。不确定度为：$u_3=\frac{0.10}{\sqrt{3}}=0.058(\mathrm{~mL})$，相对不确定度为：$u_{\text {mrel }}=\frac{u_3}{m} \times 100 \%=\frac{0.0577}{100} \times 100 \%=0.058 \%$。

容量瓶在20 ℃下校准，试验在25 ℃下进行，两者由于温度不同引起的体积变化为±100 mL×5 ℃×1.2×10^-3 ℃^-1=0.006 mL(1.2×10^-3 ℃^-1为甲醇体积膨胀系数)，取矩形分布，温度对体积影响所引入的标准不确定度为$\frac{0.006}{\sqrt{3}}=0.0035(\mathrm{~mL})$，相对于校准引入的不确定度(0.058 mL)小很多，可以忽略不计。

3.1.4   标准溶液稀释引入的不确定度

10 mL容量瓶体积校准按照JJG196-1990《常用玻璃量器检定规程》^[13]规定，20 ℃时10 mL容量瓶(A级)的容量允差Δ为±0.020 mL，按矩形分布，则10 mL容量瓶带来的标准不确定度为：$u_4=\$\frac{0.020}{\sqrt{3}}=0.0115(\mathrm{~mL})$，相对标准不确定度为：$u_{4 \mathrm{rel}}=\frac{0.0115}{10}=0.0012$。

用量程为100~200 μL移液枪移取100 μL标准储备液至10 mL容量瓶，根据JJG646-2006《移液器》^[14]知其最大容许误差为2 μL，取均匀分布($k=\sqrt{3}$)，则标准不确定度为：$u_5=\frac{2}{\sqrt{3}}=1.115(\mu \mathrm{~L})$，相对标准不确定度为：$u_{\text {5rel }}=\frac{1.115}{100}=0.0116 $

另外，用量程为100~200 μL移液枪移取200 μL甲酸溶液产生的相对标准不确定度为：$u_{\text {6rel }}=\frac{1.115}{200}=0.0058$。

因此，由原始标准物质、称量、定容引入的标准不确定度分量合成的标准储备液的相对标准不确定度为：

经计算得到19种喹诺酮类药物标准储备液的相对标准不确定度均为0.013 5。

3.2   样品称量引入的不确定度

称样5.00 g，精度为0.01 g的天平，其最大容许误差为±0.05 g。取均匀分布，标准不确定度为：$u(m)=\frac{0.05}{\sqrt{3}} = 0.029$ 相对标准不确定度为：

3.3   样品加标、提取和净化过程引入的不确定度

用1 mL移液管加入50 μL质量浓度为1 μg · mL^-1的标准工作液，根据JJG196-2006《常用玻璃量具检定规程》^[13]，1 mL移液管的最大允许误差为±0.008 mL，属矩形分布，由此产生的标准不确定度为：$u_{r_1}=\frac{0.008}{\sqrt{3}}=0.0046(\mathrm{~mL})$，相对标准不确定度为：$u_{r e l}\left(r_1\right)=\frac{0.0046}{50}=9.2 \times 10^{-5}$。

1 000~5 000 μL移液器的容量允许误差^[14]为±0.05 μL(k=2)，则标准不确定度为：$u\left(r_2\right)=\frac{0.05}{2}=0.025$(μL)，加入提取剂的量为5 mL，则其相对标准不确定度为：$u_{r e l}\left(r_2\right)=\frac{0.025}{5000}=0.0002$。

1 000~5 000 μL移液器在提取过程中使用4次。则样品加标、提取和净化过程体积引入的合成不确定度为：

3.4   回收率引入的不确定度

在样品中添加10 μg · kg^-1的混合标准工作液，做6个平行样品测定每种喹诺酮类药物的回收率，噁喹酸加标回收率见表 2。标准不确定度为：$u(\mathrm{rec})=\frac{0.8}{\sqrt{6}}=0.327(\%)$，相对标准不确定度为：

表  2  噁喹酸加标回收率及RSD

Table  2.  Addition standard recovery and RSD of Oxolinic acid

	平行测定次数paralleled measure times						平均回收率/% average recovery	相对标准偏差/% RSD
	1	2	3	4	5	6
回收率/% recovery	82.2	82.4	83.0	82.0	83.4	81.4	82.4	0.80

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计算得到19种喹诺酮类药物由加标回收率引入的相对标准不确定度见表 3。

表  3  加标回收引入的相对不确定度

Table  3.  Relative uncertainty by addition standard recovery

药物名称drug	相对标准不确定度relative standard uncertainty		药物名称drug	相对标准不确定度relative standard uncertainty
氟甲喹Flumequin	0.039 8		沙拉沙星Sarafloxacin	0.017 1
噁喹酸Oxolinic acid	0.004 0		司帕沙星Sparfloxacin	0.051 4
诺氟沙星Norfloxacin	0.037 1		双氟沙星Difloxacin	0.024 7
依诺沙星Enoxacin	0.058 9		西诺沙星Cinoxacin	0.013 3
环丙沙星Ciprofloxacin	0.023 0		奥比沙星Obifloxacin	0.009 9
培氟沙星Pefloxacin	0.049 3		麻保沙星Marbofloxacin	0.010 1
洛美沙星Lomefloxacin	0.061 2		萘啶酸Nalidixic	0.013 1
丹诺沙星Danofloxacin	0.047 3		氟罗沙星Fleroxcacin	0.013 7
恩诺沙星Enrofloxacin	0.041 4		吡哌酸Pipemidic	0.009 4
氧氟沙星Ofloxacin	0.049 2

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3.5   液质联用仪校准引入的不确定度

根据仪器校准证书：u=5%，取均匀分布($k=\sqrt{3}$)，

则相对标准不确定度为：

4.   标准不确定度的合成和扩展

由上述(1)~(5)式所得数据代入下面公式，得到噁喹酸的相对合成标准不确定度为：

标准不确定度为：$u(X)=u_{r e l}(X) \times 10 \mu g \cdot \mathrm{~kg}^{-1}=0.298\mu \mathrm{g} \cdot \mathrm{kg}^{-1}$

扩展标准不确定度为(k=2)：$U=k \times u_{rel}(X)=2 \times 0.0298 \times 100 \%=5.96 \%$

5.   喹诺酮类药物测量结果及不确定度报告

在95%置信区间，取包含因子k=2，噁喹酸质量分数的扩展不确定度为U=k×u(X)=0.4(μg · kg^-1)。其不确定度报告为X= 10.0±0.4 μg · kg^-1(k=2)，则19种喹诺酮类药物的不确定度报告见表 4。

表  4  19种喹诺酮类药物的不确定度报告

Table  4.  Report of uncertainty of 19 Quninolones  μg · kg^-1

药物名称drug	不确定度报告(X) report of uncertainty		药物名称drug	不确定度报告(X) report of uncertainty
氟甲喹Flumequin	10.0±1.0		沙拉沙星Sarafloxacin	10.1±0.7
噁喹酸Oxolinic acid	10.0±0.4		司帕沙星Sparfloxacin	10.1±1.2
诺氟沙星Norfloxacin	10.1±1.0		双氟沙星Difloxacin	10.0±0.8
依诺沙星Enoxacin	10.1±1.3		西诺沙星Cinoxacin	10.0±0.7
环丙沙星Ciprofloxacin	10.2±0.8		奥比沙星Obifloxacin	10.1±0.7
培氟沙星Pefloxacin	10.0±1.2		麻保沙星Marbofloxacin	10.0±0.7
洛美沙星Lomefloxacin	10.1±1.4		萘啶酸Nalidixic	10.0±0.7
丹诺沙星Danofloxacin	10.1±1.2		氟罗沙星Fleroxcacin	10.0±0.7
恩诺沙星Enrofloxacin	10.0±1.0		吡哌酸Pipemidic	10.0±0.7
氧氟沙星Ofloxacin	10.1±1.2

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6.   结果

1) 对试验结果进行不确定度评定时要考虑试验过程的每个步骤，选定可能影响试验结果可靠性和精确度的试验条件，筛选进行取舍，如样品空白、标准物质引入的不确定度，可视情况确定是否进行评定。由于试验中标准物质是自行配置，所以将其作为不确定度的一个来源。

2) 从各不确定度分量分析可知，试验过程中除仪器本身校正带来的不确定度占较大比率，来自人员操作的主要是标准溶液配置和回收率引入的不确定度。在试验过程中可尽量规范操作，减小测量和定容过程产生的不确定度，以保证测量结果有更高的准确度；另外，良好的实验室条件、实验人员熟练精确的操作、仪器设备的严格管理和精心维护、标准物质的纯度以及方法的可靠性都有助于减小试验结果的不确定度。

3) 从评定结果看，洛美沙星、依诺沙星、培氟沙星、丹诺沙星、氧氟沙星和司帕沙星的不确定度较高，原因可能是由于加标回收过程引入的不确定度较大，且加标回收对整个不确定度评定影响较大，在今后的试验中需进一步确定原因并加以改进。