Effect of di-n-butyl phthalate (DBP) on biochemistry indicators of Thryssa hamiltonii
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摘要:
采用海洋中上层鱼类汉氏棱鳀(Thryssa hamiltonii)为试验生物，研究了邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对海洋鱼类的毒性。结果显示，DBP对汉氏棱鳀的24 h、48 h和96 h的半致死质量浓度(LC50)分别为3.75 mg ·L-1、1.52 mg·L-1和0.94 mg·L-1，安全质量浓度为0.07 mg·L-1。DBP对汉氏棱鳀内脏团中的超氧化物歧化酶(SOD)活性在第24小时表现为0.07 mg·L-1浓度组受诱导而0.55 mg·L-1浓度组被抑制, 而第72小时0.07 mg·L-1浓度组被抑制而0.14 mg·L-1组被诱导升高，其他浓度组无显著变化；脑中各浓度组则表现为第24小时受到明显的诱导而到第72小时被抑制。DBP胁迫下仅第24小时引起了2组织细胞氧化损伤，细胞脂质过氧化物(MDA)的质量摩尔浓度都明显升高。内脏团中的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性表现为0.07 mg·L-1浓度组受诱导升高而其他浓度组被抑制；而脑中0.55 mg·L-1浓度组为先受诱导升高后被抑制降低，其他浓度组则一直表现为受诱导升高。结果表明，DBP在此试验质量浓度下对汉氏棱鳀产生了明显的毒性作用，对海洋生物存在危害，应对其海洋环境生态风险加以关注。
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关键词:
- 汉氏棱鳀 /
- 邻苯二甲酸二丁酯(DBP) /
- 超氧化物歧化酶(SOD) /
- 细胞脂质过氧化物(MDA) /
- 乙酰胆碱酯酶(AChE)
Abstract:Taking Thryssa hamiltonii as sample, we studied the toxicity of di-n-butyl phthalate (DBP) on marine epipelagic organism. The results show that the 24 h, 48 h and 96 h LC50 value of DBP on T.hamiltonii is 3.75 mg·L-1, 1.52 mg·L-1 and 0.94 mg·L-1, respectively. The safe concentration (SC) of DBP on T.hamiltonii is 0.07 mg·L-1. Compared with the control, at 24th hour, the superoxide dismutase (SOD) activity of visceral mass is induced at 0.07 mg·L-1 and inhibited at 0.55 mg·L-1; while at 72nd hour it is inhibited at 0.07 mg·L-1 and induced at 0.14 mg·L-1, and there is no significant difference among the other groups. The SOD activity in brain increases at 24th hour and reduces at 72nd hour. Under DBP exposure, the malondialdehyde (MDA) content obviously increases at 24th hour in those 2 tissues. The acetylcholinesterase (AChE) activity is induced at 0.07 mg·L-1 and inhibited at high dose in visceral mass; as for the brain, it is induced first at 0.55 mg·L-1 and inhibited afterwards, but it is induced in the other groups all the time. Therefore, DBP, which has obvious toxic effects on T.hamiltonii, is harmful to marine life, and it should be paid attention to its potential ecological risks on marine environment.
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邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate，DBP)广泛应用于塑料袋、食品袋、血液储存袋、静脉内导管、儿童玩具以及一些药物和杀虫剂中[1]，具有致癌、致畸性和致突变性并具有很强的生殖毒性，是一种持续性有机污染物。随着时间的推移，在适当的条件下，DBP会逐渐地从塑料中释放出来进入环境[2]。目前，DBP已被美国国家环保局列为优先控制的有毒污染物之一，中国也将其列入水中优先控制污染物名单中。目前中国许多水体中都检出了DBP，部分地区污染严重，ρ (DBP)为0.157 ~ 1 390.000 μg·L-1[3-5]。
国内外对DBP的毒性研究从20世纪70年代开始广泛受到重视，目前DBP对水生动植物的毒性作用均有报道，主要涉及DBP对藻类、浮游生物以及鱼类的繁殖、发育的影响和DBP的富集及降解。有研究表明，DBP对藻类生长具有抑制作用并呈现明显的剂量-效应关系[6]。LEE等[7]研究了DBP对非洲爪蟾(Xenopus laevis)生精功能的影响，发现低浓度DBP能显著降低精子产量。李文英等[8]研究了不同浓度DBP对斑马鱼(Brachydanio rerio)肝脏、鳃中的超氧化物歧化酶(SOD)和ATPase活性的影响。PATYNA等[9]报道低浓度DBP持续曝露导致日本鳉(Oryzias latipes)子代繁殖力明显下降。
由于DBP正辛醇/水分配系数Kow较高，一般在水体表层富集量较大，因此，生活于水体上层的生物极易受到DBP污染。汉氏棱鳀(Thryssa hamiltonii)属于中上层鱼类，对海洋生物多样性及中上层渔业资源恢复起着越来越重要的作用，目前其不断退化的资源状况已经引起了许多研究者的关注。该研究选择汉氏棱鳀这种典型的上层海洋生物作为研究对象，研究DBP对汉氏棱鳀生化指标的影响，分析探讨DBP对上层海洋鱼类的毒性效应，为海洋环境中邻苯二甲酸之类化合物(PAEs)的生态毒理研究提供科学参考资料。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
汉氏棱鳀鱼苗购自海南陵水县新村港。DBP为分析纯(广州化学试剂厂出品)，以丙酮(分析纯)为助溶剂。酶活性、细胞脂质过氧化物(MDA)质量摩尔浓度及蛋白测试试剂盒为南京建成生物工程研究所出品。试验过程用水取自育苗场附近海水，经沉淀池沉淀和砂滤后待用。反应液吸光值测定用UV-7504单光束紫外可见分光光度计(江苏省常州市诺基仪器有限公司出品)。
1.2 试验方法
1.2.1 毒性试验
汉氏棱鳀幼鱼，体长(36±5)mm，体质量(1.87±0.94)g，在实验室内暂养7 d后选取健康活泼个体进行试验。试验期间海水pH 7.7±0.1，盐度36±1，温度(26.6±0.8)℃。试验过程中每天定时以鱼体质量3%投喂饲料，并昼夜充气。急性毒性试验采用静水法生物测试，根据预试验结果按对数间距设4个质量浓度组(0.125 mg·L-1、0.250 mg·L-1、0.500 mg·L-1、2.000 mg·L-1和8.000 mg·L-1)和1个空白对照。每组10尾鱼，设2个平行。试验开始后6 h作连续观察，之后每12 h定期观察，记录幼鱼在第12、24、48、72和96小时的活动和死亡情况，并及时捞出死亡个体。
根据急性毒性试验结果设置0.07 mg·L-1、0.14 mg·L-1、0.28 mg·L-1和0.55 mg·L-14个浓度组和1个空白对照组。每个浓度组放25尾鱼，每48 h完全更换1次试验用水，昼夜充气，每天定时投喂饲料。
1.2.2 毒性分级
DBP对汉氏棱鳀幼鱼安全浓度(SC)计算采用公式：SC (mg·L-1) =48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 LC50)2。根据鱼类急性中毒试验的96 h半致死质量浓度(LC50)有毒物质对鱼类的毒性作用标准分为4级[10](表 1)。
表 1 鱼类急性毒性实验毒性分级标准Table 1. Grading of fish acute toxicity test鱼起始LC50/mg·L-1 initial LC50 for fish < 1 1~100 100~1 000 1 000~10 000 >10 000 毒性分级grading of toxicity 剧毒 高毒 中等毒性 低毒 微毒(无毒) 1.2.3 酶活及MDA质量摩尔浓度测定
试验开始后第24小时和第72小时从每组各取5尾鱼，洁净海水冲洗后置于冰盘内，快速解剖并分别取其内脏团和脑组织，用0.86%预冷生理盐水淋洗、滤纸吸附后用预冷的Tris-HC1缓冲液(0.01 mol·L-1Tris，0.25 mol·L-1蔗糖，0.1 mmol·L-1 EDTA，pH 7.5)匀浆，6 000 r·min-1离心10 min后，立即取上清液进行蛋白质含量和酶活力测定。内脏团的匀浆比例为1/4、脑的匀浆比例为1/9[组织质量(g)/缓冲液体积(mL)]。
酶活性测定方法按照南京建成生物工程研究所蛋白质试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒和乙酰胆碱酯酶(AChE)试剂盒的使用说明操作。
2. 结果
2.1 DBP对汉氏棱鳀的急性毒性
DBP对汉氏棱鳀的24 h、48 h和96 h的LC50分别为3.75 mg·L-1、1.52 mg·L-1和0.94 mg·L-1(表 2)，故可算出DBP对汉氏棱鳀的安全质量浓度为0.07 mg·L-1。根据鱼类急性毒性试验毒性分级标准DBP对汉氏棱鳀为剧毒。
表 2 DBP对汉氏棱鳀的急性LC50值及95% 置信区间Table 2. LC50 value and 95% confidence interval of DBP to T.hamiltonii曝露时间/h exposure time 回归方程regression equation 相关系数(R2) correlation coefficient 半致死质量浓度/mg·L-1 LC50 95% 置信度/mg·L-1 95% confidence interval 24 y= 4.74+0.92x 0.968 9 3.75 2.00~11.00 48 y= 4.83+0.95x 0.987 7 1.52 0.90~3.10 96 y= 5.02+0.90x 0.996 2 0.94 0.54~1.78 2.2 DBP对汉氏棱鳀SOD活性的影响
在DBP胁迫下，汉氏棱鳀内脏团和脑组织内的SOD活性都受到了明显的影响(图 1-a)。在DBP胁迫下与对照组相比，汉氏棱鳀内脏团在第24小时0.07 mg·L-1浓度组SOD活性明显升高，0.55 mg·L-1浓度组受抑制明显降低，中间2个浓度组与对照组呈显著差异；第72小时表现为0.07 mg·L-1浓度组被显著抑制而0.14 mg·L-1浓度组极显著升高，而0.28 mg·L-1和0.55 mg·L-1浓度组无显著变化。脑组织中的SOD在DBP胁迫下变化十分明显。在第24小时各浓度组SOD活性都极显著升高，而第72小时除0.28 mg·L-1浓度组降低不明显外其他浓度组都表现为受到极显著的抑制而降低。可见，DBP胁迫下汉氏棱鳀脑组织中的SOD活性变化较内脏团明显，且时间变化也十分明显。
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图 1 DBP对汉氏棱鳀内脏团和脑的SOD活性(a)、MDA质量摩尔浓度(b)和AChE活性(c)的影响*. 与对照组相比P < 0.05；* *.P < 0.01Figure 1. Effect of DBP on SOD activity(a), MDA content (b) and AChE activity (c) in visceral mass and brain of T.hamiltonii*.compared with the control P < 0.05;* *.P < 0.012.3 DBP对汉氏棱鳀MDA质量摩尔浓度的影响
DBP胁迫对汉氏棱鳀内脏团和脑组织中b(MDA)的影响见图 1-b。与对照相比，DBP胁迫下汉氏棱鳀内脏团中的b (MDA)在第24小时除0.07 mg·L-1浓度组外其他浓度组都显著升高；而第72小时b (MDA)在各浓度组中都没有受到诱导。脑组织中的b (MDA)在第24小时都极显著升高，约为对照组2倍；在第72小时仅0.14 mg·L-1浓度组的b (MDA)显著升高。
2.4 DBP对汉氏棱鳀AChE的影响
DBP胁迫对汉氏棱鳀AChE活性的影响十分显著(图 1-c)。在DBP胁迫下，汉氏棱鳀内脏团中的AChE活性表现为第24小时各浓度组与对照组都存在明显的差异(P < 0.05)，其中0.07 mg·L-1浓度组受诱导升高最明显，其后依次是0.14 mg·L-1和0.28 mg·L-1浓度组，而0.55 mg·L-1浓度组表现为被抑制，且极显著低于对照组(P < 0.01)；第72小时与对照组相比，仅0.07 mg·L-1浓度组受诱导而极显著升高(P < 0.01)，而0.14 mg·L-1、0.28 mg·L-1和0.55 mg·L-1浓度组为被显著抑制(P < 0.05)。脑组织中的AChE活性第24小时与对照组相比都极显著升高(P < 0.01)，第72小时除最高浓度组0.55 mg·L-1受到极显著的抑制外，其他浓度组仍表现为受到极显著的抑制(P < 0.01)。可见，DBP胁迫下汉氏棱鳀内脏团和脑组织中的AChE活性的变化表现出明显的剂量-时间效应。
3. 讨论
3.1 DBP对汉氏棱鳀的急性毒性
与其他有毒物质对水生生物的急性毒性相比，DBP的急性毒性很低，急性毒性值一般都小于10 mg·L-1。已有的研究中，DBP对斑马鱼的96 h LC50为8.51 mg·L-1[8]，对黑头呆鱼(Pimephales promelas)的96 h LC50为1.30 mg·L-1，而对太阳鱼(Lepomis macrochirus)的96 h LC50为0.73 mg·L-1[11]。该研究中DBP对汉氏棱鳀的96 h LC50为0.94 mg·L-1，安全质量浓度为0.07 mg·L-1。可见DBP对汉氏棱鳀的急性毒性与其他的鱼类相比属较高。
3.2 DBP对汉氏棱鳀生化指标的影响
抗氧化防御体系是生物体中重要的氧自由基(O2--、H2O2、·OH)清除系统。其SOD是该系统中一个重要的金属酶，能够催化O2--发生歧化反应生成H2O2和O2。目前的研究已证实，水生生物体内的SOD活性会在污染物胁迫下发生变化。卢彤岩等[12]研究表明达氟沙星对施氏鲟(Acipenser schrenckii)肝脏SOD活性具有明显的诱导作用。此研究中DBP胁迫下汉氏棱鳀内脏团SOD活性在第24小时表现为0.07 mg·L-1浓度组受诱导而0.55 mg·L-1浓度组被抑制，而第72小时0.07 mg· L-1浓度组被抑制而0.14 mg·L-1浓度组被诱导升高，其他浓度组无显著变化；而脑中的则表现为各浓度DBP胁迫下第24小时受到明显的诱导而在第72小时被抑制。可见DBP胁迫对汉氏棱鳀SOD活性的影响十分明显，而脑组织对DBP污染的响应极其明显；但也可看到不同质量浓度DBP对汉氏棱鳀的影响差异不大。丁爱侠等[13]研究三唑磷对日本
AChE是生物神经传导中一种关键性酶，能降解乙酰胆碱，终止神经递质对后膜的刺激作用，保证神经冲动在突触间正常传导。TORRE等[17]认为鱼在污染水体中其脑组织AChE抑制作用明显，AChE反应灵敏，可以利用AChE长期跟踪监测水体污染状况。此研究中汉氏棱鳀内脏团中的AChE活性表现为0.07 mg·L-1浓度组受诱导升高而其他浓度组被抑制；而脑中0.55 mg·L-1浓度组为先受诱导升高后被抑制降低，其他浓度组则一直表现为受诱导升高。可见汉氏棱鳀AChE对DBP胁迫响应明显，并具有较为显著的时间-剂量效应。SONG等[18]研究中六氯苯胁迫下鲤(Cyprinus carpio)脑组织中的SOD活性和TBARS(硫代巴比妥酸反应产物)都明显升高，而AChE被抑制，脑组织是六氯苯作用的一个靶器官。从此研究可见，汉氏棱鳀脑组织SOD活性、b (MDA)及AChE活性在DBP胁迫下变化都较肝脏的明显，因此，可以考虑深入研究脑组织是否是DBP作用的靶器官。
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图 1 DBP对汉氏棱鳀内脏团和脑的SOD活性(a)、MDA质量摩尔浓度(b)和AChE活性(c)的影响
*. 与对照组相比P < 0.05；* *.P < 0.01
Figure 1. Effect of DBP on SOD activity(a), MDA content (b) and AChE activity (c) in visceral mass and brain of T.hamiltonii
*.compared with the control P < 0.05;* *.P < 0.01
表 1 鱼类急性毒性实验毒性分级标准
Table 1 Grading of fish acute toxicity test
鱼起始LC50/mg·L-1 initial LC50 for fish < 1 1~100 100~1 000 1 000~10 000 >10 000 毒性分级grading of toxicity 剧毒 高毒 中等毒性 低毒 微毒(无毒) 
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表 2 DBP对汉氏棱鳀的急性LC50值及95% 置信区间
Table 2 LC50 value and 95% confidence interval of DBP to T.hamiltonii
曝露时间/h exposure time 回归方程regression equation 相关系数(R2) correlation coefficient 半致死质量浓度/mg·L-1 LC50 95% 置信度/mg·L-1 95% confidence interval 24 y= 4.74+0.92x 0.968 9 3.75 2.00~11.00 48 y= 4.83+0.95x 0.987 7 1.52 0.90~3.10 96 y= 5.02+0.90x 0.996 2 0.94 0.54~1.78
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百度学术
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