HPLC-MS/MS determination of zeranols residues in aquatic products
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摘要:
文章建立用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定水产品中玉米赤霉醇类激素药物残留量的方法。用乙腈提取水产品中6种玉米赤霉醇类药物，正己烷脱脂，氨基固相萃取柱净化。采用电喷雾电离，负离子扫描，选择反应监测模式(SRM)监测，外标法定量。该法对6种玉米赤霉醇类药物标准曲线的线性回归系数均在0.99以上，线性范围0~25 μg·kg-1，方法定量限1.0 μg·kg-1。6种玉米赤霉醇类激素药物回收率75.9%~103.8%，相对标准偏差3.90%~13.5%。该法简单、灵敏，结果可靠，可满足实验室批量样品分析的需求。
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关键词:
- 高效液相色谱-串联质谱法 /
- 玉米赤霉醇 /
- 水产品 /
- 残留
Abstract:We developed a method for determining zeranols residues such as α-zearalanol, β-zearalanol, α-zearalenol, β-zearalenol, zearalanone and zearalenone by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).The samples were extracted with acetonitrile, degreased with hexane and purified with amino solid-phase extraction column. In addition, with electrospray ionization in negative mode, we monitored the samples with selected reaction monitoring (SRM) and quantified them with external standard method. For the 6 zeranols, it shows good linear regression coeffcient in the standard curve (all >0.99); the linear range is 0~25 μg·kg-1; the limit of detection is 1.0 μg·kg-1; the average recovery is 75.9%~103.8%, and the relative standard deviation is 3.90 %~13.5 %. The method, which is simple, sensitive and reliable, can be used to identify and quantify zeranols residues in aquatic products.
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华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)属于热带海水贝类，具有肉质鲜美、营养价值高等优点，自20世纪70年代起，有关其人工育苗和规模化养殖迅速在南方各沿海省份展开，并取得了较好的经济效益，但由于长期养殖，华贵栉孔扇贝也面临种质质量退化的问题，严重影响了该产业的健康发展。目前相关机构已经对其开展了选育研究，并取得了初步成效。数量遗传学作为一种新型研究遗传育种的学科，在水产动物遗传育种中展现了很大的优越性，但将此方法运用于华贵栉孔扇贝良种选育的相关研究尚不多见。该研究在此方向作了初步探索，解决华贵栉孔扇贝养殖产业健康发展的关键所在是建立有效的良种选育方法[3-4]。
三亚崖州湾海区是海南省华贵栉孔扇贝主养区之一，已有5年养殖经历。笔者通过对该海区养殖的华贵栉孔扇贝数量性状的测量和分析，采用多元分析和回归方法，建立形态性状与质量性状间的多元线性回归方程[5]，以期为华贵栉孔扇贝通过数量性状辅助选择育种提供相关理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
受测的华贵栉孔扇贝来自于三亚崖州湾养殖海区，由三亚意源养殖有限公司提供。
1.2 取样和测量方法
2010年3月30日一次性随机选取各年龄阶段526个扇贝标本测量其数量性状。测量前清除其表面附着物。5个形态性状(壳高、壳长、绞合线长、壳厚和贝柱直径)用数显游标卡尺测量(精度为0.02 mm)，6个质量性状(总质量、壳质量、贝柱鲜质量、鲜肉质量、干肉质量和贝柱干质量)用电子天平测量(精度为0.01 g)。鲜肉质量指活体去壳后含水分的质量，干肉质量指将鲜肉放入烘箱去除水分后的质量。
1.3 数据分析方法
测量的数据使用SPSS 13软件进行数据分析，对数据采用t检验，用多元回归分析法，分析5个测量指标[壳高(x1)、壳长(x2)、绞合线长(x3)、壳厚(x4)和总质量(x5)]对扇贝3个经济性状[鲜肉质量(y1)、肉柱鲜质量(y2)和肉柱干质量(y3)]的影响，同时作通径分析。
2. 结果与分析
2.1 各性状的参数分析
华贵栉孔扇贝壳高、壳长、绞合线长、壳厚、贝柱直径、总质量、壳质量、鲜肉质量、贝柱鲜质量、干肉质量和贝柱干质量等11个数量性状的各种参数见表 1。其中不同性状的参数单位有所不同，不能进行性状间比较。变异系数的单位相同，因而可以进行性状间比较。性状的变异系数越大，表明品种相应指标可供选择的范围越大，选择的潜力就越大。11个性状的变异系数由大到小依次为贝柱干质量>干肉质量>贝柱鲜质量>鲜肉质量>总质量>壳质量>贝柱直径>壳厚>绞合线长>壳长>壳高。因此，在华贵栉孔扇贝高产品种培育中对这些性状进行选择时，应首先考虑贝柱干质量，其次是干肉质量、贝柱鲜质量、鲜肉质量、总质量、壳质量、贝柱直径、壳厚、绞合线长和壳长，最后是壳宽。
表 1 各性状的表型统计量(n=526)Table 1. Phenotypic statistics of various quantitative traits参数parameter 壳高/mm SH 壳长/mm SL 绞合线长/mm HL 壳厚/mm ST 贝柱直径/mm CP 总质量/g TW 壳质量/g WWAM 鲜肉质量/g FW 贝柱鲜质量/g CFW 干肉质量/g DFW 贝柱干质量/g DWAM max 76.00 72.30 42.00 26.30 23.10 54.01 29.93 24.74 5.32 3.66 1.30 min 44.10 41.00 21.90 13.10 8.90 10.23 7.28 1.33 0.55 0.40 0.07 mean 60.52 55.57 32.58 18.97 15.83 27.86 17.07 10.79 2.40 1.46 0.53 R 31.90 31.30 20.10 13.20 14.20 43.78 22.65 23.41 4.77 3.26 1.23 SD 5.52 5.44 3.32 2.04 2.46 7.08 4.17 3.29 0.87 0.57 0.22 SE 0.24 0.24 0.14 0.09 0.11 0.31 0.18 0.14 0.04 0.02 0.01 CV 9.12% 9.80% 10.19% 10.77% 15.56% 25.43% 24.42% 30.51% 36.31% 38.99% 42.19% 2.2 5个数量性状的回归分析及通径分析
2.2.1 鲜肉质量
分析5个测量指标[壳高(x1)、壳长(x2)、绞合线长(x3)、壳厚(x4)和总质量(x5)]对扇贝鲜肉质量(y)的影响(表 2)。总质量与鲜肉质量为极显著的正相关(相关系数为0.839 4，P < 0.01)，壳厚与贝柱鲜质量为显著的负相关(相关系数为-0.110 7，0.01 < P < 0.05)。y=1.295-0.033 15x1-0.091 6x4+0.474 9x5，决定系数R2=0.878 563，剩余标准差SSE=1.150 2。
表 2 5个数量性状对鲜肉质量的逐步回归分析Table 2. Stepwise regression analysis between 5 quantitative traits and shell-free weight变量variable 回归系数regression coefficient 标准回归系数standard regression coefficient 偏相关partial correlation t P x1 -0.033 1 -0.055 5 -0.092 8 2.126 9 0.033 9 x4 -0.091 6 -0.056 8 -0.107 4 2.464 6 0.014 0 x5 0.474 9 1.022 5 0.839 4 35.246 5 0.000 0 通径系数反映自变量对依变量的直接影响，总质量对鲜肉质量的影响最为明显，直接系数为1.024 9(表 3)。x5与鲜肉质量的相关系数最大，而x1和x4与鲜肉质量呈负相关，x5与鲜肉质量呈正相关。
表 3 5个数量性状对鲜肉质量的通径分析Table 3. Path analysis between 5 quantitative traits and shell-free weight变量variable 直接系数direct factor 通过x1 by x1 通过x4 by x4 通过x5 by x5 总影响total impact x1 -0.055 5 - -0.037 8 0.822 6 0.729 3 x4 -0.056 8 -0.036 9 - 0.757 1 0.663 4 x5 1.024 9 -0.044 7 -0.042 1 - 0.935 7 2.2.2 贝柱鲜质量
分析5个测量指标[壳高(x1)、壳长(x2)、绞合线长(x3)、壳厚(x4)和总质量(x5)]对扇贝贝柱鲜质量(y)的影响(表 4)，总质量与贝柱鲜质量呈极显著的正相关(相关系数为0.622 9，P < 0.01)，绞合线长与贝柱鲜质量呈极显著的负相关(相关系数为-0.196 6，P < 0.01)。y=-0.168 8+0.027 34x2-0.046 04x3+0.091 4x5，决定系数R2=0.617 847，剩余标准差SSE=0.539 5。
表 4 5个数量性状对贝柱鲜质量的逐步回归分析Table 4. Stepwise regression analysis between 5 quantitative traits and adductor muscle weight变量variable 回归系数regression coefficient 标准回归系数standard regression coefficient 偏相关partial correlation t P x2 0.027 3 0.171 0 0.154 5 3.569 8 0.000 4 x3 -0.046 0 -0.175 7 -0.196 6 4.576 6 0.000 0 x5 0.091 4 0.744 1 0.629 9 18.513 1 0.000 0 从表 5中可以看出，通径系数反映自变量对依变量的直接影响。结果显示，总质量对贝柱鲜质量的影响最为明显，直接系数为0.744 1;x2和x5与贝柱鲜质量呈正相关，x3与贝柱鲜质量呈负相关; x5的总体影响最大(0.775 4)，x2其次(0.596 0)。
表 5 5个数量性状对贝柱鲜质量的通径分析Table 5. Path analysis between 5 quantitative traits and adductor muscle weight变量variable 直接系数direct factor 通过x1 by x1 通过x4 by x4 通过x5 by x5 总影响total impact x2 0.171 0 - -0.124 4 0.549 5 0.596 0 x3 -0.175 7 0.121 1 - 0.402 1 0.347 5 x5 0.744 1 0.126 3 -0.094 9 - 0.775 4 2.2.3 贝柱干质量
分析5个测量指标[壳高(x1)、壳长(x2)、绞合线长(x3)、壳厚(x4)和总质量(x5)]对扇贝贝柱干质量(y)的影响(表 6)。总质量与贝柱干质量为极显著的正相关(相关系数为0.743 0，P < 0.01)，壳长与贝柱干质量为显著的负相关(相关系数为-0.092 2，P < 0.05)，绞合线长与贝柱干质量为极显著的负相关(相关系数为-0.141 1，P < 0.01)。y=0.228 7-0.005 0x2-0.007 8x3+0.029 9x5，决定系数R2=0.664 705，剩余标准差SSE=0.129 1。
表 6 5个数量性状对贝柱干质量的逐步回归分析Table 6. Stepwise regression analysis between 5 quantitative traits and adductor muscle dry weight变量variable 回归系数regression coefficient 标准回归系数standard regression coefficient 偏相关partial correlation t P x2 -0.005 0 -0.123 7 -0.119 9 2.756 7 0.006 0 x3 -0.007 8 -0.117 0 -0.141 1 3.253 9 0.001 2 x5 0.029 9 0.954 0 0.743 0 25.341 1 0.000 0 从表 7可以看出，通径系数反映自变量对依变量的直接影响。结果显示，总质量对贝柱鲜质量的影响最为明显，直接系数为0.954 0。
表 7 5个数量性状对贝柱干质量的通径分析Table 7. Path analysis between 5 quantitative traits and adductor muscle dry weight变量variable 直接系数direct factor 通过x1 by x1 通过x4 by x4 通过x5 by x5 总影响total impact x2 -0.123 7 - -0.082 9 0.704 5 0.497 9 x3 -0.117 0 -0.087 6 - 0.515 5 0.310 9 x5 0.954 0 -0.091 3 -0.063 2 - 0.799 4 x5与贝柱干质量呈正相关，x2和x3与贝柱干质量呈负相关，x5对贝柱干质量产生的影响最为明显。
3. 讨论
3.1 通径分析的运用
性状间的相关系数是进行多元分析的基础，但相关系数是两变量间关系的综合体现，其既包括变量间的直接关系，又包括通过其他变量影响的间接关系。单纯采用性状间的相关系数不能正确表述两性状间的真实关系。通径分析可用于分析多个自变量与变量之间的线性关系，是回归分析的拓展，不仅可以处理较为复杂的变量关系，而且能把性状间相关性分成直接影响和间接影响[6-8]。该研究中华贵栉孔扇贝壳高、壳长、绞合线长、壳厚和总质量与扇贝的鲜肉质量、贝柱鲜质量及贝柱干质量的相关系数均极显著，建立回归方程时将其余几个对经济性状相关系数影响不显著的予以剔除以建立理想的回归方程。
3.2 数量性状的选育
衡量华贵栉孔扇贝生长状况的数量性状一般包括长度(高度)和质量，该研究选取长度和质量2个性状来探讨华贵栉孔扇贝数量性状间的相关性。以相关形态性状和总质量为自变量，对3个主要经济性状的回归相关性极显著。把简单易测的性状作为自变量是符合期望的[9-11]。因此，在华贵栉孔扇贝的遗传育种中把壳长和总质量作为重要生长指标即可。通径分析在水产动物的遗传育种中运用非常广泛[12-16]，如王爱民等[17]对马氏珠母贝(Pinctada martensii)不同地理种群内自繁和种群间杂交子一代形态性状参数进行了相关分析，郑怀平等[18]对近江牡蛎(Ostrea rivularis gould)养殖群体数量性状间的相关性进行了通径分析，喻子牛等[19]对香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)雌雄群体数量性状进行了通径分析。
3.3 选育对加工产业的意义
选育优质的良种对华贵栉孔扇贝加工产业具有相当重要的意义。加工企业需用扇贝的贝柱来加工产品，因而对贝柱的质量格外关注。该研究中对扇贝贝柱鲜质量和贝柱干质量均作了相关分析[20]与通径分析，研究结果显示，总质量对于3个经济性状的正面影响最大。因此，在高产选育时应选择总质量大的品种来进行选育，使获得的优良品种能够产生大的贝柱。
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图 1 6种玉米赤霉醇类激素药物标准品色谱图
1.玉米赤霉烯酮；2.α-玉米赤霉烯醇；3.β-玉米赤霉烯醇；4.玉米赤霉酮；5.α-玉米赤霉醇；6.β-玉米赤霉醇(后图同此)
Figure 1. Chromatogram of 6 zeranols standard solution
1. zearalenone; 2. α-zearalenol; 3. β-zearalenol; 4. zearalanone; 5. α-zearalanol; 6. β-zearalanol (the same case in the following figure)
表 1 HPLC流动相梯度洗脱程序
Table 1 HPLC mobile phase gradients
时间/min
time0.1%甲酸水溶液
0.1% formic acid in waterw(乙腈)/%
acetonitrile流速/μL·min-1
flow rate0 70 30 250 5 70 30 250 8 10 90 250 12 10 90 250 12.1 70 30 250 14 70 30 250 
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表 2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量
Table 2 Optimization parameters of SRM of the analytes
化合物
compounds母离子/(m/z)
parent ion子离子/(m/z)
product ion碰撞能量/eV
collision energy保留时间/min
retention time离子丰度/%
abundance of product ionα-玉米赤霉醇
α-zearalanol321 277*
30322
259.02 20.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol321 277*
30322
258.56 18.5 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol319 275.2*
30124
309.15 26.2 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol319 275*
30124
308.66 10.0 玉米赤霉酮
zearalanone319 275*
20523
299.61 36.2 玉米赤霉烯酮
zearalenone317 175*
27328
219.64 88.6 注：*.定量碎片离子
Note: *.quantitative fragment ion
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表 3 玉米赤霉醇类激素药物回归分析、检出限和定量限
Table 3 Regression analysis, limit of detection and limit of quantitation of zeranols
化合物
compounds线性回归方程
linear regression equation相关系数(R2)
correlation coefficient检出限/μg·kg-1
limit of detection定量限/μg·kg-1
limit of quantitationα-玉米赤霉醇
α-zearalanolY=7.37×102X-7.69×103 0.992 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanolY=5.42×102X-5.07×103 0.990 5 0.5 1.0 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenolY=1.26×102X-2.81×103 0.990 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenolY=7.69×101X-1.96×103 0.992 4 0.5 1.0 玉米赤霉酮
zearalanoneY=1.85×102X-1.64×103 0.996 4 0.5 1.0 玉米赤霉烯酮
zearalenoneY=1.35×102X-2.55×103 0.990 8 0.5 1.0
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表 4 方法的添加回收率和精密度(n=6)
Table 4 Recoveries and precisions of HPLC-MS/MS
化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSD化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSDα-玉米赤霉醇
α-zearalanol1 80.6 9.81 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol1 75.9 11.6 5 88.2 6.22 5 77.7 7.54 10 93.4 5.14 10 82.7 3.90 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol1 77.2 11.3 玉米赤霉酮
zearalenone1 76.5 12.0 5 79.1 7.61 5 78.2 5.57 10 89.3 4.50 10 83.2 4.86 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol1 79.1 13.5 玉米赤霉烯酮
zearalenone1 81.7 9.12 5 82.8 6.45 5 93.2 5.39 10 94.4 5.37 10 103.8 4.92
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