微藻是水生生态系统中以光能自养产能的初级生产者，在特定条件下微藻细胞能够积累大量的三酰甘油，含量可达细胞干质量的50%以上^[1]，利用微藻生产油脂已经成为目前研究的热点，微藻油脂可以用作保健食品或制备生物柴油^[2]。微藻细胞能够利用二氧化碳(CO₂)进行光合自养生长，在培养液碳源充足的条件下，部分微藻可以在有光照情况下利用有机和无机碳源进行混合营养生长或是在无光照条件下异养生长^[3-4]，混养和异养已经成为一种快速、大量培养微藻的有效方法^[5]。氮(N)、磷(P)是微藻生长所需要的重要元素，N的缺乏会导致藻细胞生长受到抑制，但有利于脂类物质的积累^[6-7]；P对微藻油脂积累的影响则因藻种不同而有别，一些微藻在缺P状况下油脂积累增加，而部分微藻缺P反而导致油脂质量分数降低^[8-9]。

小球藻是单细胞藻类，常见的有普通小球藻(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)、若夫小球藻(C.zofingiensis)等。若夫小球藻被认为是优良的虾青素和油脂生产株^[10-11]。目前关于若夫小球藻生产油脂的研究主要为光合自养和异养^[12-13]，以及N、P浓度对其生长和油脂积累的影响^[14]，较少见到营养方式、不同氮源和pH对其生长和油脂积累的影响报道。笔者以若夫小球藻为研究对象，考察了3种营养方式、不同氮源、P质量浓度和pH对其生长和油脂积累的影响，以期提高若夫小球藻藻体质量浓度和油脂质量浓度，为其工业化应用提供研究基础。

1.   材料与方法

1.1   材料与设备

若夫小球藻由海南大学生物工程实验室分离保存。试验前反复平板划线纯化直到显微镜检不再有杂菌。

光照发酵罐(瑞士INFORS)；光照摇床(瑞士MINITRON)；紫外可见分光光度计(中国普析通用TU-1810)；甲醇、葡萄糖等试剂均为国产分析纯。

1.2   培养基及培养条件

微藻的培养采用以下2种方式：1)发酵罐培养，培养基为BG-11液体培养基，按体积分数为10%接种，生长条件设定为温度26 ℃，搅拌速度300 r · min^-1，植物生长灯连续光照，光照强度为10 000 lx，通入无菌空气，通气压力为0.16 Mpa；2)光照摇床培养，培养基为BG-11液体培养基，以10%的体积分数接种于2 000 mL三角瓶中，三角瓶中装1 000 mL培养液，置于光照摇床里，生长条件设定温度26 ℃，搅拌速度100 r · min^-1，连续光照，光照强度为4 000 lx。培养结束后离心收集藻液，冻干后藻粉保存于－20 ℃冰箱。

1.3   试验设计

1.3.1   营养方式对细胞生长和油脂积累的影响

在3种营养方式下培养若夫小球藻：1)光合自养(BG-11基本培养基，光照)；2)混合营养(BG-11基本培养基，葡萄糖、蔗糖、甘氨酸和乙酸钠，最终有效碳质量浓度均为2 g · L^-1，光照)；3)异养(BG-11基本培养基，质量浓度为20 g · L^-1的葡萄糖和蔗糖，黑暗)。试验均采用摇床培养，设2组平行试验，自养和混合营养的培养周期为12 d，异养的培养周期为9 d，培养过程中每天测定光密度(OD_{680 nm})，离心收集藻液，冻干后测定干质量及总脂质量浓度。

1.3.2   不同氮源对细胞生长和油脂积累的影响

以不含氮源的BG-11培养基为基本培养基，在培养基中分别加入硝酸钠、氯化铵、尿素，最终有效氮质量浓度均为165 mg · L^-1，以不含氮源的BG-11培养基为对照，研究不同氮源对若夫小球藻细胞生长和油脂积累的影响，培养周期为10 d，培养过程中每天测定OD_{680 nm}，离心收集第10天的藻液，冻干后测定干质量及总脂质量浓度。

1.3.3   P质量浓度对细胞生长和油脂积累的影响

以BG-11培养基为基本培养基，设定P质量浓度为0、3.5 mg · L^-1、7.0 mg · L^-1和14.0 mg ·L^-1，研究P质量浓度对若夫小球藻细胞生长和油脂积累的影响，培养周期为10 d，培养过程中每天测定OD_{680 nm}，离心收集第10天的藻液，冻干后测定干质量及总脂质量浓度。

1.3.4   pH对细胞生长和油脂积累的影响

采用发酵罐培养，在pH为7条件下培养4 d，然后逐渐改变pH，pH每2 d降低或升高0.5，直到若夫小球藻细胞裂解死亡，得到其对pH的最大耐受限度，培养过程中每2 d测定OD_{680 nm}；再次采用发酵罐培养若夫小球藻，依上述方法调节pH，在若夫小球藻细胞裂解死亡之前停止培养，收集藻细胞测定藻体质量浓度及油脂质量分数。以未控制pH的培养为对照，考察极端pH对若夫小球藻细胞生长和油脂积累的影响。

1.4   分析方法

参照LUYEN^[4]总脂测定方法并稍加改进，称取藻粉0.1 g，加入氯仿-甲醇-水(体积比为1 : 2: 1)混合液20 mL，50 ℃超声提取15 min，然后加入氯仿-水(体积比为1 : 1)混合液10 mL，50 ℃超声提取15 min，取氯仿层于旋转蒸发器上蒸干，得到微藻油在50 ℃下干燥至恒质量，计算出油率，设置3个平行试验，取平均值。按照下面公式计算油脂质量分数和总脂质量浓度：

油脂质量分数=(m₁/0.1g)×100%，式中m₁1表示0.1 g藻粉提取所得到的油脂质量(g)；

总脂质量浓度(g · L^-1)=微藻藻体质量浓度×油脂质量分数，式中微藻藻体质量浓度(g · L^-1)为单位体积培养液所收获的微藻质量。

2.   结果与分析

2.1   营养方式对细胞生长和油脂积累的影响

若夫小球藻在不同营养方式下的生长曲线见图 1。混合营养方式下若夫小球藻生长状况明显好于自养和异养方式，生长速率由高至低依次为乙酸钠、蔗糖、葡萄糖和甘氨酸，培养初期甘氨酸生长速率较快，但很快进入稳定期。异养状况下若夫小球藻生长周期较短，6 d即出现明显的衰退。若夫小球藻在不同营养方式下的最终藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度见表 1。与生长曲线类似，混养方式下若夫小球藻藻体质量浓度和油脂质量分数要高于自养和异养方式。若夫小球藻在以蔗糖为碳源的混合营养方式下藻体的质量浓度最高(7.2 g · L^-1)，分别为自养和异养的3.1和4.5倍，若夫小球藻在以葡萄糖为碳源的混合营养方式下油脂质量分数最高(44.4%)，分别为自养和异养的1.5和1.3倍。若夫小球藻在以蔗糖为碳源的混合营养方式下总脂质量浓度最高(3.14 g · L^-1)，分别是自养和异养的4.6和5.0倍。若夫小球藻在以蔗糖为碳源的混养方式下总脂质量浓度略高于葡萄糖，但异养方式下以葡萄糖为碳源明显高于蔗糖。若夫小球藻最适合的培养方式为添加少量的蔗糖或葡萄糖的混合营养模式。

图  1  营养方式对若夫小球藻生长的影响

Figure  1.  Effects of different trophic modes on the growth of C.zofingiensis

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表  1  不同营养方式下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度

Table  1.  Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of C.zofingiensis cells in different trophic modes

碳源 carbon sources	ρ(藻体)/g·L-1 biomass productivity	w(油脂)/% lipid content	ρ(总脂)/g·L-1 lipid productivity
葡萄糖 glucose	6.1	44.4	2.71
蔗糖 sucrose	7.2	43.6	3.14
甘氨酸 glycine	2.6	39.0	1.01
乙酸钠 sodium acetate	6.8	31.4	2.14
自养 autotrophic	2.3	29.9	0.69
异养(葡萄糖) heterotrophic(glucose)	3.6	34.4	1.24
异养(蔗糖) heterotrophic(sucrose)	1.6	39.2	0.63

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2.2   不同氮源对细胞生长和油脂积累的影响

若夫小球藻在不同氮源下的生长曲线见图 2。在以硝酸钠和尿素为氮源的情况下，若夫小球藻的生长速率明显高于氯化铵和缺氮(空白)状况。在培养的前3 d若夫小球藻的生长速率基本相同，之后硝酸钠和尿素组进入对数生长期，培养第7天生长速率减缓进入稳定期，氯化铵组则以较低速率生长，缺氮组在培养第4天即出现明显衰退后进入稳定期。若夫小球藻在不同氮源下的最终藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度见表 2。若夫小球藻最终藻体质量浓度与生长速率基本一致，硝酸钠组和尿素组相同且明显高于氯化铵和缺氮组，以尿素为氮源若夫小球藻藻体质量浓度最高，是缺氮情况下的2倍。硝酸钠组和尿素组油脂质量分数相同且高于氯化铵组，但低于缺氮组。若夫小球藻最终总脂质量浓度由高到低依次为尿素、硝酸钠、缺氮、氯化铵，以尿素为氮源若夫小球藻最终总脂质量浓度为0.79 g · L^-1，是缺氮情况下的1.8倍。若夫小球藻最适生长氮源为尿素。

图  2  不同氮源对若夫小球藻生长的影响

Figure  2.  Effects of different nitrogen sources on the growth of C.zofingiensis

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表  2  不同氮源下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度

Table  2.  Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of C.zofingiensis cells in different nitrogen sources

氮源 nitrogen source	ρ(藻体)/g·L-1 biomass productivity	w(油脂)/% lipid content	ρ(总脂)/g·L-1 lipid productivity
硝酸钠 NaNO3	2.0	34.6	0.69
氯化铵 NH4Cl	1.0	27.6	0.28
尿素 CO(NH2)2	2.2	35.9	0.79
空白 blank control	1.1	39.1	0.43

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2.3   P质量浓度对细胞生长和油脂积累的影响

若夫小球藻在不同P质量浓度下生长和油脂积累情况见图 3和表 3。若夫小球藻生长速率随着P质量浓度升高而增快，在质量浓度为0~7.0 mg· L^-1时生长较快，2 d后进入指数生长期，7 d后生长减缓；当P质量浓度为14.0 mg · L^-1时若夫小球藻生长受到抑制，生长速率较慢，但在整个培养周期其一直处于增长状态。最终藻体质量浓度结果显示，P质量浓度越高若夫小球藻藻体质量浓度越高，质量浓度为14.0 mg · L^-1时若夫小球藻油脂质量分数最高(40.6%)。若夫小球藻最终总脂质量浓度随P质量浓度升高而增加，但过高质量浓度的P会对其前期生长有一定的抑制，且对总脂积累没有明显的促进作用，因此若夫小球藻培养过程中P质量浓度应当为7.0~14.0 mg · L^-1。

图  3  磷质量浓度对若夫小球藻生长的影响

Figure  3.  Effects of different concentration of phosphorus on the growth of C.zofingiensis

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表  3  不同磷质量浓度下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度

Table  3.  Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of C.zofingiensis cells in different concentration of phosphorus

ρ(P)/mg·L-1	ρ(藻体)/g·L-1 biomass productivity	w(油脂)/% lipid content	ρ(总脂)/g·L-1 lipid productivity
0	1.4	33.9	0.47
3.5	1.8	37.7	0.69
7.0	2.2	35.6	0.78
14.0	2.4	40.6	0.97

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2.4   pH对细胞生长和油脂积累的影响

以逐渐改变培养液pH的方式考察若夫小球藻对酸和碱的耐受性，结果见图 4和表 4。在不控制pH状况下若夫小球藻在培养的前12 d均能维持较高的生长速率，改变培养液pH对若夫小球藻生长影响较大，偏酸或偏碱的环境对若夫小球藻生长有较强的抑制作用；若夫小球藻对酸性环境耐受性较碱性环境强，在pH为4.5时能够维持较长时间的正常生长，而在pH为10时细胞生长衰退较快；pH为4和10时若夫小球藻细胞很快变黄并死亡；pH为9.5和4.5时若夫小球藻藻体质量浓度分别为0.9 g · L^-1和1.2 g · L^-1，是正常状况下的12%和16%；油脂质量分数略低于正常状况；最终总脂质量浓度仅为正常状况下的11%和15%。

图  4  pH对若夫小球藻生长的影响

Figure  4.  Effects of pH on the growth of C.zofingiensis

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表  4  不同pH下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度

Table  4.  Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of C.zofingiensis cells in different pH

pH	ρ(藻体)/g·L-1 biomass productivity	w(油脂)/% lipid content	ρ(总脂)/g·L-1 lipid productivity
10.0	细胞死亡	细胞死亡	细胞死亡
9.5	0.9	37.3	0.34
4.5	1.2	39.1	0.47
4.0	细胞死亡	细胞死亡	细胞死亡
对照(7.0~8.5) blank control	7.6	42.5	3.23

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3.   讨论

试验结果表明，不同营养方式对若夫小球藻生长和油脂积累有影响，混合营养是高密度培养若夫小球藻生产油脂的最佳方式。混合营养最佳碳源为蔗糖和葡萄糖，在添加少量蔗糖或葡萄糖的混养模式下若夫小球藻藻体质量浓度和油脂质量分数均明显高于自养和异养。这与现有几种微藻的研究报道相一致。陈涛等^[15]采用异养方式培养若夫小球藻生产虾青素，发现其异养最佳碳源为蔗糖和葡萄糖；曹云涛等^[3]关于不同营养方式对普通小球藻生长特性和细胞组成结果亦显示小球藻最佳培养方式为添加葡萄糖的混合营养方式；杨静等^[16]研究了6种微藻在不同培养方式下生长及产油情况，发现混合营养方式下，小球藻、栅藻(Scenedesmus obliquus)、等鞭金藻(Isochrysis galbana)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)藻体质量浓度和油脂质量分数均高于自养和异养。目前若夫小球藻主要培养方式为开放式自养或封闭式异养，自养虽然培养成本较低，但由于细胞密度较小，采收成本较高；异养对于无菌操作及设备要求较高，且大量消耗碳源；混合营养方式下若夫小球藻藻体质量浓度和油脂质量分数相对较高，为高密度、大规模培养若夫小球藻提供了一种理想模式，具有潜在的工业应用价值。

笔者研究结果表明，不同氮源对若夫小球藻生长和油脂积累有一定的影响，若夫小球藻以尿素为氮源时生长速度最快，缺N时生长较慢，但油脂质量分数最高。通常情况下微藻可利用氮源有铵态氮、硝态氮和有机氮，在吸收速度和利用程度上有一定差异。研究表明，部分微藻会优先利用铵态氮源，但铵态氮的吸收会很快改变培养液pH而对微藻生长产生抑制^[17]。王顺昌等^[18]研究了氨态氮、尿素氮和硝酸态氮对蛋白核小球藻生长、色素和中性脂肪积累的影响，发现尿素氮有利于蛋白核小球藻生长，硝酸态有利于蛋白核小球藻油脂积累。P参与碳水化合物的代谢和脂肪酸的转化，P是水生生态系统中初级生产力水平的关键制约因素，微藻可以直接利用无机磷元素，无机磷缺乏时藻类也可以利用有机磷来维持代谢活动^[19]。笔者的P质量浓度试验表明，若夫小球藻最适条件为添加7.0~14.0 mg · L^-1的P，过低及过高P质量浓度均会对若夫小球藻生长产生抑制。

pH对微藻细胞生长和油脂积累的影响主要在于改变细胞膜电荷和营养物的离子化程度，进而改变细胞内酶的活性和细胞对营养离子的吸收，例如光合作用中CO₂的吸收，呼吸作用中对有机碳源的利用效率，细胞代谢产物的再次利用及其毒性。眼点拟微绿球藻(Nannocholoropsis oculata)在pH 6.2~9.8下均能较好生长，但在pH 5.5条件下生长受到较强抑制^[20]；邓光等^[21]研究发现，锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)和塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)pH适应范围较小，最适pH为7.5~8.0，当pH为10时细胞全部裂解死亡。笔者的pH试验结果显示，改变pH对若夫小球藻生长有极大的影响，对油脂质量分数影响较小；若夫小球藻对pH最大耐受限度为4.5~9.5，当pH低于4.5或高于9.5若夫小球藻细胞会很快死亡。