Study on fermentation conditions for oceanic red yeast strain RH1
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摘要:
该研究比较了不同碳源、氮源、无机盐对海洋红酵母菌(Rhodotorula sp.)RH1菌株发酵产量的影响,通过葡萄糖、蛋白胨、酵母膏和硫酸镁(MgSO4)4因素3水平的正交试验,确定了RH1菌株的最优培养基为蛋白胨10 g · L-1,酵母膏15 g · L-1,葡萄糖20 g · L-1,MgSO4 0.25 g · L-1,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.25 g · L-1,氯化钠(NaCl)10 g · L-1。结果显示,该菌株最佳摇瓶发酵条件为接种量10%,初始pH 5.0,摇瓶装液量80 mL/500 mL三角瓶,培养温度28 ℃,经48 h培养,菌量可达10.46×108 cfu · mL-1,比优化条件前提高23.9%。还进行了RH1菌株25 L发酵罐扩大培养试验,在接种量为8%、初始pH 5.0、搅拌速率350~400 r · min-1、通气量9 L ·min-1、温度28 ℃的条件下,经28 h的培养,菌量可达33.6×108 cfu · mL-1。预计通过连续补料的方式进行培养,有望进一步提高菌量。
Abstract:We compared the effects of different carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts on fermentation yield of oceanic red yeast (Rhodotorula sp.)RH1. By 4 factors and 3 levels orthogonal test, the optimum fermentation conditions for RH1 were determined: peptone 10 g · L-1, yeast extract 15 g · L-1, glucose 20 g · L-1, MgSO4 0.25 g · L-1, KH2PO4 0.25 g · L-1, NaCl 10 g · L-1, inoculation amount 10%, initial pH 5.0, temperature 28 ℃, 80 mL medium in 500 mL triangle bottle, and fermentation time 48 h. Under above conditions, the cell biomass of RH1 can reach 10.46×108 cfu · mL-1, which increases by 23.9% as compared with the fermentation before optimization. An experiment of expanded culture is also conducted in a 25 L fermentation tank. The cell biomass of RH1 increased to 33.6×108 cfu · mL-1 in 28 h under the conditions of inoculation amount 8%, initial pH 5.0, revolution speed 350~400 r · min-1, air ventilation volume 9 L · min-1 and temperature 28 ℃. It is expected to further increase the biomass of strain RH1 by continuous filling of the materials.
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Keywords:
- Rhodotorula sp. /
- culture conditions /
- optimization
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近年来有关渔业资源增殖放流的研究报道很多,许多学者对近年来中国各地的增殖放流情况开展了调查与总结[1-2],如对放流前期进行环境容量调查和放流物种研究,探索放流活动中的各项技术问题,对放流后的效果进行评估等[3-6]。由于人工增殖放流是对自然界的人为干预,所以进行干预时需要谨慎,干预不当轻则造成投入产出不成比例、入不敷出,重则有可能给生态环境埋下隐患[7]。因此,通过建立模型进行决策分析和效果预测尤为重要。
文章选取增殖放流活动中的典型——山东省中国对虾(Penaeus chinensis)增殖放流作为研究对象,基于系统动力学原理和方法,提出了一个简明的,耦合了渔业资源生物量(B)、水域饵料生物资源(Z)和社会渔民资产(资金A)的渔业资源增殖放流系统模型。应用系统动力学软件Vensim对该过程进行模拟,通过调整放流量和捕捞努力量比较模拟结果,从而优化增殖放流和回捕方案。文中介绍的方法和研究结论可以给渔业管理者制订决策时提供重要参考。
1. 渔业系统动力学的提出
渔业是一个汇聚了生物、社会、生态、经济等各个领域交互作用的动态系统。社会通过资金、捕捞努力量投入等作用于渔业,渔业的盛衰又直接对海域生态系统造成影响。生态容量等会反制约于渔业发展,渔业的效益又为社会提供资金,其产业发展将为社会创造更多的工作机会。如此构成了整个渔业系统与生态、社会系统的因果循环(图 1)。
渔业系统中的决策过程非常复杂,因其涉及生物、社会、生态和经济等各个领域的因素。各个因素之间构成因果关系,相互影响会形成大量的反馈回路,其中一个因素发生改变会造成回路中其他因素的连锁反应。再者,社会与生态系统达到平衡需要经过一段延迟时间,例如在过度捕捞现象变得很明显之前,渔业生产能力过剩的现状还会继续[8]。然而,在决策制定过程中却大都没有考虑这些。
随着数学与计算机模拟在渔业管理研究中不可或缺地位的提升,系统动力学的引入与应用为解决这些问题带来了新的思路,它将动态系统进行整体统筹考虑,可以处理高阶次、非线性、多重反馈复杂时变系统的问题。系统动力学的本质是含有时滞的一阶微分方程组,其优点在于可以通过直观明晰的模型结构定性定量地描述分析复杂决策系统,进行效果预测并提供解决方法[9-10]。
随着系统动力学(system dynamic,SD)的发展,将其应用于渔业问题研究的报道也陆续出现。国际上在该方面的研究较为活跃,DUDLEY和SODERQUIST[11]于1999年在美国第129届渔业年会上介绍了利用系统动力学模拟分析并改进渔业资源Schaefer剩余产量模型($\frac{d B}{d t}=r B-\frac{r B^2}{\mathrm{k}}-\mathrm{q} E B $)的方法,后又于2003年对系统动力学在渔业管理复杂性中的应用作了更进一步的阐述[12]。可以看出,与数学模型相比较,利用SD来说明渔业模型将更具直观性、更方便对模型的修改。当系统中各层关系比较复杂时,使用SD方法来解决问题便体现出其简易性。另外,DEW[13]建立了配额管理制度下的系统动力学渔业理论模型;BALD等[14]对西班牙北部鹅颈藤壶(Pollicipes pollicipes)的管理模式建立了SD模型进行分析;WAKELAND等[15]对美国大西洋沿岸的黃尾岩礁魚(Sebastes flavidue)资源开发进行了SD仿真模拟。
国内利用SD研究渔业的报道相对较少,陈龙等[16]曾将其应用于模拟大黄鱼(Pseudosciaena crocea)资源兴衰以寻求渔船船队合理增长规模,该研究取得了较好的模拟效果。渔业资源增殖放流作为当前各地积极开展的一项复杂的系统工程,对其建立系统动力模型进行决策和效果分析将具有重要的现实意义。
2. 动态模拟模型
2.1 流程图
增殖放流是图 1的渔业系统框架中的重要一环。根据系统动力学的建模理论,在各因素因果关系中识别出描述该系统特征的3个状态变量:渔业资源生物量B、水域饵料生物资源Z及资金A,13个流率变量以及若干辅助变量,并分别设置放流量与捕捞努力量为决策变量。此研究中所应用的系统动力学软件是美国Ventana公司开发的Vensim_PLE版本。按照系统动力学流程图的画法规则,逐渐增添模型细节,得出整个系统的流程图(图 2)。
2.2 系统分析及主要方程、参数的确立
2.2.1 渔业部分
渔业资源生物量与放流死亡、放流量、渔获量、自然死亡和自然繁殖成活量有关。其中放流死亡、自然死亡和渔获量导致渔业资源生物量减少,而自然繁殖及放流量则构成了渔业资源量的补充量。模型中设置渔业资源生物量为状态变量,放流死亡、放流量、渔获量、自然死亡和自然繁殖成活量为相应的流率变量。由于过度捕捞等原因,至20世纪80年代初山东省沿海中国对虾资源量几乎耗竭,基本已经不能形成渔汛[17]。因此,在山东省中国对虾增殖放流的SD模拟中,笔者将1984年开展对虾放流时的中国对虾资源初始量假设为45×104尾(约2×105 kg)。对虾寿命平均为1龄,自然繁殖成活率设定0.10~0.15之间。对虾在增殖放流过程中具有多种死亡特征,放流操作时受到人为死亡影响、机械死亡影响,苗种放流入海后24 h内因环境突变带来突然死亡,在直到开捕期间还将受到违规捕捞死亡、敌害病害死亡、纳潮死亡、环境影响死亡等各方面的冲击[18]。邓景耀和叶昌臣[19]使用1985年~1992年海洋岛对虾增殖渔业的产量统计资料估算了对虾放流过程中所受的机械损伤死亡率为0.062~0.182,突然死亡率为0.083~0.355,纳潮死亡率为0.07,违规捕捞损害死亡率为0.10。在此基础上鉴于死亡原因的变动性和不确定性并参鉴以往的部分研究资料[20-23],在此模型中假设机械死亡率为0.15,人为死亡率为0.37,环境突变死亡率为0.30,违规捕捞及纳潮死亡率0.20,设敌害病害死亡率为0.11~0.12,另外再设一个随机死亡率(0~0.01)。
2.2.2 生态部分
模型的生态部分将设置水域饵料生物资源Z为状态变量,饵料年增加、被消耗饵料与饵料年死亡量为流率变量。饵料年增加表示流入,被消耗饵料与饵料年死亡量表示流出。中国对虾的饵料基本以底栖生物为主。据相关资料显示山东半岛近岸水域春秋两季平均底栖生物量为0.033 2 kg·m-2,其中可供成虾作为饵料的甲壳类占6%,多毛类占15%[24]。山东省沿海海域渔场总面积为17×1010 m2,故海域总底栖生物量约为5.644×109 kg。鉴于中国对虾的摄食量较大,假定可供其作为饵料的生物量是总底栖生物量的0.1,将此设置为对虾饵料资源Z的初始值,并将此值看作该水域饵料的生态容量值。根据美国生态学家林德曼的“1/10”定律,自然界各级营养以0.10的比例转化,将对虾环境容量k设置为对虾饵料生物量的1/10,并随之波动。据山东海洋捕捞生产管理站《山东南部沿海主要海湾中国对虾放流增殖适宜数量与放流点合理布局研究》①报告,从6月中、下旬至8月下旬开捕时放流增殖对虾平均体质量从不到0.001 kg长到0.03~0.05 kg,这期间每尾对虾平均约需饵料(鱼均饵料)0.150 kg。饵料的自然生长率与自然死亡率均取值为0.2。
① 山东海洋捕捞生产管理站, 山东省海洋水产研究所. 山东南部沿海主要海湾中国对虾放流增殖适宜数量与放流点合理布局研究[R].烟台: 1998.
2.2.3 社会部分
模型该部分中,设置资金A为状态变量,此处的A假定设置为应用于渔业的基金,亦可看作社会渔民的资产总和,A的涨落幅度将表示渔业的盈亏情况。流率变量为回捕收入、消费、捕捞成本、放流投入资金、纳税,其中回捕收入表示流入,它会带来资金A的积累和增加,其余4个变量表示流出。
这里将A初始值任意设置为1×108元。渔业税率较低(0.05~0.10),在此设置为0.08。另外,将平均每年的消费率设置为总资金的0.20。根据目前的市场价格,对虾放流时的种苗价格为每1×104尾158元,成虾一般价位在100元·kg-1,放流成本约为每1×104尾80元。此外,1 kg对虾大约有20余尾左右,平均每尾0.03~0.05 kg,这里假定每尾为0.04 kg。据统计山东省2006年用于中国对虾增殖捕捞的船只为6 041艘。由于每年投入的捕捞强度相当大,基本满足脉冲式捕捞。为方便分析,这里的捕捞努力量不赋予其具体定义,可以是船数×天数×马力(吨位),或是其他,在此仅作为一个单位以作示意。文章中设置捕捞效率q为0.001,捕捞努力量为f=900,视为极大的捕捞量,捕捞渔获率达0.9。另外,单位捕捞努力量变动成本设为1×104元。
2.2.4 主要方程
1) 渔业资源生物量B(t)=45×105(t-dt)+(放流量+自然繁殖成活量-自然死亡量-渔获量C-放流死亡)×dt
2) 水域饵料生物资源Z(t)=5 644×106(t-dt)+(饵料年增加-饵料年死亡-被消耗饵料)×dt
3) 资金A(t)=1×108(t-dt)+(回捕收入-消费-捕捞成本-放流投入资金-纳税)×dt
4) 渔获量C=B×捕捞渔获率
5) 放流死亡=放流量×(人为损坏死亡率+机械损伤死亡率+环境突变死亡率+随机死亡率+敌害病害死亡率)
6) 自然繁殖成活量=B×自然繁殖成活率
7) 饵料年死亡=Z×饵料死亡率×Z/K0
8) 饵料年增加=Z×饵料生长率
9) 被消耗饵料=B×鱼均耗食量
10) 回捕收入=C×成鱼价格
11) 放流投入资金=放流量×(种苗价格+单位放流成本)
12) 捕捞成本=单位捕捞努力量变动成本×捕捞努力量E
13) 捕捞渔获率=捕捞效率q×E
3. 模拟结果分析
3.1 实际放流情况下的SD模拟结果
山东省中国对虾放流时间在每年的6月15日至20日,当年8月20日为流刺网开捕时间,9月1日以后允许拖网进行捕捞。模型中以每年的实际放流量数据作为输入参数,始于1984年,终于2006年。文中的实际放流量以及回捕量等为山东省海洋捕捞生产管理站历年统计数据。
图 3展现了B、Z和A随着历年来对虾放流量变化带来的模拟波动情况。1988年至1994年间放流量较大,A与B亦随之出现高峰,Z由于大量被消耗而出现低谷;1995年后放流量保持在低水平上,Z回升,A与B下落趋于平衡。应用此模型进行A、Z和B 3个状态变量的模拟,所得结果基本符合理论变化趋势。
图 4为山东省历年中国对虾放流回捕量的历史数据与SD仿真模拟结果的比较(R=0.38),经t检验显示,两组数据间差异不显著(P=0.41)。模拟值较历史值更为平滑缓和,原因之一是模型中的参数设置对结果的影响敏感度不够。另外很重要的一点是实际放流活动受外界不确定因素影响更大,如1993年爆发的虾病带来了高病害死亡率,而海况和气象(台风、降雨量)等变化亦会造成放流鱼种回捕量的升降。综上所述,只要对相关的模型参数进行适当的选择,利用SD模型进行增殖渔业的仿真模拟是可行的。并且如果在此基础上改变决策变量,从中进行选优,仿真模拟的结果可为实际流决策提供有益的参考依据。
3.2 决策分析
在上述模型基础上,选择捕捞努力量以及放流量作为2个决策变量进行模拟分析。
3.2.1 改变决策变量——放流量
在上述模型基础上,保持捕捞努力量为f=900不变,将放流量视作决策变量,改变其大小,运行得到B、Z与A的相应变化趋势。假设从1984年开始每年向海域投放固定的对虾苗种数量,设置放流量为1×108尾、5×108尾、10×108尾、15×108尾、25×108尾和35×108尾6种不同的情况。在捕捞努力量为定值时,每年放流恒定的种苗,资源量将随着年份不断上升并逐渐达到平衡(图 5-a)。在放流量合理的情况下,每年放流的种苗越多,资源量将越大。放流量为35×108尾时,资源量在经历了15年左右的高水平后于2001年出现下滑并中断计算,这一现象与模型中生态容量的设置有关,如此设置的意义在于表示放流量过大将导致生态失衡,此时的放流量可视作在一定时间范围内放流的极限值。每年保持放流一定数量的种苗,水域饵料资源将不断减少并逐渐达到平衡(图 5-b)。以每年25×108尾以上的放流量进行放流时,饵料生物资源量呈较大下降趋势。为避免对生态系统造成较大影响,这样大规模的放流还需要慎重考虑。图 5-c中的资金变化表现与图 5-a中渔业资源生物量的变化有相近之处。从这3幅分图中比较得出,放流量小时对生态的影响虽小,但放流效益不高,资源量也几乎未见增长。放流过大则易造成生态破坏。综合而言,放流量10×108尾较为合理。
3.2.2 改变决策变量——捕捞努力量
取较为合理的放流量10×108尾为定值,将捕捞努力量视为决策变量,改变其大小。为方便分析采用捕捞努力量(CPUE)的单位数来表示捕捞努力量的大小。文章中设置单位捕捞努力量f的单位数为100、300、500、700和900等5种情况,运行得到B、A、Z以及增殖对象回捕量的相应变化趋势。图 6的4幅分图中,分别用5种不同线型的曲线来分别表示从大到小的5种不同捕捞努力量下各个变量的变化情况,4幅图中不同捕捞努力量的线型保持统一。随着捕捞努力量的增加,渔业资源量的增幅越来越少(图 6-a)。表明即使实施每年放流的策略,但在高强度的捕捞努力量下,资源量并不会实现太大的增殖。而在捕捞努力量取较小数值时,其变化对资源量的变动颇为敏感,该现象说明,如果放流的目的在于增加渔业资源量,那么捕捞努力量需从根本上进行大幅的下调,下调力度不足则不会对资源增殖起到大的帮助。当捕捞努力量取f=100时,在前4年有一个资金下降又回升的过程,它表示在开始放流活动的前几年这一前期阶段,因开始的成本投入较大,而捕捞努力量较少使捕捞收入也较少,尚不足以抵消其成本支出,在真实的渔业中若遇这种情况必将严重打击渔民的积极性(图 6-b)。倘若捕捞努力量大,则将缩短这段资金周转的时间,甚至不存在资金回落的过程,如f=900。当捕捞努力量取f=900、f=700、f=500这3种情况时,资金A的升幅表明效益良好,且效益差距不会太大。这表明,在捕捞努力量已经较大的基础上再增加捕捞力度,对效益的正面影响不会太大。故捕捞努力量不可过小,但太大会造成成本浪费。当取f=100时,水域饵料生物下降很大,这一现象表明,放流过程中如果放流量较大而回捕力度较小将会使水域生物损耗过多导致生态不平衡(图 6-c)。这与图 5-b阐述的现象有类似之处。捕捞努力量越大,回捕量越大,但是随着捕捞努力量的增加,回捕量的增加幅度越来越小,该变化与图 6-a中的渔业资源量的变化恰呈相反趋势(图 6-d)。这说明在捕捞努力量本已处于较大数值时,再增加努力量并不会带来太多的回捕量(图 6-d中f=900和f=700之间的变化);减少部分捕捞努力量可以节省部分捕捞成本,并且不会造成太大的回捕损失(图 6-d中f=700和f=500之间的变化)。综合上述情况可得出,f=500时的捕捞努力量较为合理,即相当于捕捞效率在0.5左右,可以维持一定的资源量,又可获得较好的回捕量和效益。
4. 小结
该文演示了系统动力学理论和方法在渔业资源增殖放流中的应用。系统动力学方法直观性强,渔业资源增殖放流过程在宏观上将资源、生态、社会三方面整合在一起,形成一个大的系统,融会贯通,且操作简便,使用者即便没有相当的数学基础,也可以根据不同的使用目的改变模型,根据实际情况相应改变参数设置。该方法亦可用于对渔业资源生物量、产量、社会效益、生态效应的评估和预报。该文是将系统动力学分析应用于渔业资源增殖领域的一项探索性研究,模型中多处采用简化处理,部分参数采用估计值,故文章中的定量讨论还有待更进一步研究与考量。实际系统中的各项相关因素以及制约条件远远比文章中建立的模型要复杂得多,其中参数的变动会在比较大程度上影响结果,所以开展各项基础调查研究以及如何完善模型以提高其仿真及预测的科学性和准确性是今后工作的重点和难点。
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表 1 培养基的碳源及添加质量浓度
Table 1 Carbon source and its concentration in medium
g · L-1 碳源
carbon source葡萄糖
glucose蔗糖
sucrose糖蜜
molasses葡萄糖+蔗糖
glucose+ sucrose葡萄糖+糖蜜
glucose+ molasses蔗糖+糖蜜
sucrose+ molasses添加质量浓度
concentration20 20 20 10+10 10+10 10+10 表 2 培养基的氮源及添加质量浓度
Table 2 Nitrogen source and its concentration in medium
g · L-1 氮源
nitrogen source蛋白胨
peptone酵母膏
yeast extract硫酸铵
(NH4)2SO4氯化铵
NH4Cl豆粕
soybean meal蛋白胨+酵母膏
peptone+ yeast extract蛋白胨+硫酸铵
peptone+ (NH4)2SO4酵母膏+硫酸铵
yeast extract +(NH4)2SO4添加质量浓度
concentration10 10 10 10 10 5+5 5+5 5+5 表 3 培养基的无机盐及添加质量浓度
Table 3 Inorganic salt and its concentration in medium
g · L-1 无机盐
inorganic salt磷酸二氢钾
KH2PO4硫酸镁
MgSO4氯化钙
CaCl2磷酸二氢钾+硫酸镁
KH2PO4+ MgSO4磷酸二氢钾+硫酸镁+氯化钙
KH2PO4+ MgSO4+ CaCl2添加质量浓度
concentration0.5 0.5 0.5 0.25+0.25 0.5+0.25+0.1 表 4 正交试验因素水平
Table 4 Factors and levels of orthogonal test
水平
level因素factor (A)硫酸镁/g·L-1
MgSO4(B)葡萄糖/g·L-1
glucose(C)酵母膏/g·L-1
yeast extract(D)蛋白胨/g·L-1
peptone1 0.25 15 5 5 2 0.50 20 10 10 3 0.75 25 15 15 表 5 碳源对RH1菌量的影响
Table 5 Effect of carbon sources onbiomass of RH1
108 cfu · mL-1 碳源carbon source 菌量biomass 葡萄糖glucose 6.79±0.79a 蔗糖sucrose 4.78±0.48bc 糖蜜molasses 5.43±0.56abc 葡萄糖+蔗糖glucose+sucrose 4.99±0.67bc 葡萄糖+糖蜜glucose+molasses 5.73±0.90ab 蔗糖+糖蜜sucrose+molasses 3.64±0.94c 注:表格中的数值是3次平行试验的平均值,数据后不同上标字母表示5%显著水平。后表同此
Note:Values are expressed as average of 3 replicates; values with different superscript letters within the same column are significantly different(P<0.05). The same case in the following tables.表 6 氮源对RH1菌量的影响
Table 6 Effect of nitrogen sources on biomass of RH1
108 cfu · mL-1 氮源nitrogen source 菌量biomass 蛋白胨peptone 4.13±0.64a 酵母膏yeast extract 6.89±0.68b 硫酸铵(NH4)2SO4 1.34±0.63c 氯化铵NH4Cl 1.18±0.76c 豆粕soybean meal 1.35±0.49c. 蛋白胨+酵母膏peptone+yeast extract 7.13±1.18b 蛋白胨+硫酸铵peptone+(NH4)2SO4 3.87±0.78a 酵母膏+硫酸铵yeast extract+(NH4)2SO4 4.04±0.92a 表 7 无机盐对RH1菌量的影响
Table 7 Effect of inorganic salts on biomass of RH1
108 cfu · mL-1 无机盐inorganic salt 菌量biomass 磷酸二氢钾KH2PO4 4.43±0.33a 硫酸镁MgSO4 6.14±1.17ab 氯化钙CaCl2 4.22±0.76a 磷酸二氢钾+硫酸镁
KH2PO4+MgSO46.90±0.47b 磷酸二氢钾+硫酸镁+氯化钙
KH2PO4+MgSO4+CaCl25.27±1.27ab 表 8 正交试验结果分析
Table 8 Results of analysis of orthogonal test
108 cfu · mL-1 编号
No.A B C D 菌量
biomass1 1 1 1 1 6.04 2 1 2 2 2 8.44 3 1 3 3 3 4.60 4 2 1 2 3 4.08 5 2 2 3 1 6.76 6 2 3 1 2 5.92 7 3 1 3 2 7.32 8 3 2 1 3 3.64 9 3 3 2 1 5.56 k1 6.36 5.82 5.20 6.12 k2 5.58 6.28 6.02 7.22 k3 5.50 5.36 6.22 4.10 R 0.86 0.92 1.02 3.12 -
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