广西沿海及其邻近海区拟穴青蟹群体遗传多样性的RAPD分析

孙奉玉, 宋忠魁, 赵鹏, 聂振平, 苏琼, 王芳宇

孙奉玉, 宋忠魁, 赵鹏, 聂振平, 苏琼, 王芳宇. 广西沿海及其邻近海区拟穴青蟹群体遗传多样性的RAPD分析[J]. 南方水产科学, 2012, 8(2): 30-35. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.02.005
引用本文: 孙奉玉, 宋忠魁, 赵鹏, 聂振平, 苏琼, 王芳宇. 广西沿海及其邻近海区拟穴青蟹群体遗传多样性的RAPD分析[J]. 南方水产科学, 2012, 8(2): 30-35. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.02.005
SUN Fengyu, SONG Zhongkui, ZHAO Peng, NIE Zhenping, SU Qiong, WANG Fangyu. RAPD analysis of genetic diversity of Scylla paramamosain population in Guangxi and neighboring sea areas[J]. South China Fisheries Science, 2012, 8(2): 30-35. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.02.005
Citation: SUN Fengyu, SONG Zhongkui, ZHAO Peng, NIE Zhenping, SU Qiong, WANG Fangyu. RAPD analysis of genetic diversity of Scylla paramamosain population in Guangxi and neighboring sea areas[J]. South China Fisheries Science, 2012, 8(2): 30-35. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2012.02.005

广西沿海及其邻近海区拟穴青蟹群体遗传多样性的RAPD分析

基金项目: 

广西科学基金项目 0991189

广西科学研究与技术开发计划项目 09322003

广西科学研究与技术开发计划项目 11107012-11

广西海洋生物技术重点实验室主任基金项目 GKLMBT-D0801

详细信息
    作者简介:

    孙奉玉(1982-),男,硕士研究生,从事水产生物技术研究。E-mail: sfyumail@163.com

    通讯作者:

    宋忠魁,E-mail: songsir2003@yahoo.com.cn

  • 中图分类号: S917.4

RAPD analysis of genetic diversity of Scylla paramamosain population in Guangxi and neighboring sea areas

  • 摘要:

    采用随机扩增多态DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术检测广西沿海及其邻近海区拟穴青蟹(Scylla paramamosain)6个地理群体的遗传变异和遗传结构,8条10 bp寡核苷酸随机引物扩增99个个体,分析其中的44个位点,31个位点表现出多态性,在种水平的多态位点百分率为70.45%。POPGENE分析结果显示,6个群体的多态位点百分率为29.55%~54.55%,平均为36.97%;群体的遗传多样性自高至低排列为钦州湾群体>党江群体>珍珠湾群体>闸口群体>清化群体>流沙湾群体;群体内的遗传变异大于群体间的遗传变异,群体间的遗传分化程度较大。AMOVA分析显示,群体内遗传变异占87.03%,群体间遗传变异占12.97%,群体间发生中等程度遗传分化。Mantel检测结果表明,拟穴青蟹6个群体间的遗传距离与地理距离之间的相关性不显著。聚类分析表明,群体间聚类无明显的地域性分布格局。

    Abstract:

    Random amplified polymorphic DNA (RAPD) technology was employed to investigate the genetic diversity and structure of 6 Scylla paramamosain populations in Guangxi and its neighboring sea areas. We amplified a total of 99 individuals by using 8 random primers with 10 bp in length, and analyzed 44 valid loci, among which 31 loci are disclosed as polymorphism. The percentage of polymorphic locus (PPL) at species level is 70.45%. According to POPGENE analysis, the PPL in the 6 populations ranges from 29.55% to 54.55% with an average of 36.97%. The abundance of genetic diversity is QZW>DJ>ZZW>ZK>QH>LSW. Variance within populations is higher than that among populations, and genetic differentiation among populations reaches higher level. An analysis of molecular variance (AMOVA) shows that variance within populations accounts for 87.03%, and that among populations accounts for 12.97%. However, genetic differentiation among populations only reaches medium level. Mantel test shows that no significant correlation between genetic and geographic distance is detected in the 6 S.paramamosain populations. Cluster analysis indicates that the distribution of these populations displays no apparent geographic pattern.

  • 梭子蟹Portunus pelagicus肉肥细嫩,味道鲜美,营养丰富,不仅为中国人民所喜爱,还是中国出口创汇的主要水产品之一,因此,梭子蟹一向被中国视为重要的水产资源。它不但蛋白质含量高,8种必需氨基酸齐全,而且必需脂肪酸和维生素A、D含量也极为丰富。梭子蟹在冷冻贮藏中其肌原纤维蛋白质变性而不易溶于盐类,其脂质由于富含EPA和DHA等高度不饱和脂肪酸而易于酸败,双键被氧化生成的过氧化物及其分解产物加快了蛋白质变性和氨基酸劣化,从而使蟹肉发生褐变,口感有涩味和哈味。近年来养殖梭子蟹产量逐年递增,而目前的销售和加工方式难于满足其产量快速增长的要求,因此,梭子蟹的保鲜和加工是水产加工业面临的一个重要问题。

    相关研究表明,蛋白质在冻藏过程中的变性与新鲜度、速冻速度、冻藏温度、pH值、脂肪氧化、氧化三甲胺还原产生的二甲胺和甲醛等因素密切相关[1-3]。其中速冻速度是最重要的影响因素,速冻越快和冻藏温度越低,在一定程度上降低了蛋白质变性的速度,鱼肉的肉质、口感和风味明显提高[4-5]。因此,研究蟹类在冻藏过程中生化特性的变化, 寻找合理的冻结方式对生产高质量冻品具有重要意义。

    此项研究采用液体浸渍等方法速冻梭子蟹,以肌动球蛋白盐溶性含量、巯基含量和ATPase活性为指标,并结合感观评定和失水率,考察其肌肉蛋白质生化特性的变化规律,以期找到更好的冻结方法,为梭子蟹的速冻加工提供理论与实践依据。

    1.1材料及处理

    供试材料为鲜活梭子蟹(150±20 g),购自舟山沈家门东河菜场,分4组进行冻结。第1组用-50±2℃液氮喷洒方式速冻;第2组用-50±2℃液体(自制)浸渍方式速冻;第3组用-35±2℃空气隧道方式冻结;第4组用-20±2℃冰柜直接冻结。冻结过程用温度记录仪(浙江大学)记录材料中心的温度变化,比较各冻结方式的冻结速度。冻结之后,用塑料袋包扎,贮藏于-20±2℃冰柜。

    盐溶性蛋白的提取参考OKADA等[6]方法,含量的测定采用双缩脲法。ATPase活性的测定参考HATANO方法[7]。巯基含量的测定参考SUVANICH等[1]方法。分别测定冻藏样品(贮藏90 d)取出时和28℃恒温箱中解冻并保持2 h后的固形物重量,以其失水量与试样原重之比作为失水率。感观评定方法为冰冻的以色泽、气味、组织形态和肌肉弹性为检验项目,沸水煮5 min后以色泽、气味和汤汁混浊度为检验项目,各项根据描述分为好(50~40分)、较好(40~30分)、一般(30~20分)、较差(20~10分)和差(10~0分)5个级别,评定人员由10人组成,结果采用模糊数学法统计。

    冻结速度快慢以梭子蟹在过冷点之后温度下降斜率来衡量。从图 1可看出,-20℃冰柜直接冻结方式,梭子蟹在-2.9℃就保留了4 200 s;-50℃液体浸渍下梭子蟹温度下降斜率最大,冻结到-18℃只需1 750 s;-50℃液氮喷洒则需2 050 s,-35℃空气隧道式需4 900 s,这表明液体浸渍速冻最快,其次为液氮喷洒,再次为空气隧道式,最慢为冰柜直接冻结。

    图  1  不同速冻方式的冻结梭子蟹速度比较
    a.-20℃冰柜直接冻结;b.-50℃液体浸渍;c.-50℃液氮喷洒;d.-35℃空气隧道式
    Fig. 1  Comparison of the freezing speeds under different quick-freezing ways for P.pelagicus
    a.freezing under -20℃; b.soaking in liquid of-50℃; c.spraying liquid nitrogen of-50℃; d.air tunnel way freezing at-35℃

    梭子蟹经过不同速冻处理后冻藏,其肌动球蛋白盐溶性的变化见图 2。在-20℃冰柜直接冻结梭子蟹在冻藏过程中肌动球蛋白的溶出量一直呈快速下降趋势,尤其是在前45 d的冻藏期内,其溶出量迅速从28.01 mg · g-1下降到5.66 mg · g-1。在-50℃液氮喷洒处理的梭子蟹肌动球蛋白溶出量在前30 d的冻藏期内变化不明显,其溶出量仅下降1.71 mg · g-1,在冻藏30 d后,尤其75 d后,下降速率加快,试验结束(第90天)时,肌动球蛋白的溶出量为8.76 mg · g-1,仍然远高于在-20℃冰柜直接冻结和-35℃空气隧道式处理的。-50℃液体浸渍处理的,前60 d内梭子蟹肌动球蛋白溶出量的变化相当缓慢,60 d后肌动球蛋白溶出量的下降速率开始加快。到第90天时,肌动球蛋白的溶出量仍高达21.4 mg · g-1,仅比鲜活梭子蟹肉的值低6.61 mg · g-1

    图  2  不同速冻处理的梭子蟹在冻藏期间肌动球蛋白溶出量的变化
    Fig. 2  Changes of contents of dissolved actomyosin of P.pelagicus under different quick-freezingways during storage

    不同速冻处理的梭子蟹在冻藏过程中ATPase活性的变化见图 3。在-20℃冰柜直接冻结下冻藏的梭子蟹肌动球蛋白的Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和Mg2+-EGTA-ATPase活性均随冻藏时间的延长而下降,且前三者的变化趋势基本相似,呈前期快后期慢的特点,第15天时,Mg2+-EGTA-ATPase活性已基本消失,第30天时,其它3种酶活性已基本丧失。-50℃液氮喷洒处理的Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性呈一直下降的趋势,在冻藏70 d后,

    图  3  不同速冻处理的梭子蟹在冻藏过程中ATPase活性的变化
    a.-20℃冰柜直接冻结;b.-50℃液氮喷洒;c.-50℃液体浸渍;d.-35℃空气隧道式
    Fig. 3  Changes of ATPase activities under different quick-freezing ways for P.pelagicus during storage
    a.froze under -20℃; b.spraying of liquid nitrogen at -50℃; c.soaking of liquid at -50℃; d.air tunnel way freezing at -35℃

    其活性均已降到接近0,Mg2+-EGTA-ATPase活性则呈缓慢下降趋势,第60天时,其活性已接近0。-50℃液体浸渍处理的Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性大体呈匀速下降趋势,试验结束(90 d)时,其活性分别为0.041,0.086和0.093 μmol · (mg · min)-1,Mg2+-EGTA-ATPase活性在前15 d下降较快,随后一直缓慢下降,直至第75天降为0。-35℃空气隧道式处理的Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性前30 d的下降速率较快,Ca2+-ATPase活性到第60天,Mg2+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性到第75天时降为0,Mg2+-EGTA-ATPase活性在前30 d冻藏期内下降速率较慢,随后迅速下降,到第45天时活性基本丧失。

    不同速冻处理的梭子蟹在冻藏过程中巯基含量的变化见图 4。第15天开始,不速冻处理的梭子蟹巯基含量下降速度出现了显著差异。在-20℃冰柜直接冻结下冻藏时,梭子蟹巯基含量在15~30 d内急剧下降,由0.970 μmol · g-1下降到0.104μmol· g-1,到第45天时,巯基含量已接近0。-35℃空气隧道式处理的梭子蟹巯基含量在30~45 d期间快速下降,巯基含量由0.784 μmol · g-1下降到0.257 μmol · g-1,第70天,其含量已降为0。-50℃液氮喷洒处理的梭子蟹巯基含量下降速度明显放慢,尤其是在冻藏60 d以后,含量几乎不变,到第90天时,含量仍达0.764 μmol · g-1。-50℃液体浸渍处理的梭子蟹巯基含量下降极为缓慢,到90 d的冻藏期结束时,巯基含量依然高达1.030 μmol · g-1,仅比初始含量下降0.234 μmol · g-1

    图  4  不同速冻处理的梭子蟹在冻藏过程中巯基含量的变化
    Fig. 4  Change of -SH content from different quick-froze P.pelagicus during storage

    不同速冻处理的梭子蟹感观评定和失水率见表 1表 2。从表中可以看到,冻藏2个月后,-50℃液氮喷洒和-50℃液体浸渍处理失水率低于-35℃空气隧道式和-20℃冰柜冻结,说明低温快速冻结梭子蟹肉持水量高于慢冻结。在感观评定方面,-50℃液氮喷洒和-50℃液体浸渍处理的梭子蟹肉在色泽和肌肉弹性上均优于-35℃空气隧道式和-20℃冰柜冻结的,水煮后香味较为浓郁清新且口感较好。

    表  1  不同速冻处理的梭子蟹冰冻感观评定和失水率
    Table  1  Sensory evaluation and moisture-loss ratios in different quick-froze P.pelagicus
      色泽color 气味flavor 组织形态microstructure shape 肌肉弹性textures of muscle 失水率/% moisture-loss ratios
    -50℃液氮喷洒spraying of liquid nitrogen at -50℃ 45.5 46.7 46.1 46.2 10.42
    -50℃液体浸渍soaking of liquid at -50℃ 45.4 46.2 46.9 46.1 11.53
    -35℃空气隧道式air tunnel way at -35℃ 41.3 38.9 40.2 39.4 13.81
    -20℃冰柜冻结frozen under -20℃ 32.3 30.6 16.8 28.8 14.52
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    表  2  水煮后的梭子蟹肉感官评定
    Table  2  Sensory evaluation of boiled P.pelagicus meat
      色泽color 气味flavor 汤汁混浊度turbid of soup juice
    -50℃液氮喷洒spraying of liquid nitrogen at -50℃ 46.3 46.2 46.9
    -50℃液体浸渍soaking of liquid at -50℃ 46.5 45.9 46.7
    -35℃空气隧道式air tunnel way at -35℃ 38.7 39.1 29.6
    -20℃冰柜冻结frozen under -20℃ 26.8 16.5 20.1
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    冰晶体的大小与冷冻速率有关。在冷冻结冰缓慢进行的情况下,形成大型针状结构的晶体,缓慢冻结期间形成的少量晶核和大型冰晶,而快速冻结则大量形成晶核,分布广泛,冰晶体增长分配在多数晶核上进行,因而晶块小而分布广。-20℃冰柜冻结和-35℃空气隧道式缓慢冻结,解冻后的梭子蟹肉则变软流汁,风味减退,由于缓冻使冰晶体不断扩大,破坏细胞组织,使梭子蟹肉解冻后细胞失去恢复能力。而-50℃液氮喷洒和-50℃液体浸渍快速冻结则对梭子蟹肉破坏小,品质保持较好。

    梭子蟹在不同速冻方式下冻藏时,其巯基含量均表示出不同程度的下降趋势。巯基含量下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纤维蛋白空间结构发生改变,使埋藏在分子内部的巯基暴露出来,进而被氧化成二硫键,导致巯基含量的减少[8]。速冻方式对梭子蟹巯基含量的变化影响极其显著(P < 0.01)。冻藏至第30天时,-20℃冰柜直接冻结下冻藏的梭子蟹巯基含量已降为0.104 μmol · g-1,仅为初始含量的8.2%,而-50℃液体浸渍下冻藏的梭子蟹巯基含量仍高达1.048 μmol · g-1,为初始含量的82.9%。冻藏至第60天时,-35℃空气隧道式下冻藏的梭子蟹巯基含量降至0.111 μmol · g-1,仅为初始含量的8.8%,而-50℃液体浸渍下冻藏的梭子蟹巯基含量为1.039 μmol · g-1,相当于初始含量的82.2%。到第90天试验结束时,-50℃液氮喷洒冻藏下的梭子蟹巯基含量也降至0.764 μmol · g-1,为初始含量的60.4%,而-50℃液体浸渍下冻藏的梭子蟹巯基含量还保持在1.030 μmol · g-1的较高水平。

    SOMPONGSE等[8]认为巯基氧化形成的二硫键会导致肌球蛋白重链聚合,从而降低其盐溶性。比较图 2图 4可以看出,梭子蟹肌动球蛋白的溶出量在不同速冻方式下冻藏时的下降趋势与其巯基含量的变化存在相关性。因此,可以认为梭子蟹在冻藏过程中肌动球蛋白溶出量的下降是由于巯基氧化形成二硫键所致。

    图 2中可以看到,在-50℃液氮喷洒下冻藏的梭子蟹肌动球蛋白溶出量从第15天到第30天,在-50℃液体浸渍下冻藏的梭子蟹肌动球蛋白溶出量从第15天到第45天之间出现了上升趋势。实际上FUKUDA等[9]在研究其它蟹肉在冻藏过程中的变性情况时,也发现了盐溶性在一段时间内上升的现象。JIANG等[10]也发现类似情况,此现象可能是提取方法不完善导致的,由于在较低的温度下冻藏时,冻藏前期肌动球蛋白变性较轻微,因而提取方法对试验值的影响较大,导致-50℃液氮喷洒和-50℃液体浸渍下冻藏过程中的肌动球蛋白溶出量出现了上升趋势。基于此,不宜单独将肌动球蛋白的盐溶性作为评价其变性的指标。

    经不同速冻处理的梭子蟹肌原纤维蛋白质Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和Mg2+-EGTA-ATPase活性,均随冻藏时间延长而下降。引起冻藏过程中蟹肉肌原纤维蛋白质ATPase活性下降的原因众说纷纭。LIAN等[11]认为是由于冰晶的机械作用引起的;许多学者[12-13]也认为,由于巯基氧化形成二硫键导致分子聚合是ATPase活性下降的主要原因。根据冻藏梭子蟹巯基含量变化,笔者认为,肌原纤维蛋白质ATPase活性下降是由巯基氧化引起。但速冻速度对梭子蟹肌原纤维蛋白质ATPase活性下降速率具有显著的影响(P < 0.01)。速冻速度越快,梭子蟹肌原纤维蛋白质ATPase活性下降速率越慢。另外,即使是-50℃液体浸渍速冻,Mg2+-EGTA-ATPase活性也在70 d内消失,表明梭子蟹肌原球蛋白-肌钙蛋白复合体非常容易变性。

    速冻保藏是国际公认的食品最佳保藏方法之一。通常认为,冻结速度越快,食品的质量越好,这是因为冻结速度快,食品材料内部形成的冰晶小而均匀,食品的组织结构被破坏的程度低,汁液流失少。从4种不同速冻方式中可以看出,-50℃液体浸渍处理梭子蟹,保藏期长,蛋白质等流失量少,水煮后香味较为浓郁清新,在色泽和肌肉弹性上均优于其它3种速冻方式;-50℃液氮喷洒对蟹肉的品质保存相对完好;-20℃冰柜直接冻结到第30天时,蟹肉已经基本变质;4种速冻方式中以-50℃液体浸渍为最佳的保鲜方式。

    从此试验结果可以看出,虽然低温速冻处理没能阻止梭子蟹肉冻藏期间盐溶性蛋白含量、巯基含量、ATPase活性等指标的下降趋势,但相比于直接冻结,低温快速冻结处理在一定程度上降低了蛋白质变性的速度,蟹肉的肉质、口感和风味明显提高。

  • 图  1   引物S24对拟穴青蟹部分个体的扩增结果

    M.分子量标准(100 bp ladder plus);1~19.闸口群体的19个个体

    Figure  1.   RAPD amplification in some individuals of S.paramamosain using primer S24

    M.marker (100 bp ladder plus); 1~19.19 individuals representing ZK population

    图  2   拟穴青蟹6个群体基于Nei′s无偏遗传距离的UPGMA系统树图

    Figure  2.   UPGMA dendrogram of 6 S.paramamosain populations based on Nei′s unbiased genetic distance

    表  1   RAPD引物序列及退火温度

    Table  1   Primer sequences for RAPD and annealing temperature

    引物编号
    primer No.
    引物序列(5→3′)
    primer sequence
    退火温度/℃
    annealing temperature
    S15 GGAGGGTGTT 36.0
    S24 AATCGGGCTG 36.0
    S31 CAATCGCCGT 36.0
    S58 GAGAGCCAAC 36.0
    S68 TGGACCGGTG 36.0
    S83 GAGCCCTCCA 36.0
    S103 AGACGTCCAC 36.0
    S398 ACCACCCACC 36.0
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    表  2   拟穴青蟹群体的遗传多样性

    Table  2   Genetic diversity parameters of S.paramamosain populations

    项目
    item
    样本数/个
    number of specimen(NS)
    多态位点数/个
    number of polymorphic locus (NPL)
    多态位点百分率/%
    percentage of polymorphic locus (PPL)
    观察等位基因数
    observed number of alleles (Na)
    有效等位基因数
    effective numeber of alleles (Ne)
    Nei′s基因多样性
    gene diversity(h)
    Shannon′s信息指数
    Shannon′s information index(I)
    党江DJ 19 17 38.64 1.386 4±0.492 5 1.276 1±0.382 7 0.155 8±0.208 1 0.227 1±0.298 6
    闸口ZK 19 16 36.36 1.363 6±0.486 6 1.258 2±0.363 1 0.148 5±0.202 5 0.216 9±0.293 4
    珍珠湾ZZW 14 17 38.64 1.386 4±0.492 5 1.274 1±0.387 5 0.154 0±0.207 6 0.224 8±0.297 0
    钦州湾QZW 13 24 54.55 1.545 5±0.503 7 1.375 8±0.397 5 0.213 2±0.214 2 0.312 1±0.305 5
    清化QH 19 15 34.09 1.340 9±0.479 5 1.251 3±0.391 6 0.138 1±0.206 6 0.200 1±0.293 5
    流沙湾LSW 15 13 29.55 1.295 5±0.461 5 1.177 8±0.308 0 0.106 6±0.175 3 0.159 9±0.257 7
    平均average 16.5 17 36.97 1.369 7 1.268 8 0.152 7 0.223 5
    物种水平at species level 99 31 70.45 1.704 5±0.461 5 1.296 3±0.335 9 0.184 3±0.177 7 0.290 9±0.250 2
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    表  3   拟穴青蟹6个群体基因多样性的Nei′s分析

    Table  3   Nei′s analysis of gene diversity in 6 S.paramamosain populations

    项目
    item
    总基因多样性
    total gene diversity (Ht)
    群体内基因多样性
    gene diversity within population (Hs)
    基因分化系数
    coefficient of gene differentiation(Gst)
    基因流
    gene flow(Nm)
    平均 average 0.187 2 0.152 7 0.184 3 2.212 9
    标准差 standard deviation 0.031 6 0.023 9
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    表  4   拟穴青蟹6个群体的AMOVA分析

    Table  4   AMOVA analysis of 6 S.paramamosain populations

    谱系结构
    source of variation
    自由度
    degree of freedom (df)
    方差总和
    sum of squared deviation (SSD)
    平均方差
    mean of squared deviation (MSD)
    变异组分
    variance component
    变异百分率/%
    percentage of total variance
    群体间 among populations 5 43.407 8.681 0.375 12.97
    群体内 within populations 93 234.290 2.519 2.519 87.03
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    表  5   拟穴青蟹6个群体间的地理距离(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)

    Table  5   Geographic (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among 6 S.paramamosain populations km

    项目 item 党江 DJ 闸口 ZK 珍珠湾 ZZW 钦州湾 QZW 清化 QH 流沙湾 LSW
    党江 DJ 53.53 88.63 53.28 383.77 165.20
    闸口 ZK 0.023 4 140.79 101.60 434.87 156.80
    珍珠湾 ZZW 0.037 3 0.065 1 38.83 306.54 220.77
    钦州湾 QZW 0.060 2 0.093 8 0.023 6 344.13 204.32
    清化 QH 0.038 3 0.042 1 0.040 0 0.062 1 422.49
    流沙湾 LSW 0.023 7 0.033 1 0.030 7 0.068 8 0.021 2
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出版历程
  • 收稿日期:  2011-12-08
  • 修回日期:  2012-01-17
  • 刊出日期:  2012-04-04

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