Optimization of SRAP-PCR system for Portunus trituberculatus based on orthogonal experimental design
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摘要:
相关序列扩增多态性(sequence related amplified polymorphism，SRAP)是一种多态性高的新型分子标记，其扩增结果稳定，容易操作和引物通用性高，在遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建等方面的广泛应用逐渐从植物转移到水产动物中。为了建立三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)SRAP技术体系，文章利用正交设计L16 (45)对三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系的5因素[TaqDNA聚合酶、镁离子(Mg2+)、模板、三磷酸脱氧核苷(dNTPs)和引物]在4个水平上进行优化试验，结果得出各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板(纯度1.75~1.90，质量浓度10~70 ng · μL-1)，Mg2+(1.60~2.00 mmol · L-1)，dNTPs(0.10~0.40 mmol · L-1)，TaqDNA聚合酶(0.50~2.00 U)和引物(0.10~0.40 μmol · L-1)；筛选出各反应因素的最佳水平，建立三疣梭子蟹SRAP-PCR反应的最佳体系(25 μL)为TaqDNA聚合酶0.50 U，Mg2+ 2.20 mmol · L-1，模板DNA 10 ng，dNTPs 0.20 mmol · L-1，引物0.20 μmol · L-1。这一优化体系可望在三疣梭子蟹遗传多样性和性别连锁标记等研究中应用。
Abstract:SRAP is a novel molecular marker with high polymorphism. It is reliable in amplification, easy to operate and has a high universality in primer pairs. SRAP technique has been widely used for studies from plants to aquatic animals in the fields of genetic diversity, germplasm identification, genetic map construction and so on. Based on an orthogonal experimental design, we optimized the five factors of SRAP-PCR amplification system for Portunus trituberculatus (TaqDNA polymerase, Mg2+, template, dNTPs and primer) from four levels. The results show that the effects of these factors on PCR reaction from strong to weak is as follows: template (purity 1.75~1.90, concentration 10~70 ng · μL-1), Mg2+ (1.60~2.00 mmol · L-1), dNTPs (0.10~0.40 mmol · L-1), TaqDNA polymerase (0.50~2.00 U) and primer (0.10~0.40 μmol · L-1).The optimal SRAP-PCR reaction system (25 μL) can be summarized as follows: 0.50 U TaqDNA polymerase, 2.20 mmol · L-1 Mg2+, 10 ng DNA template, 0.20 mmol · L-1 dNTPs and 0.20 μmol · L-1 primer. This optimized system may be helpful in the studies of genetic diversity and sex-linked markers for P.trituberculatus.
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Keywords:
- Portunus trituberculatus /
- SRAP /
- orthogonal design /
- optimization
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目前，福建省已有多家企业利用低值白肉小杂鱼及带鱼生产冷冻鱼糜供给国内外鱼糜制品厂家，冷冻鱼糜生产量约在3×104 t以上。为了提高鱼糜的白度和弹性，在生产鱼糜过程中一般用清水漂洗和碱盐水漂洗。漂洗过程中有1/3左右的水溶性蛋白质溶于漂洗水中被排入大海，这不仅极大地浪费了资源，而且污染了海洋，增加了海水的生物耗氧量(BOD)。据日本专家检测，冷冻鱼糜生产时1 t原料鱼所产生的BOD负荷达10~35 kg[1]，使海水富营养化，成为产生赤潮的潜在因素。据估算，福建的冷冻鱼糜厂家每年就有(1.0~1.2)×104 t的鱼肉与漂洗废水排入大海。因此，将漂洗水中的水溶性蛋白质进行回收和重新利用，不仅能增加企业的效益，而且可以显著降低废水中化学耗氧量(COD)，大大减少废水处理的成本，对于节能减排、建设资源节约性和环境友好型的社会、发展循环性经济具有划时代的意义。
食品废水中回收蛋白质的方法一般有絮凝法、等电点沉淀法[2]、膜分离法[3]及电阻加热法[4]。絮凝法分为无机类和有机类2大类，无机类的氯化铝和氯化铁系列，虽然蛋白质的回收率高，但因为铝(Al)和铁(Fe)等元素的存在，使得回收蛋白的再利用很难实现；有机类中如聚丙烯胺系列由于合成聚合物中的残留单体有毒，限制了合成高分子絮凝剂在回收蛋白再利用方面的应用[5]。而天然有机高分子絮凝剂具有原料来源广泛、价格低廉、无毒无害、无二次污染及易于生物降解等特点[6]。用此类絮凝剂处理蛋白废水不会引入有毒物质，絮凝物富含蛋白质，无毒无害，经进一步处理可作为动物饲料或食品添加剂。近年来国内外陆续报道了用壳聚糖作为高效絮凝剂在处理粉丝废水[7]、回收大豆蛋白[8]、渔业废水[9]、味精废水[10]、活性污泥絮凝沉降[11]、鱼糜漂洗水[12-13]及甲壳质生产废水[14]中的显著效果。因此，该试验用壳聚糖絮凝法对鱼糜漂洗水中的水溶性蛋白质进行回收研究。
1. 材料与方法
1.1 材料
鱼肉由深沪富鸿水产有限公司提供。鱼糜漂洗水是用鱼肉5倍的、经冷却至8~10 ℃的自来水循环漂洗3次，于200目滤布过滤，滤液置于冰箱，冷冻保藏备用，其漂洗工艺流程如下：
1.2 试剂
盐酸和氢氧化钠均配成10 mol · L-1的溶液备用。壳聚糖的脱乙酰度达88%，黏度为0.5 Pa ·s。用1%的乙酸配成1%的溶液备用。
1.3 仪器
磁力搅拌器(金坛市恒丰仪器厂出品)，恒温电热水浴锅(国华电器有限公司出品)，离心机(飞鸽牌，4 000 r · min-1)，pH-510型酸度计(Eutech Instruments)以及漩涡振荡器(Jim-X Scientific Instruments)。
1.4 测定方法
1.4.1 pH
用pH-510型酸度计测定体系中的pH。
1.4.2 蛋白质质量浓度
采用双缩脲法用UV-2100型分光光度计在540 nm处比色测定[15]。
1.4.3 蛋白质回收率
$$ \begin{gathered} \text { 蛋白质回收率 }(\%)=(1- \\ \left.\frac{\text { 上清液中蛋白质质量浓度 }}{\text { 原漂洗水中蛋白质质量浓度 }}\right) \times 100 \end{gathered} $$ 1.4.4 COD的测定
按照重铬酸钾法[16]测定COD。
1.4.5 COD去除率
$$ \begin{aligned} & \quad \mathrm{COD} \text { 去除率 }(\%)=\left(1-\frac{\text { 上清液中 } \mathrm{COD}}{\text { 原漂洗水中 } \mathrm{COD}}\right) \\ & \times 100 \end{aligned} $$ 1.4.6 透光率
透光率用UV-2100型分光光度计在600 nm处测定，用去离子水作为对照[17]。
1.5 试验方法
1.5.1 蛋白质回收工艺
取40 mL已知质量浓度(9.0 mg · mL-1)的漂洗水于100 mL烧杯中，在一定温度下用10 mol · L-1的盐酸或氢氧化钠调pH至定值, 加入定量的1%壳聚糖絮凝剂，在磁力搅拌器上搅拌5 min后再静置30 min。置于离心管中，在4 000 r · min-1离心5 min。测定上清液中的蛋白质质量浓度、透光率和COD。计算蛋白质回收率和COD去除率。
1.5.2 蛋白质标准曲线的绘制
将牛血清白蛋白配制成10 mg · mL-1的标准溶液。分别取蛋白质标准溶液(10 mg · mL -1)0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于试管中，不足1 mL则用蒸馏水补齐至1.0 mL，然后各试管均加入4.0 mL双缩脲试剂，在漩涡震荡器上混匀，室温下反应30 min。以空白管调零，用UV-2100型分光光度计在540 nm波长，杯径1.0 cm条件下测定吸光值(OD)。以蛋白质质量浓度为横坐标，以OD为纵坐标作标准曲线[15]。
1.5.3 壳聚糖絮凝条件的优化
1) 体系的pH对回收效果的影响。设6组试验，pH分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0。每组均添加壳聚糖絮凝剂1.0 mL，温度均设为20 ℃。按1.5.1的回收工艺进行。2)壳聚糖絮凝剂的加入量对回收效果的影响。设6组试验，每组分别加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL和3.0 mL壳聚糖絮凝剂，pH调至8.0，温度均设20 ℃。按1.5.1的回收工艺进行。3)体系的温度对回收效果的影响。设5组试验，温度分别设10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃和50 ℃，pH调至8.0，每组均加入1.0 mL壳聚糖絮凝剂。按1.5.1的回收工艺进行。4)壳聚糖絮凝剂的正交试验。设pH、温度和壳聚糖添加量3个因素，以蛋白质回收率、透光率和COD去除率为指标，选用正交表L9 (34)(表 1)。
表 1 壳聚糖正交试验的因素水平Table 1. Factors and levels of orthogonal test of chitosan因素
factor编码
code水平level 1 2 3 pH A 7.0 8.0 9.0 温度/℃ temperature B 25 30 35 V(添加量)/mL additive amount C 0.5 1.0 1.5 2. 结果与分析
2.1 蛋白质标准曲线
蛋白质的标准曲线见图 1，回归方程为y=0.047 3x+0.000 8，R2=0.999 8，表明蛋白质质量浓度在0~10 mg · mL-1范围内与吸收浓度线性关系良好，后续试验中检测蛋白质质量浓度根据此标准曲线计算。
2.2 鱼糜漂洗水指标分析
蛋白质回收前鱼糜漂洗水溶液的pH为6.5，ρ (COD)为10 368.56 mg · L-1，ρ (水溶性蛋白质)为9.0 mg · mL-1。
2.3 壳聚糖絮凝条件的优化
2.3.1 pH对回收效果的影响
随着pH的上升，回收率逐渐增加，当体系的pH为8.0左右时，回收率达到最大(69.42%)。此后，随着pH的继续上升回收率反而减小(图 2)。同时，COD去除率最大(43.33%)。pH继续上升时COD去除率变小，选择pH 7.0~9.0作为正交试验的因素水平。由上述分析可知，壳聚糖回收蛋白质宜在弱碱性条件下进行，这是由于在弱碱性条件下其絮凝沉淀的速度缓慢，可大量吸附漂洗水中的水溶性蛋白质；而当碱性过强时壳聚糖絮凝速度过快，来不及大量吸附漂洗水中的水溶性蛋白质就沉淀，故回收率偏低。
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图 2 pH对蛋白质回收率和去除COD的影响Figure 2. Effect of pH on protein recovery rate and COD removal rate2.3.2 壳聚糖的添加量对回收效果的影响
随着壳聚糖添加量的逐渐增加，蛋白质回收率也随之增加(图 3)。壳聚糖添加量为1.5 mL左右时蛋白质回收率达到最大(70.82%)，继续添加则回收率逐渐减小。这是因为过量的壳聚糖阻碍了壳聚糖与蛋白质之间的絮凝。同时，壳聚糖添加量在1.5 mL左右时COD去除率最大(45.55%)。故选择壳聚糖添加量0.5~1.5 mL作为正交试验的因素水平。
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图 3 添加量对蛋白质回收率和去除COD的影响Figure 3. Effect of additive amount on protein recovery rate and COD removal rate2.3.3 温度对回收效果的影响
温度从20 ℃升高到30 ℃的过程中蛋白质回收率的增幅较大，继续升温时蛋白质回收率的增幅变小(图 4)。从高回收率和节约能源两方面考虑，选择温度25~35 ℃作为正交试验的因素水平。温度从20 ℃升高到40 ℃的过程中COD去除率的增幅较大，温度超过40 ℃以后COD去除率的增幅变小。
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图 4 温度对蛋白质回收率和去除COD的影响Figure 4. Effect of temperature on protein recovery rate and COD removal rate2.3.4 壳聚糖正交试验结果
壳聚糖絮凝剂回收鱼糜漂洗水中蛋白质的正交试验方案及结果见表 2。由蛋白质回收率的极差分析可以看出，影响蛋白质回收率的各因素主次顺序为A (pH)＞C(壳聚糖添加量)＞B (温度)。方差分析可知，pH对蛋白质回收率的影响极显著；壳聚糖添加量对回收率的影响显著；温度对回收率的影响不显著(表 3)。根据表 2中回收率的K分析得到的优化组合为A2B3C3，即pH 8.0，温度35 ℃，壳聚糖的添加量1.5 mL。
表 2 正交试验方案及结果Table 2. Design and result of orthogonal test试验号
groupA 空列
null columnB C 回收率/%
recovery rate透光率/%
light transmittanceCOD去除率/%
COD removal rate1 1 1 1 1 57.67 65.31 29.09 2 1 2 2 2 61.69 70.55 33.65 3 1 3 3 3 65.19 75.81 39.34 4 2 1 2 3 72.23 85.15 46.71 5 2 2 3 1 68.01 81.85 43.72 6 2 3 1 2 69.18 82.65 44.49 7 3 1 3 2 67.07 80.55 41.09 8 3 2 1 3 65.66 75.33 37.16 9 3 3 2 1 63.31 72.85 34.65 k1 61.58 65.66 64.17 62.99 回收率% k2 69.81 65.19 65.81 66.05 k3 65.34 65.89 66.75 67.69 R 8.22 0.70 2.58 4.70 k1 70.56 77.00 74.43 73.34 透光率% k2 83.22 75.91 76.18 77.92 k3 76.24 77.10 79.40 78.76 R 12.66 1.19 6.04 5.43 k1 34.03 38.96 36.91 35.82 COD去除率% k2 44.97 38.18 38.34 39.75 k3 37.63 41.39 39.50 41.07 R 10.95 1.32 4.47 5.25 表 3 蛋白质回收率的方差分析Table 3. Variance analysis of recovery rate of protein差异源
source of varianceSS
sum of squaredf
degree of freedomMS
mean squareF 显著性
significanceA 50.82 2 25.41 131.57 ** B 5.13 2 2.565 13.29 C 17.05 2 8.525 44.14 * 误差error 0.39 2 0.195 总和sum 73.39 8 注：F0.05(2, 2)=19.00，F0.01(2, 2)=99.00, 后表同此
Note：F0.05(2, 2)=19.00，F0.01(2, 2)=99.00, the same case in the following tables.从透光率的极差分析(表 4)中可以看出，影响透光率的各因素主次顺序为A(pH)＞C(壳聚糖添加量)＞B(温度)。从方差分析可知，pH和壳聚糖添加量对透光率的影响显著；温度对透光率的影响不显著。根据表 2中透光率的K分析得到的优化组合为A2B3C3，即pH 8.0，温度35 ℃，壳聚糖的添加量1.5 mL。
表 4 透光率的方差分析Table 4. Analysis of variance of light transmittance差异源
source of varianceSS
sum of squaredf
degree of freedomMS
mean squareF 显著性
significanceA 120.62 2 60.31 91.75 * B 19.09 2 9.545 14.52 C 25.57 2 12.789 19.45 * 误差error 1.31 2 0.655 总和sum 166.59 8 由COD去除率的极差分析(表 5)可以看出，影响COD去除率的各因素主次顺序为A(pH)＞C(壳聚糖添加量)＞B(温度)。从方差分析可知，pH对COD去除率的影响显著；壳聚糖的添加量和温度对COD去除率的影响均不显著。根据表 2中COD去除率的K分析得到的优化组合为A2B3C3，即pH 8.0，回收温度35 ℃，壳聚糖的添加量1.5 mL。
表 5 COD去除率的方差分析Table 5. Analysis of variances of COD removal rate差异源
source of varianceSS
sum of squaredf
degree of freedomMS
mean squareF 显著性
significanceA 93.26 2 46.63 70.57 * B 15.66 2 7.83 11.84 C 22.36 2 11.18 16.90 误差error 1.32 2 0.66 总和sum 132.71 8 综合以上分析，壳聚糖从鱼糜漂洗水中回收水溶性蛋白质的最佳工艺条件为pH 8.0，温度35 ℃，壳聚糖絮凝剂的添加量1.5 mL。在该工艺条件下进行验证试验，得出蛋白质回收率73.17%，透光率87.50%，COD去除率47.20%的结果。
3. 小结
壳聚糖由甲壳质脱乙酰基而得到。壳聚糖分子中含有高浓度的游离氨基酸和羟基基团，而这些基团可以参与其他物质的化学反应，如蛋白质及氨基酸等[18]。这是由于在水溶液中壳聚糖的游离氨基酸发生质子化反应，使得整个壳聚糖分子带有正电荷，因此, 很容易与其他带电荷物质通过离子交换作用和疏水作用发生相互作用，从而使溶液中的离子凝聚成大的凝聚体而沉降[19]。该试验正是利用了壳聚糖的这种性质来回收鱼糜漂洗水中的水溶性蛋白质，为寻找新的蛋白质饲料资源、缓解蛋白质资源短缺提供一条有效途径。
该试验通过体系的pH、温度和壳聚糖絮凝剂加入量的单因素试验及正交试验，确定壳聚糖絮凝法回收40 mL已知蛋白质质量浓度(9.0 mg ·mL-1)鱼糜漂洗水中水溶性蛋白质的最佳工艺条件为pH 8.0，35 ℃，壳聚糖添加量1.5 mL；其蛋白质回收率73.17%，透光率87.50%，COD去除率47.20%。其总体效果略低于张宗恩等[20]采用三氯化铁和褐藻胶回收鱼糜漂洗水的水溶性蛋白质，因此，今后拟对壳聚糖进行化学修饰，引入新的功能基团，提高其吸附能力，或者添加助凝剂提高其絮凝能力，但具体采用何种方式，还有待进一步研究。
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图 2 模板浓度与结果均值的关系图
Figure 2. Relationship between template concentration and mean of result
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图 3 Mg2+浓度与结果均值的关系图
Figure 3. Relationship between Mg2+ concentration and mean of result
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图 4 dNTPs浓度与结果均值的关系图
Figure 4. Relationship between dNTPs concentration and mean of result
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图 5 TaqDNA聚合酶量与结果均值的关系图
Figure 5. Relationship between TaqDNA polymerase and mean of result
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图 6 引物浓度与结果均值的关系图
Figure 6. Relationship between primer concentration and mean of result
表 1 PCR反应体系的因素水平
Table 1 Factors and levels of PCR reaction
因素
factors水平(体系终浓度)/levels(final concentration) 1 2 3 4 Mg2+/mmol·L-1 1.60 2.00 2.20 2.40 dNTPs/mmol·L-1 0.10 0.20 0.30 0.40 TaqDNA聚合酶/U TaqDNA polymerase 0.50 1.00 1.50 2.00 引物/μmol·L-1 primer 0.10 0.20 0.30 0.40 模板/ng template 10 30 50 70 
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表 2 PCR反应的因素水平正交试验设计
Table 2 Factors and levels of PCR reaction based on orthogonal experimental design
编号
No.Mg2+
/mmol·L-1dNTPs
/mmol·L-1TaqDNA聚合酶/U
TaqDNA polymerase引物/μmol·L-1
primer模板/ng
template得分score 平均得分
average score1 2 3 1 1.60 0.10 0.50 0.10 10 11 10 10 10.33 2 1.60 0.20 1.00 0.20 30 13 12 11 12.00 3 1.60 0.30 1.50 0.30 50 14 11 10 11.67 4 1.60 0.40 2.00 0.40 70 2 1 2 1.67 5 2.00 0.10 1.00 0.30 70 10 9 9 9.33 6 2.00 0.20 0.50 0.40 50 10 7 14 10.33 7 2.00 0.30 2.00 0.10 30 11 14 10 11.67 8 2.00 0.40 1.50 0.20 10 16 15 14 15.00 9 2.20 0.10 1.50 0.40 30 13 15 13 13.67 10 2.20 0.20 2.00 0.30 10 15 16 14 15.00 11 2.20 0.30 0.50 0.20 70 15 12 13 13.33 12 2.20 0.40 1.00 0.10 50 12 11 12 11.67 13 2.40 0.10 2.00 0.20 50 11 12 11 11.33 14 2.40 0.20 1.50 0.10 70 10 12 12 11.33 15 2.40 0.30 1.00 0.40 10 13 16 16 15.00 16 2.40 0.40 0.50 0.30 30 11 10 10 10.33 T1 35.67 44.67 44.33 45.00 55.33 - - - - T2 46.33 48.67 48.00 51.67 47.67 - - - - T3 53.67 51.67 51.67 46.33 45.00 - - - - T4 48.00 38.67 39.67 40.67 35.67 - - - - t1 8.92 11.17 11.08 11.25 13.83 - - - - t2 11.58 12.17 12.00 12.92 11.92 - - - - t3 13.42 12.92 12.92 11.58 11.25 - - - - t4 12.00 9.67 9.92 10.17 8.92 - - - - R 4.50 3.25 3.00 2.75 4.91 - - - - 注：T1~T4为各水平的平均得分总和；t1~t4分别为T1，T2，T3和T4的平均值Note：T1~T4 represent the sum of average scores of each treatment; t1~t4 represent the mean of T1, T2, T3, T4.
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