Application of endogenous enzymes in astaxanthin extraction from shrimp shell
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摘要:
文章探讨了内源酶对虾青素提取效果的影响，并以高效液相色谱法(HPLC)测定样品中虾青素的质量浓度，研究了pH、温度和酶解时间这3个因素对虾青素提取效果的影响，采用正交试验进行优化，以虾壳虾青素的萃取率作为评价提取效果的指标。结果表明，当酶解最佳工艺条件为pH 4.0，温度50 ℃，酶解时间1.5 h时，虾青素的萃取率最高，可达32.16 μg·g-1湿虾壳，比直接超声提取提高28%。通过空白试验可知，外加脂肪酶对虾青素提取无促进作用，仅利用内源酶即可达到较好的提取效果，且经济节约。
Abstract:The extraction of astaxanthin from shrimp shell with endogenous enzyme is studied, and astaxanthin content in the extract is determined by high performance liquid chromatography (HPLC).The pH, temperature and hydrolysis time are considered as the factors to study the extraction effect. Orthogonal test is adopted for optimization, taking the yield of astaxanthin from shrimp shell as the evaluation indicator. The results show that the optimum process conditions are 4.0 pH, 50 ℃ and 1.5 h hydrolysis time, with the astaxanthin extraction from wet shrimp shell of 32.16 μg·g-1, which is 28% more than the extraction by direct ultrasonic treatment. No significant effect on the yield of astaxanthin is observed by adding lipase. Extracting astaxanthin by endogenous enzymes achieves better extraction effect and is economical.
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Keywords:
- shrimp shell /
- astaxanthin /
- endogenous enzyme /
- orthogonal test
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虾青素(astaxanthin)是具有超强抗氧化活性的类胡萝卜素，其脂溶性自由基淬灭活力是β-胡萝卜素的10倍、维生素E的100倍[1-2]，同时具有抵御紫外线、抗肿瘤、提高免疫力、增强神经连通和改善生育等作用[3-7]，在食品添加剂、水产养殖、化妆品及保健品等方面具有广阔的应用前景[8-9]。鉴于虾青素的诸多功能和用途，其已成为一种极受欢迎的产品，因而做好提取是保证应用的前提。中国具有大量的甲壳类废弃资源，虾青素在甲壳类水产品中主要以酯化形式存在，游离形式比例较少，仅占15%左右[10]。用有机溶剂直接提取虾青素的萃取率较低，酯化形式的存在增加了虾青素的提取难度，内源酶可通过酶解作用裂解酯键增加虾青素的萃取率。内源酶主要位于虾头中，是虾消化系统中不可或缺的重要成分。虾头内源酶以蛋白酶、酯酶、几丁质酶和多酚氧化酶为主，种类多达几十种[11]，具有解离虾青素的作用，其中以蛋白酶的活性最高[12]。以虾仁加工的下脚料为原料，内源酶酶解后，选取影响酶解效果的主要因素，确定最佳酶解条件, 而最佳酶解条件的确定，是保证虾壳资源中虾青素高值开发利用的有效途径之一。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
虾壳，鲜活凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)购自广州华润万家超市；乙酸乙酯(分析纯)；虾青素标准品(纯度95.8%，德国Dr)；乙腈、甲醇、四氢呋喃(色谱纯)；脂肪酶(5 000 U·g-1，深圳市数康威生物科技有限公司出品)。
1.2 试验仪器
TD5自动平衡离心机(长沙英泰仪器有限责任公司出品)；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司出品)；DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司出品)；PHB-3便携式pH计(上海三信仪表厂出品)；MMV-1000W震荡仪(托普仪器有限公司出品)；Transsonic TI-H 10超声波清洗仪(德国Elma公司出品)；N-1000旋转蒸发仪(日本EYELA出品)；SUPELCO固相萃取装置(美国产)；CNW C18固相萃取柱(上海安谱出品)。
1.3 工艺流程
冷冻虾壳→绞碎→分装→冷冻保存→取样→调pH→恒温水浴酶解→灭活→萃取→净化→上机检测
1.4 样品处理
样品的处理及检测参照文献中虾青素的提取和检测方法[13-15]，略作修改。取冷冻虾壳于绞肉机中快速绞碎，分装成若干个小袋，；置于-18 ℃的冰箱中冷冻保存，现取现用。取5 g虾壳在适当的条件下酶解一定的时间灭活后，再加入一定量的乙酸乙酯。具体操作是将其超声处理(35 kHz)30 min，再震荡15 min，离心(4 500 r·min-1，5 min)，收集上清液，向料渣中加入提取剂，重复操作2次，合并所得上清液，60 ℃减压蒸馏，可得虾青素粗提品。甲醇复溶蒸馏残留物，CNW C18固相萃取柱净化处理后，过0.22 μm滤膜后依照色谱检测条件进行检测。
净化。取5 mL甲醇活化CNW C18固相萃取柱，然后转移2 mL甲醇虾青素溶液至C18柱中，用10 mL甲醇洗脱，分4次添加到柱中，调节流速，使其以3 mL·min-1的流速流出，收集全部洗脱液，60 ℃减压蒸干。
1.5 色谱检测
检测条件。色谱柱为GraceSmart RP-18 5u，250 mm×4.6 mm；id.5 μm；柱温30 ℃；流动相V(甲醇): V(乙腈)=75:25，流速1.0 mL·min-1；检测波长476 nm；进样量20 μL。
1.6 内源酶酶解试验
酶解反应条件温和，对虾青素破坏小，是提取虾青素最有前途的方法之一。通过改变试验因素及其水平，可以确定最佳单因素水平。结合单因素试验结果，设计正交试验，优化提取工艺，按照表 1各因素水平进行L9(34)正交试验。
表 1 内源酶酶解因素水平表[L9(34)]Table 1. Factors and levels of[L9(34)] orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes水平
level因素 factor A: pH B: 温度/℃ C: 时间/h 1 4.0 40 1.0 2 5.0 45 1.5 3 6.0 50 2.0 1.7 脂肪酶与内源酶酶解效果的比较
在虾壳原料中添加质量比为2%脂肪酶进行酶解反应，与空白比较脂肪酶对提取效果的影响。
1.8 虾青素萃取率的计算公式
样品中虾青素的萃取率以液相测量值转化而来，即：
$$ X=A \times \frac{V}{m} \times \frac{V_2}{V_1} $$ 式中X为样品中虾青素的萃取率(μg·g-1)；A为萃取液中虾青素的质量浓度(μg·mL-1)；m为样品的称取量(g)；V为初次定容体积(mL)；V1为过固相萃取柱溶液的体积(mL)；V2为固相萃取柱洗脱液蒸干后复溶的体积(mL)。
2. 结果与分析
2.1 酶解单因素试验
2.1.1 酶解最适温度的确定
称取5 g绞碎的冷冻虾壳，用磷酸缓冲液调pH，保持其他因素不变，分别改变酶解温度进行处理。所选温度为30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和60 ℃共6个梯度作为因素水平，酶解1.0 h。80 ℃灭活后加入一定量的乙酸乙酯萃取，萃取液净化过膜后进行色谱检测。随着温度的升高，虾青素的萃取率逐渐提高，但温度达40 ℃以上时萃取率不再增加(图 1)。这可能由于温度的升高使酶活性开始降低，不利于内源酶的酶解，使虾青素的萃取率下降，也可能由于温度过高使内源酶活性丧失，游离虾青素释放难度加大。因此，内源酶解的最适温度约为40 ℃。
2.1.2 酶解最适pH的确定
称取5 g绞碎的冷冻虾壳，用磷酸缓冲液调pH为3.0、4.0、5.0、5.5、6.5和8.0，40 ℃温浴酶解l.0 h。80 ℃灭活后加入一定量的乙酸乙酯萃取，萃取液净化过膜后进行色谱检测，以确定酶解最适pH。由于虾青素对碱不稳定，酶解pH的选取范围为4.0~8.0。pH在4.0~6.0时效果较好，当pH大于6.0后酶解效果迅速下降(图 2)，pH过高可能会破坏虾青素的结构。因而虾青素酶解的最适pH为4.0~6.0附近。
2.1.3 酶解时间的确定
称取5 g绞碎的虾壳，用磷酸缓冲液调pH为6.0，设定温浴温度为40 ℃。在0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h进行酶解，加入一定量的乙酸乙酯萃取，萃取液净化过膜后进行色谱检测。在酶解的初期，随着酶解过程的进行，虾壳中虾青素萃取率逐渐上升，当酶解时间达2.0 h后虾青素萃取率开始下降(图 3)。这主要是因为随着反应的进行，酶解pH发生了变化，使部分酶活力降低，加上酶解产物反馈抑制作用等因素，使虾青素在萃取液中不稳定而降解。因此，内源酶酶解最佳时间为2.0 h。
2.2 正交试验结果与分析
为了确定最佳酶解条件，选择酶解时间、酶解温度和酶解pH这3个因素分别采用3个水平进行正交试验，对内源酶的酶解条件优化。正交试验的酶解温度选取40 ℃、45 ℃和50 ℃；酶解pH选取4.0、5.0和6.0；酶解时间选取1.0 h、1.5 h和2.0 h。试验分别以乙酸乙酯为提取剂，以原料中虾青素的萃取率作为考核指标，其正交试验L9(34)结果见表 2，方差分析见表 3。在试验水平变化范围内，时间对内源酶解的影响显著，温度和酶解pH对酶解效果有一定的影响但不显著。正交表的极差分析显示，内源酶酶解虾壳虾青素的最佳工艺条件为A1B3C2，即酶解pH 4.0，酶解温度50 ℃，酶解时间1.5 h。因素主次为C>B>A，即酶解时间为主要因素，其次为酶解温度和酶解pH。鉴于正交试验表中已包括A1B3C2试验，直接从正交表即可看到最佳条件，而该结果也是该组试验中的最佳值。通过对比试验可知，未对样品进行酶解处理时，虾青素的萃取率约25 μg·g-1，酶解处理后约32.16 μg·g-1，可提高约28%。可见，酶解处理对提高虾青素萃取率具有较好的促进作用。
表 2 L9(34)内源酶酶解正交试验表Table 2. L9(34) orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes试验号
trial No.因素 factor 萃取率/μg·g-1
yieldA: pH B: 温度/℃ C: 时间/h 1 1 1 1 26.68 2 2 2 2 32.06 3 3 3 3 28.29 4 1 2 3 28.43 5 2 3 1 28.28 6 3 1 2 31.24 7 1 3 2 32.16 8 2 1 3 26.90 9 3 2 1 27.61 k1 29.09 28.28 27.53 k2 29.08 29.37 31.82 k3 29.05 29.58 27.88 R 0.04 1.30 4.30 表 3 L9(34)内源酶解正交表方差分析Table 3. L9(34) analysis of orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes因素
factor偏差平方和
sum of square of deviations自由度
degree of freedomF比
ratio of FF临界值
critical value of F显著性
significancepH 0 2 0 6.94 温度 temperature 2.93 2 2.00 6.94 时间 time 34.16 2 23.28 6.94 * 误差 error 2.94 4 注：*.水平显著(P < 0.05)
Note: *. significant difference(P < 0.05)2.3 脂肪酶对虾青素的提取效果
向含有内源酶的虾壳中添加脂肪酶，以探究脂肪酶对虾青素提取效果的影响。脂肪酶活力约5 000 U·g-1，活力较高，添加量约占原料质量2%(表 4)。脂肪酶对虾青素的提取效果并无促进作用，因而脂肪酶不适宜用作虾青素的辅助提取酶。相对标准偏差较低，各水平稳定性较好，试验数据可靠。
表 4 脂肪酶对虾青素提取效果的影响Table 4. Effect of lipase on astaxanthin extraction脂肪酶量
addition of lipasepH 温度/℃
temperature时间/h
time萃取率/μg·g-1
yield平均萃取率/μg·g-1
average yield相对标准偏差/%
RSD0 4.0 50 1.5 32.85 0 4.0 50 1.5 33.23 32.98 0.22 0 4.0 50 1.5 32.86 2% 4.0 50 1.5 30.62 2% 4.0 50 1.5 34.36 32.63 1.89 2% 4.0 50 1.5 32.91 3. 讨论
3.1 自溶条件的选择
顾晨光和王建军[12]报道，虾体内存在着活性很高的水解酶系即内源酶，这些酶有60%集中在头部。下脚料中的虾头占有很大的比例，内源酶丰富。内源酶来源于原料本身，具有方便易得、活性高的特点，能促使原料自溶。章超桦等[16]报道紫外线对虾头自溶具有较好的促进作用，但由于虾青素对防止紫外线的脂质过氧化具有较好的作用[17]，这种作用是以自我降解为代价的，因而虾青素在紫外照射下很不稳定，紫外照射快速自溶技术不适用于虾青素的解离，故自溶酶解时仅选用温度、pH和酶解时间作为虾青素的酶解影响条件。
3.2 脂肪酶对虾青素提取效果的影响
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，脂肪酶在水-有机溶剂双向体系中催化油脂水解，则可大大提高油脂水解度[18]。该试验为了使处理条件和内源酶解条件一致，在磷酸缓冲液中加入了脂肪酶，通过仅用内源酶提取结果比较可知，脂肪酶对虾青素的提取影响不显著。原因可能是该缓冲液环境不适合脂肪酶活性的表达，也可能是脂肪酶对虾青素的酶解不起作用，具体情况有待进一步研究。
3.3 不同提取条件对虾青素提取效果的影响
赵仪等[19]以总类胡萝卜素的萃取率作为评价指标，得出木瓜蛋白酶处理组的萃取率比仅用有机溶剂提取提高19.88%。内源酶解萃取率比仅用有机试剂提取提高28%，可见内源酶解效果较好。笔者在虾青素有机提取工艺的基础上，进行内源酶酶解处理，得出温度50 ℃、pH 4.0、酶解1.5 h时，虾青素提取效果最佳。温度、pH和酶解时间是影响虾青素提取效果的主要因素。温度太高或太低都会影响虾壳中内源酶的活性，只有温度适宜才利于内源酶中蛋白酶活性的表达。正交结果表明，虾青素的萃取率在约50 ℃时最佳，该结果与钱飞等[20]的研究结果大致相符。pH影响提取效果的原因是蛋白酶中以碱性胰蛋白酶和酸性胃蛋白酶活性最高[20]，在弱碱性条件下，碱性蛋白酶活性较高，但虾青素在弱碱性条件下易分解，所以虾青素萃取率有随碱性环境的提高而降低的趋势；同样虾青素在酸性条件下亦不稳定[21]。pH的单因素及正交试验结果表明，pH 4.0时虾青素的萃取率相对较高，pH 5.0时虾青素的萃取率较pH 4.0和pH 6.0低，钱飞等[20]对木瓜蛋白酶水解克氏原螯虾(Procambarus clarkia)虾壳提取虾青素的研究中也出现pH为5.0时类胡萝卜素萃取率较低的现象。这可能是由于该pH是两者发挥作用酶的等电点，不利于酶与底物的结合，具体原因有待研究。当然，上述2种因素的影响都是在一定的时间基础上才得以体现的。由正交试验的结果可知，酶解时间较短时，酶解作用不充分，酶解效果不好，酶解时间在约1.5 h时达到较佳值。当酶解时间大于1.5 h时，随着酶解时间的延长虾青素的提取效果逐渐下降，这可能是由于虾青素在这种条件下不稳定，逐渐分解。
通过内源酶对蛋白的酶解试验可知，内源酶具有促进虾青素与结合蛋白解离的作用。该试验仅从影响酶活性的几个因素考虑酶解效果，其他增加内源酶酶解的因素还有待于进一步的探讨。
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表 1 内源酶酶解因素水平表[L9(34)]
Table 1 Factors and levels of[L9(34)] orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
水平
level因素 factor A: pH B: 温度/℃ C: 时间/h 1 4.0 40 1.0 2 5.0 45 1.5 3 6.0 50 2.0 
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表 2 L9(34)内源酶酶解正交试验表
Table 2 L9(34) orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
试验号
trial No.因素 factor 萃取率/μg·g-1
yieldA: pH B: 温度/℃ C: 时间/h 1 1 1 1 26.68 2 2 2 2 32.06 3 3 3 3 28.29 4 1 2 3 28.43 5 2 3 1 28.28 6 3 1 2 31.24 7 1 3 2 32.16 8 2 1 3 26.90 9 3 2 1 27.61 k1 29.09 28.28 27.53 k2 29.08 29.37 31.82 k3 29.05 29.58 27.88 R 0.04 1.30 4.30
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表 3 L9(34)内源酶解正交表方差分析
Table 3 L9(34) analysis of orthogonal test of hydrolysis by endogenous enzymes
因素
factor偏差平方和
sum of square of deviations自由度
degree of freedomF比
ratio of FF临界值
critical value of F显著性
significancepH 0 2 0 6.94 温度 temperature 2.93 2 2.00 6.94 时间 time 34.16 2 23.28 6.94 * 误差 error 2.94 4 注：*.水平显著(P < 0.05)
Note: *. significant difference(P < 0.05)
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表 4 脂肪酶对虾青素提取效果的影响
Table 4 Effect of lipase on astaxanthin extraction
脂肪酶量
addition of lipasepH 温度/℃
temperature时间/h
time萃取率/μg·g-1
yield平均萃取率/μg·g-1
average yield相对标准偏差/%
RSD0 4.0 50 1.5 32.85 0 4.0 50 1.5 33.23 32.98 0.22 0 4.0 50 1.5 32.86 2% 4.0 50 1.5 30.62 2% 4.0 50 1.5 34.36 32.63 1.89 2% 4.0 50 1.5 32.91
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