Application of endogenous enzymes in astaxanthin extraction from shrimp shell
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摘要:
文章探讨了内源酶对虾青素提取效果的影响，并以高效液相色谱法(HPLC)测定样品中虾青素的质量浓度，研究了pH、温度和酶解时间这3个因素对虾青素提取效果的影响，采用正交试验进行优化，以虾壳虾青素的萃取率作为评价提取效果的指标。结果表明，当酶解最佳工艺条件为pH 4.0，温度50 ℃，酶解时间1.5 h时，虾青素的萃取率最高，可达32.16 μg·g-1湿虾壳，比直接超声提取提高28%。通过空白试验可知，外加脂肪酶对虾青素提取无促进作用，仅利用内源酶即可达到较好的提取效果，且经济节约。
Abstract:The extraction of astaxanthin from shrimp shell with endogenous enzyme is studied, and astaxanthin content in the extract is determined by high performance liquid chromatography (HPLC).The pH, temperature and hydrolysis time are considered as the factors to study the extraction effect. Orthogonal test is adopted for optimization, taking the yield of astaxanthin from shrimp shell as the evaluation indicator. The results show that the optimum process conditions are 4.0 pH, 50 ℃ and 1.5 h hydrolysis time, with the astaxanthin extraction from wet shrimp shell of 32.16 μg·g-1, which is 28% more than the extraction by direct ultrasonic treatment. No significant effect on the yield of astaxanthin is observed by adding lipase. Extracting astaxanthin by endogenous enzymes achieves better extraction effect and is economical.
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Keywords:
- shrimp shell /
- astaxanthin /
- endogenous enzyme /
- orthogonal test
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硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)主要存在于动物软骨、肌腱及韧带等组织中，是糖胺聚糖的一种，由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1, 4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的黏性多糖，并在N-乙酰氨基半乳糖的C-4位或C-6位羟基上发生硫酸酯化[1-2]。硫酸软骨素能促进角膜创伤的愈合及改善眼部干燥症状，缓解关节痛，用于治疗高脂血症等疾病，另外CS具有较好的保水性和黏性，具有抗肿瘤、抑制病毒活性，因此在医药、保健食品及化妆品行业有广泛应用[3-10]。
目前文献报道CS的测定方法主要有色谱法、分光光度法、电泳法、核磁共振法及配位滴定法等，检测的方法通常是依据CS水解或者酶解后产生的结构单元如D-葡萄糖醛酸、N-乙酰-D-氨基半乳糖及硫酸软骨素的大分子性质来分类的[11-21]。笔者采用的咔唑法测定ρ(CS)的原理是CS分子中的D-葡糖醛酸在浓硫酸作用下生成糠醛，后者与咔唑的乙醇溶液作用显红色，可在波长580 nm条件下进行测定；间苯三酚法测定ρ(CS)的基本原理是利用盐酸和醋酸混合液对CS进行水解，水解产物半乳糖醛酸与间苯三酚反应生成深粉红色多环的二芳基甲烷，在554 nm处有最大吸收。
1. 材料与方法
1.1 仪器与试剂
UV-3系列分光光度计(上海美谱达仪器有限公司出品)，HH-4型数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司出品)，电磁炉(广东美的电器有限公司出品)。硫酸软骨素、咔唑(分析纯)购自SIGMA公司，四硼酸钠、浓硫酸、间苯三酚、无水乙醇、浓盐酸(分析纯)购自广州化学试剂厂。
1.2 方法
1.2.1 咔唑法
1)溶液的配制。试剂Ⅰ：准确称量四硼酸钠0.191 g溶于200 mL浓硫酸中，棕色试剂瓶保存。试剂Ⅱ：准确称量咔唑0.300 g溶于200 mL无水乙醇中，棕色试剂瓶保存。CS标准溶液：准确称量0.100 g CS标准品到100 mL容量瓶中，去离子水定容至刻度后准确移取10 mL到50 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀备用，此时溶液中ρ(CS)为0.20 mg·mL-1。
2) 最大吸收波长扫描。取1.2.1中1)所述CS标准溶液0.4 mL于10 mL具塞试管中，然后加去离子水至1.0 mL，冰水浴条件下加入3.0 mL试剂Ⅰ混匀后，置于沸水浴中水解20 min后迅速转入冰水浴中冷却。向该水解后溶液中加入0.1 mL试剂Ⅱ，摇匀后沸水浴中显色20 min后迅速转入冰水浴中冷却，在400~800 nm波长范围内扫描。
3) 水解时间及显色时间的确定。取1.2.1中1)所述CS标准溶液1.0 mL于10 mL具塞试管中，选定显色时间为20 min，水解时间依次为10 min、20 min、25 min和30 min；选定水解时间为20 min，显色时间依次为15 min、20 min和25 min，按照1.2.1中2)所述方法进行水解、显色后于580 nm处测定吸光度值。
4) 测定时间的确定。取1.2.1中1)所述CS标准溶液1.0 mL于10 mL具塞试管中，经水解、显色后于580 nm处，读数频率每10 min 1次，测定60 min内吸光度值的变化。
5) 标准曲线的绘制。分别准确移取1.2.1中1)所述CS标准溶液0(空白)、0.2 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.8 mL和1.0 mL于10 mL具塞试管中，即CS质量分别为0、0.04 mg、0.06 mg、0.10 mg、0.16 mg和0.20 mg，定容到4 mL，配制成质量浓度为0、0.010 mg·L-1、0.015 mg·L-1、0.025 mg·L-1、0.040 mg·L-1和0.050 mg·L-1。按照1.2.1中2)所述方法进行水解、显色后于580 nm处测定吸光度值，每个质量浓度做3个平行。以测得吸光度值为纵坐标，ρ(CS)为横坐标用Excel 2003软件进行线性回归。
6) 回收率与精密度。以去离子水为空白样品，按照上述试验方法分别进行0.01 mg·L-1、0.025 mg·L-1和0.05 mg·L-1 3个水平的加标回收试验。分别移取1.2.1中1)所述CS标准溶液1.0 mL于6个10 mL具塞试管中，按照1.2.1中2)所述方法进行水解、显色后于580 nm处测定吸光度值。
1.2.2 间苯三酚法
1) 溶液的配制。间苯三酚乙醇溶液：准确称取10.0 g间苯三酚，以无水乙醇溶解并定容到200 mL，所得溶液间苯三酚质量浓度为50.0 mg·L-1，棕色试剂瓶保存。CS标准溶液：准确称取105 ℃干燥至恒质量的CS标准品0.100 g，以去离子水溶解并定容到10 mL，所得溶液ρ(CS)为10.0 mg·mL-1。
2) 浓盐酸用量及最大吸收波长扫描。取1.2.2中1)所述CS标准溶液0.2 mL于5 mL棕色容量瓶中，分别加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL浓盐酸，并加入1.0 mL冰醋酸，沸水浴水解60 min后立即降温中止水解反应5 min，加入间苯三酚乙醇溶液1.0 mL显色25 min后分别用超纯水补至容量瓶刻度，于400~800 nm波长范围内扫描。取1.2.2中1)所述CS标准溶液1.0 mL于5mL棕色容量瓶中，加入2.0 mL浓盐酸与1.0 mL冰醋酸，沸水浴水解60 min后立即降温中止水解反应5 min，加入间苯三酚乙醇溶液1.0 mL显色25 min后分别用超纯水补至容量瓶刻度，于400~800 nm波长范围内扫描。
3) 水解时间及显色时间的确定。取1.2.2中1)所述CS标准溶液0.4 mL于5 mL棕色容量瓶中，选定显色时间为25 min，水解时间依次为20 min、40 min、60 min和80 min；选定水解时间为60 min，显色时间依次为15 min、20 min、25 min和30 min，按照1.2.2中2)所述方法进行水解、显色后于554 nm处测定吸光度值。
4) 测定时间的确定。取1.2.2中1)所述CS标准溶液0.4 mL于5 mL棕色容量瓶中，经水解、显色后于554 nm处，读数频率为每2 min 1次，测定20 min内吸光度值的变化。
5) 标准曲线的绘制。分别移取1.2.2中1)所述CS标准溶液0(空白)、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL和0.4 mL于5 mL棕色容量瓶中，即CS质量分别为0、0.50 mg、1.00 mg、2.00 mg、3.00 mg和4.00 mg，定容到4 mL，配制成质量浓度为0、0.125 mg·L-1、0.250 mg·L-1、0.500 mg·L-1、0.750 mg·L-1和1.000 mg·L-1。按照1.2.2中2)所述方法进行水解60 min、显色25 min后于554 nm处测量吸光度值，每个质量浓度做3个平行。以测得的吸光度值为纵坐标、ρ(CS)为横坐标，用Excel 2003软件进行线性回归。
6) 回收率与精密度。以去离子水为空白样品，按照上述试验方法分别进行0.125 mg·L-1、0.500 mg·L-1和1.000 mg·L-1 3个水平的加标回收试验。分别移取1.2.2中1)所述CS标准溶液0.3 mL于6个5 mL棕色容量瓶中，按照1.2.2中2)所述方法进行水解、显色后于554 nm处测定吸光度值。
2. 结果与分析
2.1 间苯三酚法浓盐酸用量
按照1.2.2中2)所述方法对5种不同盐酸用量水解显色后于400~800 nm波长范围内扫描，结果见图 1。随着浓盐酸用量的增加，水解产物显色后的吸光度值不断变大，在554 nm波长处具有吸收峰；但随着浓盐酸用量的不断增加，在波长442 nm处的吸收影响亦随之增强，此现象表明随着浓盐酸用量的增加，水解产物显色后的颜色发生了变化，因此综合考虑该测定方法的灵敏度与所测CS样品的纯度对显色后颜色的影响，该试验选择浓盐酸用量为2.0 mL(图 1，d)，此时测定方法具有较高的灵敏度且可减少待测样品纯度对测定结果的影响。
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图 1 不同体积浓盐酸对吸光度值的影响a. 0.5 mL浓盐酸；b. 1.0 mL浓盐酸；c. 1.5 mL浓盐酸；d. 2.0 mL浓盐酸；e. 2.5 mL浓盐酸Figure 1. Effect of concentrated hydrochloric acid (HCl) at different volumes on absorbance valuea. 0.5 mL HCl; b. 1.0 mL HCl; c. 1.5 mL HCl; d. 2.0 mL HCl; e. 2.5 mL HCl2.2 最大吸收波长
按照1.2.1中2)与1.2.2中2)所述方法对2种显色物质进行最大波长扫描。结果显示，咔唑法最大吸收波长为580 nm，间苯三酚法最大吸收波长为554 nm。
2.3 显色时间与水解时间
2种方法的水解时间与显色时间试验结果分别见图 2和图 3。用咔唑法测定ρ(CS)，当水解时间为20 min时显色后测定的吸光度值最高(图 2-a)，因此水解时间为20 min时该方法灵敏度最高；用间苯三酚法测定ρ(CS)的水解时间为60 min时吸光度值最高(图 2-b)，故确定水解时间为60 min。用咔唑法与间苯三酚法测定CS时具有最大吸光度值的显色时间分别为20 min和25 min(图 3)。为保证方法最大灵敏度，咔唑法与间苯三酚法测定CS时确定最佳显色时间分别为20 min和25 min。
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图 2 咔唑法(a)和间苯三酚法(b)不同水解时间对吸光度值的影响Figure 2. Effect of different hydrolysis time on absorbance value for carbazole method (a) and phloroglucinol method (b)![]()
图 3 咔唑法(a)和间苯三酚法(b)显色时间对吸光度值的影响Figure 3. Effect of different coloration time on absorbance value for carbazole method (a) and phloroglucinol method (b)2.4 测定时间的确定
用咔唑法与间苯三酚法测定CS，吸光度值随测定时间变化规律分别见图 4。用咔唑法测定CS，显色后比色管中有部分不溶物，静置10 min后测定，10~60 min内吸光度变化极不显著(图 4-a)，因此选择测定时间为10 min；用间苯三酚法测定CS，显色后的样液立即转入分光光度计中测定20 min内吸光度变化，前2 min内吸光度值出现极显著的降低，当10 min以后测定时样液吸光度变化极不显著(图 4-b)，因此选择测定时间为10 min。
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图 4 咔唑法吸光度值(a)和间苯三酚法吸光度值(b)随时间变化规律Figure 4. Law of absorbance value changed with time for carbazole method(a) and phloroglucinol method(b)2.5 标准曲线
以咔唑法试验条件下测得标准系列吸光度值A为纵坐标、ρ(CS)(mg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，结果见图 5-a；以间苯三酚法试验条件下测得标准系列吸光度值A′为纵坐标、ρ(CS)(mg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，结果见图 5-b。用咔唑法测定CS时，ρ(CS)在0.01~0.05 mg·mL-1范围内与其吸光度值呈良好的线性关系，标准曲线方程y=2.378x+0.004，R2=0.993 5(图 5-a)。用间苯三酚法测定CS时，ρ(CS)在0.1~1.0 mg·mL-1范围内与其吸光度值呈良好的线性关系，标准曲线方程y=0.125x+0.056，R2=0.999 8(图 5-b)。
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图 5 咔唑法(a)和间苯三酚法(b)标准曲线Figure 5. Standard curves of carbozole method (a) and phloroglucind method (b)由此可见，2种方法线性关系良好，R2均能够达到0.99；但2种方法标准曲线的回归系数相差较大，咔唑法为2.378，间苯三酚法为0.125，表明咔唑法的灵敏度优于间苯三酚法。另外，比较2种方法的线性范围可知，咔唑法检测浓度范围明显低于间苯三酚法，更适用于CS含量较低的样品检测。
2.6 回收率与精密度
咔唑法测定CS，不同加标水平的加标回收率为98.0%~102.5%；间苯三酚法测定CS，不同加标水平的加标回收率为83.2%~106.6%(表 1)。2种方法测定CS的加标回收率理想，方法较准确。
表 1 咔唑法与间苯三酚法加标回收率试验结果Table 1. Recovery of standard addition of carbazole method and phloroglucinol method方法
method本底值/mg
background value加标量/mg
spiked amount测定值/mg
measured value回收率/%
recovery咔唑法 carbazole method 0 0.04 0.041 102.5 0.10 0.098 98.0 0.20 0.199 99.5 间苯三酚法 phloroglucinol method 0 0.50 0.416 83.2 2.00 2.132 106.6 4.00 3.834 95.9 用咔唑法测定CS进行了6次平行试验，相对平均偏差(RSD)为3.90%；间苯三酚法6次平行试验测定CS的RSD为4.28%(表 2)。因此, 2种方法测定CS的RSD均小于5%，方法精密度较高。
表 2 咔唑法与间苯三酚法精密度试验结果Table 2. Precisions of carbazole method and phloroglucinol method方法
method试验结果/mg·mL-1 result 平均数
meanRSD/% 1 2 3 4 5 6 咔唑法 carbazole method 0.197 0.193 0.191 0.185 0.180 0.178 0.187±0.007 3.90 间苯三酚法 phloroglucinol method 3.243 3.123 2.907 3.171 3.275 3.059 3.130±0.134 4.28 3. 结论
1) 根据试验结果，确定咔唑法的最佳试验方案是吸收波长为580 nm，对样品水解20 min，显色20 min后冷却静置10 min后测定。
2) 根据试验结果，确定间苯三酚法的最佳试验方案是最大吸收波长为554 nm，对样品水解60 min、显色25 min后冷却静置10 min后测定。
3) 咔唑法与间苯三酚法所使用的测定仪器较常见、操作简便、具有较理想的准确度与精密度，是目前测定CS的最常见方法。对比咔唑法与间苯三酚法测定ρ(CS)，前者单个样品耗时50 min，后者单个样品耗时95 min，因此咔唑法较间苯三酚法省时，但是由于咔唑具有较高毒性，试验操作时要格外注意。由2种方法标准曲线可知，咔唑法回归系数明显高于间苯三酚法，即前者方法灵敏度高于后者；咔唑法测定ρ(CS)的线性范围为0.01~0.05 mg·mL-1，而间苯三酚法测定CS线性范围为0.1~1.0 mg·mL-1，因此ρ(CS)较低的样品宜用咔唑法，而ρ(CS)较高的样品宜采用间苯三酚法。
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表 1 内源酶酶解因素水平表[L9(34)]
Table 1 Factors and levels of[L9(34)] orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
水平
level因素 factor A: pH B: 温度/℃ C: 时间/h 1 4.0 40 1.0 2 5.0 45 1.5 3 6.0 50 2.0 
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表 2 L9(34)内源酶酶解正交试验表
Table 2 L9(34) orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
试验号
trial No.因素 factor 萃取率/μg·g-1
yieldA: pH B: 温度/℃ C: 时间/h 1 1 1 1 26.68 2 2 2 2 32.06 3 3 3 3 28.29 4 1 2 3 28.43 5 2 3 1 28.28 6 3 1 2 31.24 7 1 3 2 32.16 8 2 1 3 26.90 9 3 2 1 27.61 k1 29.09 28.28 27.53 k2 29.08 29.37 31.82 k3 29.05 29.58 27.88 R 0.04 1.30 4.30
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表 3 L9(34)内源酶解正交表方差分析
Table 3 L9(34) analysis of orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
因素
factor偏差平方和
sum of square of deviations自由度
degree of freedomF比
ratio of FF临界值
critical value of F显著性
significancepH 0 2 0 6.94 温度 temperature 2.93 2 2.00 6.94 时间 time 34.16 2 23.28 6.94 * 误差 error 2.94 4 注：*.水平显著(P < 0.05)
Note: *. significant difference(P < 0.05)
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表 4 脂肪酶对虾青素提取效果的影响
Table 4 Effect of lipase on astaxanthin extraction
脂肪酶量
addition of lipasepH 温度/℃
temperature时间/h
time萃取率/μg·g-1
yield平均萃取率/μg·g-1
average yield相对标准偏差/%
RSD0 4.0 50 1.5 32.85 0 4.0 50 1.5 33.23 32.98 0.22 0 4.0 50 1.5 32.86 2% 4.0 50 1.5 30.62 2% 4.0 50 1.5 34.36 32.63 1.89 2% 4.0 50 1.5 32.91
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