HPLC-MS/MS determination of zeranols residues in aquatic products
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摘要:
文章建立用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定水产品中玉米赤霉醇类激素药物残留量的方法。用乙腈提取水产品中6种玉米赤霉醇类药物,正己烷脱脂,氨基固相萃取柱净化。采用电喷雾电离,负离子扫描,选择反应监测模式(SRM)监测,外标法定量。该法对6种玉米赤霉醇类药物标准曲线的线性回归系数均在0.99以上,线性范围0~25 μg·kg-1,方法定量限1.0 μg·kg-1。6种玉米赤霉醇类激素药物回收率75.9%~103.8%,相对标准偏差3.90%~13.5%。该法简单、灵敏,结果可靠,可满足实验室批量样品分析的需求。
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关键词:
- 高效液相色谱-串联质谱法 /
- 玉米赤霉醇 /
- 水产品 /
- 残留
Abstract:We developed a method for determining zeranols residues such as α-zearalanol, β-zearalanol, α-zearalenol, β-zearalenol, zearalanone and zearalenone by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).The samples were extracted with acetonitrile, degreased with hexane and purified with amino solid-phase extraction column. In addition, with electrospray ionization in negative mode, we monitored the samples with selected reaction monitoring (SRM) and quantified them with external standard method. For the 6 zeranols, it shows good linear regression coeffcient in the standard curve (all >0.99); the linear range is 0~25 μg·kg-1; the limit of detection is 1.0 μg·kg-1; the average recovery is 75.9%~103.8%, and the relative standard deviation is 3.90 %~13.5 %. The method, which is simple, sensitive and reliable, can be used to identify and quantify zeranols residues in aquatic products.
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扁舵鲣(Auxis thazard)为暖水性中上层鱼类,隶属于金枪鱼科,舵鲣属,俗名炮弹、炸弹鱼等,喜集群,游泳速度快,广泛分布于太平洋、印度洋、大西洋的热带和亚热带海区,在中国东海和南海均有分布[1-2]。一直以来,经济价值较高的大型金枪鱼类[黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)、长鳍金枪鱼(T.alalunga)等]资源是人们开发利用的主要对象,导致大型金枪鱼类资源被认为已经充分或过度开发利用[3-6],而小型金枪鱼类(如舵鲣属鱼类等)资源开发仍有较大空间。调查资料显示,青甘金枪鱼(T.tonggol)、巴鲣(Euthynnus affinis)和扁舵鲣3种小型金枪鱼类资源产量2003年~2006年占印度韦拉沃尔流刺网总产量的28%[7],2006年~2010年印度金枪鱼类商业捕捞产量的57%均来自于近岸5种小型金枪鱼类[8]。中国南海扁舵鲣等小型金枪鱼类虽尚未形成独立的商业开发模式,但作为兼补对象,已成为南海灯光作业船只的主要渔获种类[9-11],具有较好的渔业开发前景。
国内外学者已对扁舵鲣开展了大量的研究工作,内容涉及年龄和生长[12-13]、时空分布[14]、网目选择性[15]、生殖和洄游[16]、营养成分[17-18]、种群遗传结构[19]等,但对中国南海海域群体的生物学研究尚未见报道。为此,根据2014年春、秋两季在南海获取的灯光罩网生产调查资料,对性比组成、性腺指数、初次性成熟叉长、胃饱满度等繁殖生物学特征进行了研究,以期了解南海春、秋季扁舵鲣资源的差异及其补充特征和规律,为进一步准确估算其资源量、合理利用该资源以及相关科学研究提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 采样时间和海域
采样共分为2次,第一次采样时间为2014年4月~5月(春季),经纬度范围为9°50′N~20°04′N、112°45′E~114°41′E;第二次为2014年11月(秋季),经纬度范围为18°12′N~20°14′N、108°03′E~112°03′E(图 1)。
1.2 调查船
调查船为广东省电白县博贺渔港的“粤电渔42212”灯光罩网船,钢质,总长49.8 m,型宽7.8 m,型深4.3 m,总吨位492 GT;主机2台,功率分别为372.8 kW和402.7 kW,最大航速11 kn;诱鱼灯500盏,诱鱼电机2台,均为355.6 kW;撑杆长度42 m,沉子纲长310 m,沉子质量1 500 kg,网高100 m,船员11人。
1.3 测定方法和标准
共采集样品364尾带回实验室进行生物学测定。测定内容包括叉长、体质量、纯体质量、性腺成熟度、性腺质量、胃饱满度。叉长用量鱼板测定(精度为1 mm);体质量、纯体质量、性腺质量用天平测定(精度为0.1 g);性腺成熟度参照常用6期划分方法,即Ⅰ~Ⅵ级6期标准;胃饱满度采用5级划分标准,即0级(空胃)和1~4级[20-21]。
1.4 数据处理
1.4.1 叉长与体质量分布
采用频率分布法,以20 mm和100 g为组距,分别对春、秋两季扁舵鲣叉长和体质量进行分析,应用非参数Kolmogorov-Smirnov Z检验分析春、秋季雌、雄个体叉长组成是否具有显著性差异,并应用单因素方差分析春、秋季雌、雄个体大小(叉长、体质量)是否存在显著性差异。
1.4.2 叉长与体质量关系
采用线性回归法,求得扁舵鲣叉长与体质量的关系:
$$ W=a L^b $$ (1) 式中W为体质量(g),L为叉长(mm),a、b为估算参数。
1.4.3 性比
统计雌、雄个体的数量,性比采用雌、雄个体数量之比。利用二项检验分析总体雌、雄性比与1 : 1是否产生显著差异。利用卡方检验分析春、秋两季扁舵鲣各叉长组的性比是否存在显著差异。
1.4.4 性腺指数
采用性腺质量除以纯体质量的方法计算,其公式为:
$$ \mathrm{GSI}=\frac{W_{\mathrm{g}}}{W_{\mathrm{p}}} \times 100 $$ (2) 式中GSI为性腺指数,Wg为性腺质量,Wp为纯体质量。
1.4.5 初次性成熟叉长
采用线性回归法拟合Logistic曲线,推算扁舵鲣的初次性成熟叉长:
$$ P_i=1 /\left[1-\mathrm{e}^{\left(c{+} d l_i\right)}\right] $$ (3) 式中Pi为成熟个体占组内样本的百分比;li为各叉长组组中值(mm);c、d为估算参数;初次性成熟叉长L50%=-c/d。
2. 结果
2.1 叉长和体质量分布
该研究随机采样共获取南海扁舵鲣样本364尾,其中春季265尾,秋季99尾。春季扁舵鲣的叉长范围为145~389 mm(X =271.46,SD=42.49),其中优势叉长为240~300 mm(60.3%)(图 2-a),雌、雄个体平均叉长分别为281.53 mm和279.40 mm;体质量范围为33.4~1 063 g(X =328.62,SD=178.86),其中优势体质量为100~300 g(66.4%),雌、雄个体平均体质量分别为365.99 g和350.75 g(图 3-a)。分析表明,雌、雄个体大小(叉长、体质量)不存在显著差异(ANOVA,P>0.05)。
秋季扁舵鲣的叉长范围为188~322 mm(X=236.06,SD=18.91),其中优势叉长为220~260 mm(77.8%)(图 2-b),雌、雄个体平均叉长分别为235.18 mm和235.79 mm;体质量范围为96~613 g(X=317,SD=64),其中优势体质量组为100~200 g(94%),雌、雄个体平均体质量分别为213 g和218 g(图 3-b)。分析表明,雌、雄个体大小(叉长、体质量)不存在显著差异(ANOVA,P>0.05)。
非参数Kolmogorov-Smirnov Z检验分析表明,春、秋季扁舵鲣叉长分布存在显著差异(P < 0.01),但同季节雌、雄个体叉长分布不存在显著差异(P>0.05)。
2.2 体质量与叉长关系
经幂函数拟合(图 4),春、秋季扁舵鲣体质量与叉长关系分别为:春季WS=3×10-7L3.691 3,R2=0.995 6;秋季WA=5×10-6L3.202,R2=0.987 5;式中WS和WA为体质量(g),L为叉长(mm)。
2.3 性比
春季共测定扁舵鲣265尾,其中雌性101尾,雄性129尾(雌雄不分个体35尾)。雌、雄性比为1∶ 1.28;秋季共测定扁舵鲣99尾,其中雌性38尾,雄性47尾(雌雄不分个体14尾)。雌、雄性比为1∶ 1.24。统计检验显示,调查总体雌、雄性比与1 : 1无显著差异(P>0.05),但各叉长组性比有显著差异(χ2=117.857,P < 0.001)(图 5)。
2.4 性腺成熟度
春季扁舵鲣性腺成熟度各期均有分布,以Ⅰ期和Ⅱ期为主,约占总体的77.7%;Ⅲ期约占20%;Ⅳ~Ⅵ期较少,约占2.3%(图 6)。随着叉长增大,扁舵鲣性腺成熟程度逐渐提升,性成熟最小叉长雌性为272 mm,雄性为279 mm,叉长组281~300 mm雌雄大量成熟,340 mm则可全部发育成熟,在成熟的最小叉长组中,雌性成熟的比例高于雄性,随着叉长增大,雌鱼比例减小,雄鱼比例上升,表明雌性成熟较雄性略快(图 7, 图 8)。秋季渔获扁舵鲣的性腺成熟度全部为Ⅰ期和Ⅱ期,未发现性成熟个体。
2.5 性腺指数和初次性成熟叉长
性腺指数是鱼体性成熟度的一个重要指标,常用于性腺成熟度的研究和初次性成熟体长的确定[13, 22]。图 9显示春季扁舵鲣雌雄个体不同性腺发育阶段的平均GSI。春季Ⅱ期个体平均GSI最低,雌雄个体分别为0.24%和0.17%,雌性个体平均GSI明显高于雄性,而后扁舵鲣卵巢、精巢发育加速,Ⅲ、Ⅳ期个体的平均GSI逐渐升高。雌性个体卵巢发育Ⅳ~Ⅴ期平均GSI迅速升高,Ⅴ~Ⅵ期,鱼体已产卵排精,平均GSI急剧降低;雄性个体精巢发育Ⅳ~Ⅴ期平均GSI有下降趋势,有可能是部分个体未排精退化所致。总体来看,雌性个体平均GSI高于雄性。秋季扁舵鲣由于未发现成熟个体,性腺成熟度只有Ⅰ期和Ⅱ期,所以变化趋势不明显,但雌性个体也明显高于雄性。分析表明,春季扁舵鲣雌雄个体的平均GSI存在显著差异(ANOVA, P<0.05)。
研究显示,春季扁舵鲣渔获群体中性成熟叉长范围为272~389 mm,平均叉长319 mm。经拟合,性成熟与叉长的关系曲线(图 10)为Pi=1/[1+e-(-22.388 3+0.073 5li)],初次性成熟叉长为304.5 mm。
2.6 摄食等级
春季扁舵鲣摄食等级0~4级所占比例分别为35.5%、35.1%、12.4%、6.4%和10.6%;秋季所占比例分别为34.3%、43.4%、5.1%、7.1%和10.1%,摄食等级主要以0级和1级为主。1~4级个体数量有逐步减少趋势。卡方检验表明,不同叉长组的摄食等级存在显著差异(P < 0.001),随着叉长组增大,摄食等级有逐步提高的趋势(图 11)。
扁舵鲣胃含物主要以小型鱼类为主,主要种类有紫色锯鳞鱼(Myrispristis violaceus)、长体圆鲹(Decapterus macrosoma)、高鳍刺尾鱼(Zebrasoma veliferum)、发光鲷(Acropoma japonicum)、游鳍叶鲹(Atule mate)等,另外还有少量头足类及甲壳类等。
3. 讨论
3.1 叉长-体质量关系
叉长-体质量关系通常用于描述鱼类的个体生长规律,以公式W=aLb表达,其中幂指数b值可以用来判断鱼类是否处于等速生长。研究结果显示,春、秋季扁舵鲣叉长-体质量关系分别为WS=3×10-7L3.691 3和WA=5×10-6L3.202,与其他研究所得结果相比,该研究的春季叉长-体质量关系中的b值最大,而秋季所得的b值最小(表 1),春、秋季,扁舵鲣生长均为异速生长。b值的差异可能与摄食、性腺发育程度、产卵期、不同生长阶段等有关[23-24]。黄真理等[24]的研究发现,低龄鱼b值偏小,高龄鱼b值偏大。该研究中秋季扁舵鲣较小型、性腺未发育,可能是其b值相对春季偏小的主要原因。
表 1 不同研究所得的叉长-体质量关系Table 1. Comparison of relationship between fork length and body weight by different studies研究区域
region时间
time渔具
gear叉长-体质量关系
fork length-body weight relationship文献
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3.2 年龄估算
有关南海扁舵鲣年龄与生长的研究尚未见报道,限于条件所致,采用YU等[13]对台湾海峡扁舵鲣的年龄构成进行估算,其生长可用Von Bertanlanffy生长方程表示为L=481.78×(1-e-0.523 0 t+0.334 9)),由此估算该研究中渔获样本的年龄组成。结果显示,春、秋季扁舵鲣平均年龄分别为1.3和1.0(图 12),春季扁舵鲣处于1~2龄的个体最多,占总数的77.0%,而秋季扁舵鲣处于1龄以下的个体最多,占总数的55.6%。
卢振彬等[12]对1981年~1984年4月~9月台湾海峡-福建海域调查显示,扁舵鲣各年龄组叉长范围分别为Ⅰ:245~332 mm、Ⅱ: 322~407 mm、Ⅲ:393~436 mm。该研究结果与之相比,渔获物年龄组成偏小,仅有1龄和未满1龄鱼;叉长范围偏低。造成上述变化的原因可能跟时间跨度、采样季节、渔场差异以及网具差异等有关,还需要进一步的研究验证。
3.3 性腺发育的变化
研究显示[22, 26],随着性腺的发育,从Ⅱ期到Ⅴ期,平均GSI均表现为逐渐升高的趋势,至性腺达到完全成熟的Ⅴ期,性腺质量增加到最大,而性腺发育到Ⅵ期,鱼体因产卵或排精活动的结束,平均GSI急剧降低,该研究结果与其是一致的。但由于春季扁舵鲣Ⅴ期和Ⅵ期的个体较少,秋季更是未发现性成熟样本,所以在一定程度上会影响研究结果。且春、秋两季雌性扁舵鲣的平均GSI都要高于雄性,说明雌性扁舵鲣产卵过程比雄性排精过程需要消耗更多的能量[13, 22, 27]。春季扁舵鲣性腺成熟度各期均有分布,性成熟个体占22.3%,秋季未出现性成熟个体,研究表明春季4月、5月为南海扁舵鲣产卵期,11月扁舵鲣不再产卵,该研究结果与其他研究对扁舵鲣产卵期的认定相一致[16, 28-29]。
采用线性回归法拟合Logistic曲线,推算春、秋季扁舵鲣的初次性成熟叉长。但研究结果显示,只有春季扁舵鲣的性成熟与叉长关系曲线符合Logistic曲线,其初次性成熟叉长为304.5 mm。对比不同海域扁舵鲣的初次性成熟叉长,印度东南海岸[15]雌雄个体分别为328 mm和308 mm,台湾海峡[13]的个体为226.82 mm,该研究结果正好处于两者之间。而秋季扁舵鲣由于未发现性成熟的个体,所以无法计算该时期扁舵鲣的初次性成熟叉长,这需要在今后做进一步的研究。
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表 1 HPLC流动相梯度洗脱程序
Table 1 HPLC mobile phase gradients
时间/min
time0.1%甲酸水溶液
0.1% formic acid in waterw(乙腈)/%
acetonitrile流速/μL·min-1
flow rate0 70 30 250 5 70 30 250 8 10 90 250 12 10 90 250 12.1 70 30 250 14 70 30 250 表 2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量
Table 2 Optimization parameters of SRM of the analytes
化合物
compounds母离子/(m/z)
parent ion子离子/(m/z)
product ion碰撞能量/eV
collision energy保留时间/min
retention time离子丰度/%
abundance of product ionα-玉米赤霉醇
α-zearalanol321 277*
30322
259.02 20.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol321 277*
30322
258.56 18.5 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol319 275.2*
30124
309.15 26.2 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol319 275*
30124
308.66 10.0 玉米赤霉酮
zearalanone319 275*
20523
299.61 36.2 玉米赤霉烯酮
zearalenone317 175*
27328
219.64 88.6 注:*.定量碎片离子
Note: *.quantitative fragment ion表 3 玉米赤霉醇类激素药物回归分析、检出限和定量限
Table 3 Regression analysis, limit of detection and limit of quantitation of zeranols
化合物
compounds线性回归方程
linear regression equation相关系数(R2)
correlation coefficient检出限/μg·kg-1
limit of detection定量限/μg·kg-1
limit of quantitationα-玉米赤霉醇
α-zearalanolY=7.37×102X-7.69×103 0.992 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanolY=5.42×102X-5.07×103 0.990 5 0.5 1.0 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenolY=1.26×102X-2.81×103 0.990 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenolY=7.69×101X-1.96×103 0.992 4 0.5 1.0 玉米赤霉酮
zearalanoneY=1.85×102X-1.64×103 0.996 4 0.5 1.0 玉米赤霉烯酮
zearalenoneY=1.35×102X-2.55×103 0.990 8 0.5 1.0 表 4 方法的添加回收率和精密度(n=6)
Table 4 Recoveries and precisions of HPLC-MS/MS
化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSD化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSDα-玉米赤霉醇
α-zearalanol1 80.6 9.81 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol1 75.9 11.6 5 88.2 6.22 5 77.7 7.54 10 93.4 5.14 10 82.7 3.90 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol1 77.2 11.3 玉米赤霉酮
zearalenone1 76.5 12.0 5 79.1 7.61 5 78.2 5.57 10 89.3 4.50 10 83.2 4.86 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol1 79.1 13.5 玉米赤霉烯酮
zearalenone1 81.7 9.12 5 82.8 6.45 5 93.2 5.39 10 94.4 5.37 10 103.8 4.92 -
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