Determination of nitrite in salted fish by improved ion chromatography
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摘要:
文章优化了现有国家标准咸鱼中亚硝酸盐的离子色谱测定方法。咸鱼样品先经硝酸银(AgNO3)除去大部分氯离子(Cl-), IC-Ag预处理柱排除剩余Cl-的干扰, 再用Ion Pac AS23(4 mm×250 mm)分析柱和Ion Pac AG23(4 mm×50 mm)保护柱, 以4.5 mmol·L-1碳酸钠(NaCO3)和0.8 mmol·L-1碳酸氢钠(NaHCO3)的溶液为淋洗液, 流速为1.0 mL·min-1, 抑制型电导检测器检测。结果显示, 用该改良方法测定不同品种咸鱼亚硝酸根离子(NO2-)的线性范围为0.01~2.00 mg·L-1, 相关系数为0.999 9, 加标回收率为83.0%~101.6%, 方法检出限为0.2 mg·kg-1。该方法前处理简便、快速, 能更加准确测定咸鱼制品的亚硝酸盐质量分数。
Abstract:We determined the nitrite in salted fish by an improved ion chromatography method. The samples were first pretreated by AgNO3 solution to remove most of the Cl- and the rest of Cl- was excluded by using the Anpelclean TMIC-Ag column. Then the separation of nitrite was determined by suppressed conductivity detection on Ion Pac AS23 (4 mm×250 mm) analytical column and Ion Pac AG23 (4 mm×50 mm) guard column using 4.5 mmol·L-1 NaCO3 and 0.8 mmol·L-1 NaHCO3 as elution solvents at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The linear range of this improved method is 0.01~2.00 mg·L-1 with correlation coefficient (R) of 0.999 9; the detection limit is 0.2 mg·kg-1and the recovery is 83.0%~101.6%. The method with simple and fast pretreatment can determine nitrite in salted fish products more accurately.
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Keywords:
- salted fish /
- nitrite /
- ion chromatography /
- improvement
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亚硝酸盐是一种常用的食品添加剂，能够保持肉制品的鲜亮色泽，抑制肉毒梭菌的生长[1]。但食用过量会对人体造成危害，亚硝酸盐可氧化人体正常的血红蛋白，使其失去携氧能力，导致组织缺氧[2-3]。此外，亚硝酸盐还能与胺类物质反应，生成具有致癌性的N-亚硝基化合物[4-5]。目前普遍认为咸鱼等腌制食品中亚硝酸盐含量偏高，给食用安全造成潜在危害，也对咸鱼等产业造成了很大的影响[6-8]。因此，研究准确检测咸鱼中亚硝酸盐的方法，并通过有效的控制技术改进工艺条件，提高咸鱼食用的安全性，对促进腌制水产品加工业的迅速发展具有十分重要的意义[9-10]。
随着分析化学新方法和新技术的不断出现和发展，食品中亚硝酸盐的检测方法也更加多元化，目前主要有分光光度法、离子色谱法、荧光分析法、毛细血管电泳、气相色谱法以及各种联用技术等[11-12]，国家标准GB/T 5009.33-2010中以离子色谱法和分光光度法作为食品中亚硝酸盐检测的主要方法[13]。但是在利用国家标准中离子色谱法检测咸鱼等腌制食品时，由于亚硝酸根离子(NO2-)和氯离子(Cl-)的保留时间非常接近，而腌制食品的含盐量高，导致无法准确测定其中的亚硝酸盐质量分数。
该改良方法旨在解决咸鱼等高盐食品中亚硝酸盐的离子色谱检测问题，建立起利用离子色谱测定咸鱼中亚硝酸盐质量分数的方法，并可将其应用于其他腌制食品中亚硝酸盐的检测。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品
咸鱼为六齿金线鱼(Nemipterus hexodom，俗称红三鱼) (A)、黑鳍大眼鲷鱼(Priacanthus boops，俗称红目鲢鱼) (B)和尖头黄鳍牙鱼(Otolithes ruber，俗称三牙鱼)[14](C)，均购于广州市水产品市场。
1.1.2 试剂
所用试剂均为分析纯，试验用水为电阻率为18.2 MΩ · cm的去离子水。亚硝酸钠(NaNO2)标准贮备液(1 000 mg · L-1)为称取在硅胶干燥器中干燥24 h[或经(115±5)℃真空干燥至恒质量]的NaNO2 0.100 0 g，用水定容至100 mL。NaNO2标准使用液(10 mg · L-1)为临用时吸取硝酸钠(NaNO3)标准溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。
1.1.3 仪器与设备
ICS-3000型离子色谱仪；Chromeleon 6.80色谱工作站；AS40自动进样器(以上仪器均为美国DIONEX公司出品)；LC-C18预处理柱(德国CNW公司出品)；IC-Ag预处理柱(上海安普科学仪器有限公司出品)；固相萃取装置(美国SUPELCO公司出品)；冷冻离心机(美国Sigma公司出品)。
1.2 方法
1.2.1 玻璃器皿预处理[13]
所有玻璃器皿在试验前依次用2 mol · L-1氢氧化钠(NaOH)和水分别浸泡4 h，然后用超纯水冲洗3~5次，晾干备用。
1.2.2 样品的处理[15-18]
取以上3种咸鱼分别绞碎后称取2.00 g于200 mL烧杯中，加入水70 mL，移入100 mL容量瓶中用超声波(35 kHz)提取30 min，每5 min震荡1次，保持固相完全分散。在提取液中加入2 mL 0.5 mol · L-1硝酸银(AgNO3)后加水稀释至刻度。取一定体积提取液加2倍体积二氯甲烷(CH2Cl2)，充分震荡，于10 000 r · min-1冷冻离心机离心15 min，取上清液15 mL通过0.22 μm水性滤膜针头滤器、C18萃取柱，再将滤液过IC-Ag预处理柱，将滤液收集到自动进样器的进样管中，按色谱分析条件进行测定。
1.2.3 色谱条件
Ion Pac AS23分离柱(4 mm×250 mm)，Ion Pac AG23保护柱(4 mm×50 mm)，柱温为30 ℃；Dionex ASRS(4 mm)连续再生阴离子抑制器，抑制器电流50 mA，淋洗液流速为1.0 mL · min-1，进样体积为50 μL，定量环进样。采用4.5 mmol · L-1碳酸钠(NaCO3)和0.8 mmol · L-1碳酸氢钠(NaHCO3)的溶液作淋洗液，电导检测器检测，检测池温度为35 ℃[19]。
2. 结果与分析
2.1 样品前处理方法的选择
样品处理过程中主要除去脂肪、蛋白质和不溶残渣等，若加热时间过短，蛋白质不能充分沉淀，加热时间过长又易使亚硝酸盐分解成氧化氮和硝酸，使测得结果偏低。将样品用CH2Cl2处理后蛋白质变性絮凝，脂肪溶解于CH2Cl2中，可有效除去咸鱼样品中大部分脂肪、蛋白质和不溶残渣，同时避免高温下亚硝酸盐的损失。
在色谱分离过程中Cl-和NO2-的保留时间十分接近，由于咸鱼样品w (NaCl)约为10%~30%，超高含量Cl-的存在严重干扰了NO2-的测定(图 1-a)，但如果直接用银(Ag)柱作预处理，不仅不能完全除去其中的Cl-，而且将影响Ag柱的柱效(图 1-b)。因此，在过C18萃取柱和Ag柱之前先加适量AgNO3(与咸鱼中的含盐量相当，不可过量)可除去咸鱼样品溶液中的大部分Cl-，再过Ag柱可消除剩余Cl-的干扰(图 1-c)。此外，由于亚硝酸盐易被氧化为硝酸盐，在测定过程中应注意标准样品及样品溶液不能放置过长时间。
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图 1 不同样品前处理对NO2-分离的影响a. 样品未用AgNO3处理，也未过Ag柱；b. 样品仅用Ag柱处理；c. 样品用AgNO3处理后过Ag柱Figure 1. Effect of different pre-treatments on separation of nitritea. sample without AgNO3 treatment and Ag column processing; b. sample only treated with Ag column processing; c. sample treated with AgNO3 and Ag column processing2.2 淋洗条件的选择
淋洗液的浓度会影响到离子交换的平衡和离子的保留，淋洗的离子浓度越高，淋洗液从色谱柱固定相中置换离子的能力就越强，溶质离子的洗脱时间就短[20]。文章研究了不同浓度配比的NaCO3和NaHCO3溶液作为Ion Pac AS23色谱柱的淋洗液，结果显示，随着淋洗液浓度的增加，离子的保留时间缩短，但保留时间过短不利于干扰离子与NO2-的分离，多次试验结果表明，淋洗液的浓度为4.5 mmol · L-1 NaHCO3和0.8 mmol · L-1 Na2CO3时NO2-与其他阴离子的分离效果最好。
2.3 线性方程及相关系数
用逐渐稀释法配制0.01~2.00 mg · L-1范围的8个系列标准溶液，按色谱条件对NO2-系列标准溶液进行测定，以峰面积值对ρ (NO2-)进行线性回归，线性范围为0.01~2.00 mg · L-1，线性回归方程为y=0.126x+0.000 01，相关系数为0.999 9，标准曲线见图 2。以噪音信号的3倍计算检出限，ρ (NO2-)的最低检出限为0.004 mg · L-1，样品中w (NO2-)的检出限为0.2 mg · kg-1。标准溶液及样品溶液的峰见图 3和图 4，从图中可见NO2-峰形对称，基线平稳，分离效果良好。
2.4 准确度
按试验方法处理与测定加标咸鱼样品，咸鱼样品中NO2-测定结果及回收率见表 1。该检测方法NO2-的回收率在83.0%~101.6%，准确度较高。
表 1 NO2-的加标回收率(n=6)Table 1. Recovery of nitrite样品号
sample No.本底值/mg·L-1
background value标准加入量/mg·L-1
standard addition quantity测得总量/mg·L-1
total measured回收率/%
recoveryA 0.042 8±0.03 0.050 0 0.094 3±0.04 101.6 B 0.026 3±0.01 0.025 0 0.042 6±0.01 83.0 C 0.014 2±0.00 0.020 0 0.032 2±0.02 94.4 2.5 精密度
对ρ (NO2-)为0.05 mg · L-1、0.10 mg · L-1、0.20 mg · L-1的标准样品按照测定条件分别进行6次平行测定，其测定结果见表 2。该检测方法NO2-的保留时间、峰面积和质量浓度的精密度较高。
表 2 NO2-的精密度(n=6)Table 2. Precision of determination of nitriteρ/mg·L-1
concentration保留时间/min
retention time峰面积/μS·min
peak area of nitriteρ(NO2-)/mg·L-1
concentration of nitritet±t RSD/% S±S RSD/% c±c RSD/% 0.5 8.16±0.00 0.01 0.068 0±0.00 1.22 0.482 2±0.00 0.86 1.0 8.18±0.00 0.02 0.125 6±0.00 0.86 0.985 3±0.01 1.12 2.0 8.17±0.01 0.06 0.252 5±0.00 1.45 2.030 5±0.03 1.47 2.6 方法的验证
为进一步验证方法的可靠性，采用该方法与GB/T 5009.33-2010中分光光度法分别对3种咸鱼中亚硝酸盐进行了测定，每个样品平行测定6次，计算其平均值及相对标准偏差，然后与该法测定结果比较，结果见表 3。
表 3 样品中亚硝酸盐的含量(n=6)Table 3. Content of NO2- in sample样品
sample方法
methodw(亚硝酸盐)/mg·kg-1
nitrite content相对标准偏差/%
RSD样品A sample A 此方法 2.14±0.01 0.92 国家标准分光光度法 2.20±0.05 3.43 样品B sample B 此方法 1.33±0.01 1.27 国家标准分光光度法 1.46±0.06 5.72 样品C sample C 此方法 0.71±0.01 1.56 国家标准分光光度法 0.63±0.03 6.83 此改良离子色谱法测定咸鱼样品中亚硝酸盐质量分数的标准偏差分别为0.92%、1.27%和1.56%，用国家标准中的分光光度法测咸鱼样品中的亚硝酸盐质量分数的相对标准偏差分别为3.43%、5.72%和6.83%。这表明该方法比国家标准中分光光度法的系统误差小。
3. 讨论与结论
3.1 准确度与重现度
GB/T 5009.33食品中硝酸盐与亚硝酸盐测定中的离子色谱测定方法对于咸鱼类等食品只是用超声提取30 min，再于75 ℃水浴中放置5 min，离心取上清液，过C18萃取柱、Ag柱和纳(Na)柱，并用氢氧化钾(KOH)溶液作为淋洗液，但采用这种方法无法准确测定出咸鱼等腌制食品的亚硝酸盐质量分数，这跟咸鱼等腌制品中含盐量过高有关，样品的前处理过程需要进行改进。
该研究表明，改良后的离子色谱法能准确快速地测定出咸鱼制品中亚硝酸盐的质量分数，在测定准确度和重现性方面均最好。这是因为Cl-和NO2-的保留时间十分接近，咸鱼样品中盐的质量分数较高(10%~30%)，较高含量Cl-严重干扰了NO2-的测定。该方法先用AgNO3除去咸鱼样品溶液中的大部分Cl-，再通过Ag柱进一步消除Cl-，这样就保证能消除Cl-的干扰，同时避免Ag的过量而污染甚至损坏色谱柱。另外，Ion Pac AS23色谱柱的淋洗液浓度会影响离子交换的平衡和离子的保留，而该方法筛选到最佳的淋洗液浓度为4.5 mmol · L-1 NaHCO3和0.8 mmol · L-1Na2CO3，用该淋洗液浓度进行淋洗，NO2-与其他阴离子的分离效果最好。
3.2 样品预处理溶剂的选择
在样品预处理过程中，国家标准方法中采用75 ℃水浴除蛋白的方法，不仅促进亚硝酸盐的氧化，操作繁琐，而且无法有效除去咸鱼中的蛋白和油脂。该改良离子色谱测定方法选择了CH2Cl2，既有效地去除了蛋白质和脂肪等有机物，又防止了亚硝酸盐的氧化，减少了亚硝酸盐的损失，提高了回收率，而且操作简便、快速。
3.3 改良后的离子色谱法与分光光度法的比较
用改良后的离子色谱法测定咸鱼制品中的亚硝酸盐质量分数准确度高、检出限低、结果稳定。但分光光度法测定过程显色受温度、时间、盐度等多种因素影响，变化较大且不稳定。文章中采用改良离子色谱法和国家标准中的分光光度法分别测定咸鱼样品中的亚硝酸盐质量分数，结果离子色谱法快速准确，相对标准偏差为0.92%~1.56%，分光光度法测定的相对标准偏差为3.43%~6.83%，约为离子色谱法的3倍，所以改良后的离子色谱法能更快速准确地测定咸鱼制品的亚硝酸盐质量分数，且测定过程不受环境温度、测定时间等的影响，检测结果稳定可靠。
3.4 结论
文章建立离子色谱测定咸鱼中亚硝酸盐的改良方法，能使目标物在色谱图上有合适的保留时间，峰形好，目标峰与杂质峰完全分离，稳定性好，精密度较高。该方法的NO2-的检出限为0.2 mg ·kg-1，回收率不低于83.0%，与国家标准GB/T 5009.33相比，不存在显著性差异，前处理简便、快速，能准确测定咸鱼制品的亚硝酸盐质量分数。
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图 1 不同样品前处理对NO2-分离的影响
a. 样品未用AgNO3处理，也未过Ag柱；b. 样品仅用Ag柱处理；c. 样品用AgNO3处理后过Ag柱
Figure 1. Effect of different pre-treatments on separation of nitrite
a. sample without AgNO3 treatment and Ag column processing; b. sample only treated with Ag column processing; c. sample treated with AgNO3 and Ag column processing
表 1 NO2-的加标回收率(n=6)
Table 1 Recovery of nitrite
样品号
sample No.本底值/mg·L-1
background value标准加入量/mg·L-1
standard addition quantity测得总量/mg·L-1
total measured回收率/%
recoveryA 0.042 8±0.03 0.050 0 0.094 3±0.04 101.6 B 0.026 3±0.01 0.025 0 0.042 6±0.01 83.0 C 0.014 2±0.00 0.020 0 0.032 2±0.02 94.4 
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表 2 NO2-的精密度(n=6)
Table 2 Precision of determination of nitrite
ρ/mg·L-1
concentration保留时间/min
retention time峰面积/μS·min
peak area of nitriteρ(NO2-)/mg·L-1
concentration of nitritet±t RSD/% S±S RSD/% c±c RSD/% 0.5 8.16±0.00 0.01 0.068 0±0.00 1.22 0.482 2±0.00 0.86 1.0 8.18±0.00 0.02 0.125 6±0.00 0.86 0.985 3±0.01 1.12 2.0 8.17±0.01 0.06 0.252 5±0.00 1.45 2.030 5±0.03 1.47
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表 3 样品中亚硝酸盐的含量(n=6)
Table 3 Content of NO2- in sample
样品
sample方法
methodw(亚硝酸盐)/mg·kg-1
nitrite content相对标准偏差/%
RSD样品A sample A 此方法 2.14±0.01 0.92 国家标准分光光度法 2.20±0.05 3.43 样品B sample B 此方法 1.33±0.01 1.27 国家标准分光光度法 1.46±0.06 5.72 样品C sample C 此方法 0.71±0.01 1.56 国家标准分光光度法 0.63±0.03 6.83
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