Optimization of SRAP-PCR system for Portunus trituberculatus based on orthogonal experimental design
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摘要:
相关序列扩增多态性(sequence related amplified polymorphism，SRAP)是一种多态性高的新型分子标记，其扩增结果稳定，容易操作和引物通用性高，在遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建等方面的广泛应用逐渐从植物转移到水产动物中。为了建立三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)SRAP技术体系，文章利用正交设计L16 (45)对三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系的5因素[TaqDNA聚合酶、镁离子(Mg2+)、模板、三磷酸脱氧核苷(dNTPs)和引物]在4个水平上进行优化试验，结果得出各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板(纯度1.75~1.90，质量浓度10~70 ng · μL-1)，Mg2+(1.60~2.00 mmol · L-1)，dNTPs(0.10~0.40 mmol · L-1)，TaqDNA聚合酶(0.50~2.00 U)和引物(0.10~0.40 μmol · L-1)；筛选出各反应因素的最佳水平，建立三疣梭子蟹SRAP-PCR反应的最佳体系(25 μL)为TaqDNA聚合酶0.50 U，Mg2+ 2.20 mmol · L-1，模板DNA 10 ng，dNTPs 0.20 mmol · L-1，引物0.20 μmol · L-1。这一优化体系可望在三疣梭子蟹遗传多样性和性别连锁标记等研究中应用。
Abstract:SRAP is a novel molecular marker with high polymorphism. It is reliable in amplification, easy to operate and has a high universality in primer pairs. SRAP technique has been widely used for studies from plants to aquatic animals in the fields of genetic diversity, germplasm identification, genetic map construction and so on. Based on an orthogonal experimental design, we optimized the five factors of SRAP-PCR amplification system for Portunus trituberculatus (TaqDNA polymerase, Mg2+, template, dNTPs and primer) from four levels. The results show that the effects of these factors on PCR reaction from strong to weak is as follows: template (purity 1.75~1.90, concentration 10~70 ng · μL-1), Mg2+ (1.60~2.00 mmol · L-1), dNTPs (0.10~0.40 mmol · L-1), TaqDNA polymerase (0.50~2.00 U) and primer (0.10~0.40 μmol · L-1).The optimal SRAP-PCR reaction system (25 μL) can be summarized as follows: 0.50 U TaqDNA polymerase, 2.20 mmol · L-1 Mg2+, 10 ng DNA template, 0.20 mmol · L-1 dNTPs and 0.20 μmol · L-1 primer. This optimized system may be helpful in the studies of genetic diversity and sex-linked markers for P.trituberculatus.
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Keywords:
- Portunus trituberculatus /
- SRAP /
- orthogonal design /
- optimization
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大环内酯类抗生素(macrolide antibiotics，MALs)是一类非常重要的抗菌化合物，属于中谱抗生素，广泛地应用于医学和兽医学等领域，对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌及支原体有很强的作用。随着MALs的广泛运用，MALs会通过食物链进入人体、危害消费者的健康。动物性食品如水产品中MALs残留检测方法的研究非常必要，目前有关MALs残留检测方法的研究主要有液相色谱(HPLC)法和液/质联用(HPLC-MS和HPLC-MS/MS)法。其中HPLC法一般配紫外检测器(UVD)[1-3], 包括二极管阵列检测器(DAD)[4-6]或荧光检测器(FLD)[7], 对大环内酯类抗生素的残留进行检测。由于各种MALs的结构特征、理化性质和生物学效应很相似，其中某些MALs[如红霉素(ERM)和竹桃霉素(OLD)]在分子中缺乏特征紫外吸收，所以只用紫外检测器很难进行高灵敏度分析，另外HPLC法存在着干扰大、不能同时检测多种药物的局限性。液/质谱联用法是确证检测类似MALs这样较高分子量和多官能团残留物的较理想方法[8]，该法具有较高的灵敏度和选择性，对液相分离度要求不高，可用于MALs残留的确证分析。相关文献的报道主要集中在畜禽[9-15]、蜂蜜[16-18]和牛奶[19-22]等样品中MALs药物残留的分析，而水产品中MALs残留分析的液质联用法研究鲜有报道。
1. 材料与方法
1.1 仪器与试剂
液质联用仪由Surveyor液相色谱系统和Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra三重四极杆串联质谱(配有电喷雾电离源)构成；Milli-Q去离子发生器(美国Millipore公司出品)；ZZDCH16水浴氮气吹干仪(广州智真生物科技有限公司出品)等。
替米考星(TIL)标准品(纯度为98.5%)、泰乐菌素(TYL)标准品(纯度为99%)、吉他霉素(KIT)标准品(纯度为72%)、螺旋霉素(SPI)标准品(纯度为96%)、OLD标准品(纯度为96.5%)、ERM标准品(纯度为92.2%)、交沙霉素(JOS)标准品(纯度为98%)均购于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。甲醇、乙腈、正己烷、甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司出品)；其他试剂均为分析纯；水为二次蒸馏水。
1.2 试样处理
1.2.1 试样制备
取试样可食部分，用组织捣碎机充分捣碎，使之均匀，分别装入洁净容器中，密封注明标记，于-18 ℃以下冷冻存放备用。
1.2.2 提取与净化
准确称取样品5 g(精确至0.01 g)置于100 mL具塞塑料离心管，加入20 mL乙腈，于旋涡混合器上以2 000 r · min-1振荡1 min，超声5 min，以3 500 r · min-1离心6 min，取上清液转移至另一离心管中，样品残渣再加入15 mL乙腈重复提取1次，合并上清液。将上述乙腈提取液过预先用5 mL乙腈润洗的中性氧化铝柱，提取液过柱后再用5 mL乙腈淋洗柱体，合并于梨形瓶中。向梨形瓶中加入4 mL异丙醇，在40 ℃水浴中旋转蒸发至干(如遇蒸不干的情况，转用氮吹仪吹干)，准确加入2 mL乙腈-0.05 mol · L-1乙酸铵溶液(体积比2 : 8)溶解残渣，再加2 mL乙腈饱和正己烷，洗脱液转移至10 mL离心管中，旋涡10 s后，以3 000 r · min-1离心8 min，取下层清液过0.22 μm滤膜，待测。
1.3 测定
1.3.1 液相色谱条件
色谱柱为MGⅡC18(5 μm，2.0 mm×150 mm)；梯度洗脱的流动相为0.1%甲酸水溶液(A)+乙腈(B)；流速为200 μL ·min-1；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。
1.3.2 串联质谱条件
采用电喷雾(ESI)离子源，正离子(+)扫描方式，选择反应监测(SRM)检测模式。数据采集参数：scan width(m/z)=0.500；scan time(s)＝0.020；电喷雾电压4 000 V；鞘气为氮气，压力36 units；辅助气为氮气，压力7 units；碰撞气为氩气；离子源温度350 ℃；在线切换阀0~7.5 min至废液，7.5~9.5 min进质谱分析，9.5 min至废液。定性离子对、定量离子对、碰撞气能量见表 1。
表 1 7种大环内酯类药物的定性离子对、定量离子对和碰撞能量Table 1. Quality SRM transition, quantity SRM transition and collision energy of 7 macrolides in positive ion mode化合物
compound定性离子对/m/z
quality SRM transition定量离子对/m/z
quantity SRM transition碰撞能量/eV
collision energy竹桃霉素OLD 688.4/158.1 688.4/544.3 688.4/544.3 28 16 红霉素ERM 734.4/158.2 734.4/576.2 734.4/576.2 28 18 吉他霉素KIT 772.4/109.4 772.4/174.3 772.4/174.3 33 30 交沙霉素JOS 828.3/109.4 828.3/174.1 828.3/174.1 35 32 螺旋霉素SPI 843.4/174.2 843.4/142.1 843.4/174.2 36 40 替米考星TIL 869.5/137.7 869.5/696.3 869.5/696.3 41 36 泰乐菌素TYL 916.4/174.2 916.4/772.2 916.4/174.2 36 29 2. 结果与讨论
2.1 流动相及洗脱程序的确定
分离此类药物的流动相一般主要有铵盐-乙腈或甲醇、某酸水溶液-乙腈或甲醇，文献中一般采用的流动相有乙酸铵-乙腈[22-23]、甲酸铵-乙腈[24-25]、乙酸铵-甲醇[12]、甲酸水溶液-乙腈[10, 16, 19, 26]、乙酸水溶液-乙腈[14, 27]、甲酸水溶液-甲醇[28-29]等。试验中比较了甲酸水溶液-甲醇和甲酸水溶液-乙腈2种流动相的分离效果。结果显示，甲酸-乙腈作流动相时的响应值和峰形更好，7种目标物的分离情况良好，故选择甲酸水溶液-乙腈为流动相。
流动相梯度洗脱程序优化(A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈)，使样液中7种MALs分离效率达到最佳。梯度洗脱程序见表 2。
表 2 梯度洗脱程序Table 2. Gradient elution process时间/min
time0.1%甲酸/%
0.1% acetate-acid乙腈/%
acetonitrile0 95 5 3.0 95 5 10.0 5 95 10.1 95 5 16.0 95 5 2.2 质谱条件的优化
用注射针吸取7种MALs混合标准溶液(0.50 μg · mL-1)通过蠕动泵以10 μL · min-1的速度直接注入离子源，在正离子扫描方式下，分别进行一级质谱分析(Q1扫描)、二级质谱分析(子离子扫描)和选择反应监测(SRM)分析，接着分别对碰撞气能量(CE)、电喷雾电压、鞘气压力、辅气压力及离子源温度进行优化，使每种抗生素的分子离子与特征碎片离子(子离子)产生的离子对信号强度达到最大，从中选择每种抗生素的监测子离子对。优化的结果见表 1。7种MALs参考保留时间(min)为OLD 8.57，ERM 8.67，KIT 9.00，JOS 9.25，SPI 8.05，TIL 8.28和TYL 8.74。7种MALs标准物质选择反应监测色谱图见图 1。
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图 1 7种MALs标准物质(10 ng · mL-1)选择反应监测(SRM)色谱图Figure 1. SRM chromatogram of standard reference materials of 7 macrolide antibiotics (10 ng · mL-1)2.3 试样基质效应的消除
基质效应是指在样品测试过程中由于待测物以外的其他物质的存在，直接或间接影响待测物响应的现象。为考察试样基质对7种MALs离子化的影响程度，试验做了2组比对，第1组(Set1)为7种MALs混标用定溶液作为稀释液；第2组(Set2)为7种MALs混标用制备好的空白试样提取液作为稀释液。当基质效应(ME)值等于或接近100时，表明不存在ME的影响；当ME值大于100时，表明存在离子增强作用；当ME值小于100时，表明存在离子抑制作用。
试样基质对某些目标物(尤其是TIL)的离子化有着较强的抑制作用(表 3)。为了在一定程度上消除ME的影响，根据试样制备相应的空白样品提取液作为标准液的稀释溶液，这使得标准品和样品液具有一样的离子化条件。
表 3 不同条件下基质效应的计算结果(n=3)Table 3. Calculation results of matrix effect under different conditions化合物
compound峰面积peak area 基质效应/%
matrix effectSet1 Set2 竹桃霉素OLD 7 332 689 6 948 742 94.8 红霉素ERM 9 182 405 7 038 229 76.6 吉他霉素KIT 1 380 166 1 299 271 94.1 交沙霉素JOS 5 866 797 4 883 207 83.2 螺旋霉素SPI 230 354 156 363 67.9 替米考星TIL 1 668 007 540 286 32.4 泰乐菌素TYL 2 727 157 2 575 583 94.4 2.4 方法的线性范围与检出限、定量限
准确移取适量标准储备液用空白样品提取液分别配成7种MALs质量浓度为1 ng · mL-1、5 ng ·mL-1、10 ng · mL-1、25 ng · mL-1、50 ng · mL-1、75 ng · mL-1和100 ng · mL-1。分别以OLD、ERM、KIT、 JOS、SPI、TIL和TYL的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数(R)。7种MALs标准曲线的线性方程、线性相关系数和检出限数据见表 4。
表 4 线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 4. Linear equation, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantification化合物
compound线性方程
linear equation相关系数(R2)
correlation coefficient检出限/μg·kg-1
LOD定量限/μg·kg-1
LOQ竹桃霉素OLD y=-3 050.63+51 008.5x 0.999 7 1 4 红霉素ERM y=10 592.7+54 086.4x 0.999 4 1 4 吉他霉素KIT y=-3 573.14+13 001.6x 0.999 5 1 4 交沙霉素JOS y=3 628.95+57 449.6x 0.999 7 1 4 螺旋霉素SPI y=848.843+3 085.62x 0.995 3 1 4 替米考星TIL y=6 402.08+12 336.5x 0.996 7 1 4 泰乐菌素TYL y=-2 006.27+24 688.1x 0.999 5 1 4 2.5 方法的回收率和精密度
2.5.1 不同加标水平的回收试验
在确定检测方法后，用不含7种MALs的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)样品在4 μg · kg-1、20 μg ·kg-1和40 μg ·kg-13个水平进行加标试验，其回收率和精密度测定结果见表 5。可知在3个添加水平上7种MALs平均回收率为75.4%~99.1%，相对标准偏差均在15%以内，说明该方法重现性良好。
表 5 凡纳滨对虾样品中添加回收率与精密度试验数据(n=6)Table 5. Recovery and precision of drugs spiked in P.vannamei项目
item加标水平/μg·kg-1
spiked level竹桃霉素
OLD红霉素
ERM吉他霉素
KIT交沙霉素
JOS螺旋霉素
SPI替米考星
TIL泰乐菌素
TYL回收率/% recovery 4 94.6 83.9 81.6 80.0 75.4 78.4 82.2 20 81.5 91.3 78.0 75.9 81.6 88.6 77.7 40 99.1 75.9 95.0 86.7 84.2 76.3 89.2 相对标准偏差/% RSD 4 5.41 10.80 4.82 6.69 7.08 12.90 9.26 20 2.67 2.05 3.79 2.26 7.32 2.05 0.67 40 4.88 5.73 8.17 2.16 10.30 8.23 2.54 2.5.2 不同样品加标试验
为研究方法的适用性，分别选取不含7种MALs的杂色鲍(Haliotis diversicolor)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)、加州鲈(Micropterus salmoides)、锯缘青蟹(Scylla serrata)、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)和罗非鱼(Oreochromis spp.)为测试对象，用该方法在20 μg · kg-1添加水平上进行加标回收率试验，其结果可知7种MALs的平均回收率为75.9%~108%，相对标准偏差在15%以内(表 6)。通过对多种样品进行测定，说明了该方法具有良好的实用性。
表 6 不同水产品中添加回收率与精密度试验数据(n=6)Table 6. Recovery and precision of drugs spiked in different aquatic products% 化合物
compound杂色鲍
H.diversicolor日本鳗鲡
A.japonica加州鲈
M.salmoides锯缘青蟹
S.serrata大黄鱼
P.crocea罗非鱼
M.tilapia回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 回收率 RSD 竹桃霉素OLD 91.2 8.29 96.9 3.58 78.7 4.82 81.9 4.33 83.1 4.15 106.0 6.39 红霉素ERM 97.4 4.04 93.1 6.09 95.2 2.51 80.5 2.55 76.5 8.57 92.9 4.93 吉他霉素KIT 81.8 5.66 91.0 6.53 88.2 4.33 102.0 5.84 96.3 5.33 80.4 6.81 交沙霉素JOS 85.4 4.11 91.4 6.38 92.4 3.15 102.0 12.30 85.1 5.52 87.4 7.63 螺旋霉素SPI 81.4 12.10 82.7 12.70 81.1 6.98 91.8 7.66 85.5 6.68 77.0 5.33 替米考星TIL 77.0 4.97 75.9 8.07 108.0 4.68 79.0 10.70 83.2 10.30 85.3 9.34 泰乐菌素TYL 83.3 4.01 97.0 5.07 87.8 3.42 83.8 6.59 90.8 3.91 84.3 6.47 3. 结论
文章建立了水产品中7种大环内酯类抗生素残留检测的HPLC-MS/MS法，该方法具有操作简单、灵敏度高、应用性好的优点，各项技术指标均能满足国内外检测要求，可用于水产品中7种大环内酯类抗生素残留量的检测。
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图 2 模板浓度与结果均值的关系图
Figure 2. Relationship between template concentration and mean of result
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图 3 Mg2+浓度与结果均值的关系图
Figure 3. Relationship between Mg2+ concentration and mean of result
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图 4 dNTPs浓度与结果均值的关系图
Figure 4. Relationship between dNTPs concentration and mean of result
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图 5 TaqDNA聚合酶量与结果均值的关系图
Figure 5. Relationship between TaqDNA polymerase and mean of result
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图 6 引物浓度与结果均值的关系图
Figure 6. Relationship between primer concentration and mean of result
表 1 PCR反应体系的因素水平
Table 1 Factors and levels of PCR reaction
因素
factors水平(体系终浓度)/levels(final concentration) 1 2 3 4 Mg2+/mmol·L-1 1.60 2.00 2.20 2.40 dNTPs/mmol·L-1 0.10 0.20 0.30 0.40 TaqDNA聚合酶/U TaqDNA polymerase 0.50 1.00 1.50 2.00 引物/μmol·L-1 primer 0.10 0.20 0.30 0.40 模板/ng template 10 30 50 70 
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表 2 PCR反应的因素水平正交试验设计
Table 2 Factors and levels of PCR reaction based on orthogonal experimental design
编号
No.Mg2+
/mmol·L-1dNTPs
/mmol·L-1TaqDNA聚合酶/U
TaqDNA polymerase引物/μmol·L-1
primer模板/ng
template得分score 平均得分
average score1 2 3 1 1.60 0.10 0.50 0.10 10 11 10 10 10.33 2 1.60 0.20 1.00 0.20 30 13 12 11 12.00 3 1.60 0.30 1.50 0.30 50 14 11 10 11.67 4 1.60 0.40 2.00 0.40 70 2 1 2 1.67 5 2.00 0.10 1.00 0.30 70 10 9 9 9.33 6 2.00 0.20 0.50 0.40 50 10 7 14 10.33 7 2.00 0.30 2.00 0.10 30 11 14 10 11.67 8 2.00 0.40 1.50 0.20 10 16 15 14 15.00 9 2.20 0.10 1.50 0.40 30 13 15 13 13.67 10 2.20 0.20 2.00 0.30 10 15 16 14 15.00 11 2.20 0.30 0.50 0.20 70 15 12 13 13.33 12 2.20 0.40 1.00 0.10 50 12 11 12 11.67 13 2.40 0.10 2.00 0.20 50 11 12 11 11.33 14 2.40 0.20 1.50 0.10 70 10 12 12 11.33 15 2.40 0.30 1.00 0.40 10 13 16 16 15.00 16 2.40 0.40 0.50 0.30 30 11 10 10 10.33 T1 35.67 44.67 44.33 45.00 55.33 - - - - T2 46.33 48.67 48.00 51.67 47.67 - - - - T3 53.67 51.67 51.67 46.33 45.00 - - - - T4 48.00 38.67 39.67 40.67 35.67 - - - - t1 8.92 11.17 11.08 11.25 13.83 - - - - t2 11.58 12.17 12.00 12.92 11.92 - - - - t3 13.42 12.92 12.92 11.58 11.25 - - - - t4 12.00 9.67 9.92 10.17 8.92 - - - - R 4.50 3.25 3.00 2.75 4.91 - - - - 注：T1~T4为各水平的平均得分总和；t1~t4分别为T1，T2，T3和T4的平均值Note：T1~T4 represent the sum of average scores of each treatment; t1~t4 represent the mean of T1, T2, T3, T4.
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