Optimization of SRAP-PCR system for Portunus trituberculatus based on orthogonal experimental design
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摘要:
相关序列扩增多态性(sequence related amplified polymorphism，SRAP)是一种多态性高的新型分子标记，其扩增结果稳定，容易操作和引物通用性高，在遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建等方面的广泛应用逐渐从植物转移到水产动物中。为了建立三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)SRAP技术体系，文章利用正交设计L16 (45)对三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系的5因素[TaqDNA聚合酶、镁离子(Mg2+)、模板、三磷酸脱氧核苷(dNTPs)和引物]在4个水平上进行优化试验，结果得出各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板(纯度1.75~1.90，质量浓度10~70 ng · μL-1)，Mg2+(1.60~2.00 mmol · L-1)，dNTPs(0.10~0.40 mmol · L-1)，TaqDNA聚合酶(0.50~2.00 U)和引物(0.10~0.40 μmol · L-1)；筛选出各反应因素的最佳水平，建立三疣梭子蟹SRAP-PCR反应的最佳体系(25 μL)为TaqDNA聚合酶0.50 U，Mg2+ 2.20 mmol · L-1，模板DNA 10 ng，dNTPs 0.20 mmol · L-1，引物0.20 μmol · L-1。这一优化体系可望在三疣梭子蟹遗传多样性和性别连锁标记等研究中应用。
Abstract:SRAP is a novel molecular marker with high polymorphism. It is reliable in amplification, easy to operate and has a high universality in primer pairs. SRAP technique has been widely used for studies from plants to aquatic animals in the fields of genetic diversity, germplasm identification, genetic map construction and so on. Based on an orthogonal experimental design, we optimized the five factors of SRAP-PCR amplification system for Portunus trituberculatus (TaqDNA polymerase, Mg2+, template, dNTPs and primer) from four levels. The results show that the effects of these factors on PCR reaction from strong to weak is as follows: template (purity 1.75~1.90, concentration 10~70 ng · μL-1), Mg2+ (1.60~2.00 mmol · L-1), dNTPs (0.10~0.40 mmol · L-1), TaqDNA polymerase (0.50~2.00 U) and primer (0.10~0.40 μmol · L-1).The optimal SRAP-PCR reaction system (25 μL) can be summarized as follows: 0.50 U TaqDNA polymerase, 2.20 mmol · L-1 Mg2+, 10 ng DNA template, 0.20 mmol · L-1 dNTPs and 0.20 μmol · L-1 primer. This optimized system may be helpful in the studies of genetic diversity and sex-linked markers for P.trituberculatus.
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Keywords:
- Portunus trituberculatus /
- SRAP /
- orthogonal design /
- optimization
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水东湾是一个面积约32 km2的泻湖，有一条长12.7 km、宽500~800 m、深5~15 m的潮汐通道与外海相通。流入水东湾的河流只有溪涧小河，旦场河、寨头河、南海河等分别经水东镇、坡心镇、陈村镇、旦场镇等进入水东湾。水东湾的水东港区为茂名港的重要港区之一，近几十年来发展迅速，现已成为以石油化工产品运输为主的沿海大港，年吞吐能力达千万吨[1]。由于该区域社会经济的飞速发展，大型工业的建设和投产，陆源物质的大量输入以及养殖活动的影响，造成水东湾淤积严重，水域生态环境面临着严峻的挑战。
浮游植物作为水生态系统的初级生产者，其群落结构直接影响水生态系统功能。浮游植物的时空变化特征与环境因子密切相关，浮游植物群落能对环境条件的变化做出快速的响应，其种类组成、数量、优势种及污染指示种等在不同水环境中变化很大[2-4]。因此，浮游植物群落结构的变化可以综合、真实地反映水体生态环境状况[5-6]。目前有关水东湾浮游植物仅1993年吕颂辉等[7]对水东港海域有过简单的报道。因此，此次调查针对水东湾水域浮游植物的种类组成、细胞丰度、优势种以及物种多样性等进行，并通过查阅相关历史资料比较分析水东湾浮游植物群落结构特征，进而了解近些年来人类活动对水东湾海域生态环境的影响，以期为该海域生态环境评价及保护措施的制订等提供基础资料。
1. 材料与方法
1.1 采样时间与站位
2个航次分别于2013年4月(春季)和10月(秋季)租用当地渔船进行浮游植物样品采集，浮游植物调查共设置12个站位，其中Z1~Z4在湾内记为湾内站位，Z5~Z8在通道处记为通道站位，Z9~Z12在湾外记为湾外站位，调查站位详见图 1。
1.2 样品的采集与分析
浮游植物样品采集与定量参照《海洋调查规范海洋生物调查》[8]进行。样品用25号浮游生物网采集，自水底(离底部0.5 m)向水面垂直拖曳，用鲁哥氏液现场固定，经48 h沉淀浓缩，用0.1 mL浮游植物计数框在光学显微镜下进行计数和鉴定。
1.3 分析方法与计算公式
运用Shannon-Wiener多样性指数(H′)、Pielou均匀度指数(J)、Margalef物种丰富度指数(D)及浮游植物优势度(Y)对浮游植物群落结构特征和水质状态进行初步评价。
Shannon-Wiener多样性指数(H′)计算公式为：
$$ H^{\prime}=-\sum\left(n_i / N\right) \times \ln \left(n_i / N\right) $$ (1) 式中ni为第i种浮游植物个体数；N为浮游植物个体总数。H′越大，水质越清洁(0~1为重污染；1~2为中污染；2~3为轻污染；大于3为清洁)[9]。
Pielou均匀度指数(J′)计算公式为：
$$ J^{\prime}=H^{\prime} / \ln N $$ (2) 式中H′为Shannon-Wiener多样性指数；N为浮游植物个体总数。J′越大，水质越清洁(0~0.3为重污染；0.3~0.5为中污染；0.5~0.8为轻污染或无污染)[10]。
Margalef物种丰富度指数(D)计算公式为：
$$ D=(S-1) / \ln N $$ (3) 式中S为种类数；N为个体数。D越大，水质越清洁(0~1为重度污染；1~2为严重污染；2~4为中度污染；4~6为轻度污染；大于6为清洁)[11]。
种类优势度指数(Y)计算公式为：
$$ Y=\left(N_i / N\right) f_i $$ (4) 式中Ni为第i种的个体数；N为每个钟的总个体数；fi为第i种在各站位中出现的频度，Y>0.02为优势种[12]。
2. 结果与分析
2.1 浮游植物种类组成
2个航次共鉴定浮游植物4门69种(含变种、变型及个别未定种的属)，春季39种，秋季48种。其中硅藻59种，占85.51%；甲藻8种，占11.59%；蓝藻和金藻类均1种，分别占1.45%。浮游植物以硅藻占优势。
调查发现各站位浮游植物种类数存在极显著性差异(P < 0.01)，各站位平均种类数为15种，其中春季平均13种，秋季平均17种。出现种类最多的为Z2站，平均出现了19种(图 2)。从浮游植物各站种类数水平分布呈现出两大特点：1)秋季各站位种类数普遍高于春季；2)春季为通道站位高于湾内外站位；秋季为湾内站位高于通道站位及湾外站位的趋势。
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图 2 水东湾海域浮游植物种类数水平分布Figure 2. Horizontal distribution of phytoplankton species in Shuidong Bay2.2 浮游植物细胞丰度时空变化
2.2.1 季节变化
春、秋两季浮游植物丰度存在极显著性差异(P < 0.01)，两季各站位浮游植物丰度变化为4.30×104~570.45×104个· m-3，平均112.99×104个· m-3；其中春季平均丰度为22.89×104个· m-3，秋季为203.10×104个· m-3，秋季是春季的8.87倍(图 3)。
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图 3 水东湾海域浮游植物细胞丰度水平分布Figure 3. Horizontal distribution of phytoplankton abundance in Shuidong Bay2.2.2 水平分布
2个季节浮游植物丰度的水平分布存在一定的差异(图 3)。春季浮游植物丰度水平分布为湾口各站位丰度高于湾内及通道各站位，其中最高站位为Z12(117.22×104个· m-3)，最低为Z1(4.30×104个· m-3)；秋季浮游植物水平分布表现出湾内各站位高于湾外各站位，湾外各站位则高于通道处各站位，即表现为Z1~Z4(平均367.83×104个· m-3)>Z9~Z12(平均160.91×104个· m-3)>Z5~Z8(平均80.55×104个· m-3)，其中最高站位为Z4(570.45×104个· m-3)，最低为Z7(53.09×104个· m-3)。
2.3 浮游植物优势种的组成及季节变化
以Y大于0.02为判断标准，该次调查海域浮游植物优势种出现了7种(表 1)，两季优势种种类差异较大，有明显的季节更替。春、秋两季浮游植物优势种分别出现了4种，优势种组成均表现出Y高优势种较单一的特点。两季共同的优势种为广温广盐广布种中肋骨条藻(Skeletonema costatum)，其Y分别高达0.64和0.54，除中肋骨条藻外，春季优势种还包括中心圆筛藻(Coscinodiscus centralis)、远距角毛藻(Chaetoceros distans)和拟弯角毛藻(Chaetoceros pseudocurvisetus)；秋季优势种还有奇异棍形藻(Bacillaria paradoxa)、菱形海线藻(Thalassionema nitzschioides)和尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)，其第二优势种奇异棍形藻的Y也高达0.33。
表 1 水东湾浮游植物优势种组成Table 1. Composition of dominant species of phytoplankton in Shuidong Bay春季 spring 秋季 autumn 种名 species 优势度 (Y)dominance 种名 species 优势度 (Y)dominance 中肋骨条藻 S.costatum 0.64 中肋骨条藻 S.costatum 0.54 中心圆筛藻 C.centralis 0.13 奇异棍形藻 B.paradoxa 0.33 远距角毛藻 C.distans 0.07 菱形海线藻 T.nitzschioides 0.04 拟弯角毛藻 C.pseudocurvisetus 0.02 尖刺拟菱形藻 P.pungens 0.02 2.4 浮游植物物种多样性的时空变化
2.4.1 季节变化
水东湾海域浮游植物种类数季节变化为秋季(48种)>春季(39种)；H′为春季(2.38)>秋季(1.72)；J′为春季(0.66)>秋季(0.43)；D为秋季(0.75)>春季(0.68)。表明春季浮游植物物种多样性比秋季高，分布也较秋季均匀，但物种丰富度不如秋季。
2.4.2 水平变化
春、秋两季水东湾浮游植物多样性总体水平较一般(表 2)，各站位物种H′为0.71~3.07，平均为2.05，H′水平分布呈现出春季湾内最高，其次为通道站位；秋季则表现出通道站位最高，湾内站位最低的变化趋势。各站J′为0.19~0.88，平均为0.55，变化趋势与H′变化趋势相似，总体来说水东湾水域J′水平一般。各站位D为0.38~1.08，平均为0.72，D水平很低，表明水东湾水域浮游植物物种丰富性较差。
表 2 水东湾浮游植物多样性指数、均匀度指数和丰富度指数Table 2. Diversity index, evenness index and richness index of phytoplankton in Shuidong Bay指数 index 季节 season Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 Z11 Z12 全区均值 average of the area 多样性指数(H′) diversity index 春季 2.72 3.07 2.95 2.79 3.05 2.61 2.45 2.64 1.92 2.17 1.46 0.71 2.38 秋季 1.75 1.52 1.60 1.34 1.85 1.58 2.07 2.12 1.97 1.40 2.33 1.07 1.72 平均 2.24 2.30 2.28 2.07 2.45 2.10 2.26 2.38 1.95 1.79 1.90 0.89 2.05 均匀度指数(J) evenness index 春季 0.82 0.74 0.80 0.88 0.76 0.71 0.68 0.76 0.57 0.61 0.40 0.19 0.66 秋季 0.39 0.35 0.39 0.32 0.46 0.43 0.54 0.48 0.53 0.36 0.56 0.34 0.43 平均 0.61 0.55 0.60 0.60 0.61 0.57 0.61 0.62 0.55 0.49 0.48 0.27 0.55 丰富度指数(D) richness index 春季 0.58 0.99 0.73 0.51 0.93 0.74 0.67 0.59 0.49 0.61 0.68 0.64 0.68 秋季 1.01 0.93 0.73 0.75 0.75 0.61 0.68 1.08 0.58 0.68 0.84 0.38 0.75 平均 0.80 0.96 0.73 0.63 0.84 0.68 0.68 0.84 0.54 0.65 0.76 0.51 0.72 3. 讨论
3.1 水东湾浮游植物群落结构特征
水东湾地处亚热带，气候温和，并有多条小型河流注入，加上工业污水的排入，该水域无机盐和有机物含量丰富，适宜港湾及沿岸广温广盐广布性种类生长。该次调查水东湾浮游植物群落是一个以硅藻为主导型的群落结构，硅藻细胞丰度所占比例高达99.11%，以骨条藻、棍形藻、角毛藻、菱形藻和圆筛藻等为主要优势种，优势种类较少，Y较高，总体来说水域浮游植物群落结构稳定性较差，容易受到外界因子的干扰。水东湾春、秋季均以中肋骨条藻为第一优势种，这与柘林湾[13-14]调查结果相似，与大亚湾不同，大亚湾春季以洛氏角毛藻(Chaetoceros lorenzianus)为第一优势种，秋季则以菱形海线藻(Thalassionema nitzschioides)为第一优势种，其次才为中肋骨条藻[15]。中肋骨条藻是一种全球近岸海域分布极广的广温广盐性浮游硅藻，也是一种赤潮藻[16-17]。尽管中肋骨条藻为无毒种类，但其大规模的爆发对海洋生态环境有一定的负面影响，如水体变色、伴有腥臭味、影响渔业生产等。该次调查水东湾春季中肋骨条藻平均丰度为1.46×105个· m-3，秋季为1.12×106个· m-3，根据安达六郎[18]提出的赤潮判断标准(>5×106个·m-3)，秋季已接近中肋骨条藻赤潮的爆发值。为此应注重加强生态环境的保护，防止赤潮的发生。
水东湾浮游植物平均细胞丰度为112.99×104个· m-3，与流沙湾1.33×104个· m-3[19]和钦州湾11.94×104个· m-3[20]相比，丰度水平相对较高；与大亚湾114×104个· m-3[14]相近，稍低于深圳湾292×104个· m-3丰度水平[21]。与水东港海域相比，吕颂辉等[7]1987年对水东港进行了4个站位的浮游植物调查，共鉴定出66种，丰度为141×104个· m-3，优势种为中肋骨条藻、菱形海线藻、布氏双尾藻(Ditylum brightwelli)、活动盒形藻(Biddulphia mibiliensis)等。浮游植物种类和丰度差异不大，但优势种则有较大差异，除中肋骨条藻外，其他种类均不相同(表 3)。这表明水东湾水域浮游植物优势种更替较明显。与放鸡岛海域相比，水东湾浮游植物丰度远远低于该海域，优势种类也不同，2个水域浮游植物群落结构存在明显的差异[22]。
表 3 水东湾邻近海域浮游植物生态特征值比较Table 3. Comparison of ecological characteristics of phytoplankton in Shuidong Bay and adjacent sea areas时间 time 海域 sea area 种类 species 密度/104个·m-3 density 优势种 dominant species 多样性指数(H′) diversity index 均匀度指数(J) evenness index 文献 Reference 1987.8 水东港 66 49.00 中肋骨条藻、菱形海线藻、布氏双尾藻、活动盒形藻、锤状中鼓藻、洛氏角毛藻、裸甲藻、夜光藻 - - [6] 2003.8 放鸡岛 57 75 244.00 角毛藻、丹麦细柱藻、脆根管藻、尖刺拟菱形藻 1.45 0.77 [22] 2003.12 20 416.00 1.17 0.63 2004.2 9 916.90 0.95 0.46 2004.5 14 938.00 1.45 0.49 2013.4 水东湾 69 22.89 中肋骨条藻、奇异菱形藻、中心圆筛藻、菱形海线藻、远距角毛藻、拟弯角毛藻、尖刺拟菱形藻 2.38 0.66 该文 2013.10 203.10 1.72 0.43 3.2 浮游植物物种多样性分析
物种多样性是衡量一定区域内生物资源丰富程度的指标，常用于评价群落中物种组成稳定程度、数量分布均匀程度和群落组织结构特征等。调查得出，春、秋季水东湾浮游植物H′平均为2.05，J′平均为0.55。参照浮游植物多样性和J′分级评价标准，水东湾水质状况属于中度污染。春、秋季D平均为0.72，由该指数反映的水质状况为重污染。纵观季节变化，春、秋两季水东湾水质状态有所不同，春季水东湾浮游植物H′、J′和D分别为2.38、0.66和0.68，秋季分别为1.72、0.43和0.75，春季多样性高于秋季，表明水东湾的水质状态春季好于秋季。与南海其他海湾相比(表 4)，水东湾浮游植物多样性高于深圳湾[23]和柘林湾[24]，低于流沙湾[25]，与大亚湾[26]调查结果接近。与钦州湾[20]浮游植物H′相比，钦州湾为秋季高于春季，而该调查结果与其恰好相反，这可能是因为秋季水东湾中肋骨条藻和奇异棍形藻大量繁殖，导致其他种类生存空间减小，细胞丰度相对较少，从而导致物种多样性降低。
表 4 水东湾与南海其他海湾浮游植物多样性比较Table 4. Comparison of phytoplankton diversity in Shuidong Bay and other bays in the South China Sea时间 time 海湾 bay 种类 species 多样性指数(H′) diversity index 均匀度指数(J′) evenness index 文献 Reference 2010春 spring 钦州湾 193 1.58 0.46 [20] 2010夏 summer 2.65 0.53 2010秋 autumn 3.08 0.70 2011冬 winter 3.25 0.71 2008春 spring 深圳湾 150 0.100 0.017 [23] 2008 夏summer 0.633 0.102 2008 秋autumn 0.823 0.143 2008 冬winter 1.211 0.215 2001.7~2002.7 柘林湾 183 1.75 0.42 [24] 2007春 spring 流沙湾 159 3.23 0.82 [25] 2006夏 summer 2.92 0.79 2007秋 autumn 3.43 0.73 2006冬 winter 2.53 0.85 2007春 spring 大亚湾 114 1.83 0.51 [26] 2007夏 summer 1.62 0.53 2013春 spring 水东湾 69 2.38 0.66 该文 2013秋 autumn 1.72 0.43 总体来说，水东湾浮游植物多样性属中等水平，表明水东湾水质状态一般，水环境受到了一定程度的污染，水域生态系统较为脆弱。浮游植物多样性水平仅能对该水域水质状态做初步的判断，要全面了解该水域的水质状况还需综合pH、溶解氧、营养盐、悬浮颗粒物、浮游动物、底栖生物等理化环境因子和生物因子指标的监测结果。
4. 结语
调查海域浮游植物以沿岸暖水性与广温性种类为主。春、秋两季种类组成表现出优势种单一优势度指数高的特点；两季均以中肋骨条藻为第一优势种，优势特征十分突出；其中秋季中肋骨条藻丰度已接近赤潮标准，应加强中肋骨条藻赤潮监测，做好相应的防治措施。
总体来说，水东湾浮游植物多样性处一般水平，水域生态系统较为脆弱，生态环境一般，应加强生态环境保护。随着水东港迅速发展，各种工程项目开工建设，船舶进出港频繁，不可避免地对水东湾海域环境造成影响。为提高海域环境质量，应制定严格的废水排放标准，完善油污清理方法，加强油污泄露应急处理能力。
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图 2 模板浓度与结果均值的关系图
Figure 2. Relationship between template concentration and mean of result
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图 3 Mg2+浓度与结果均值的关系图
Figure 3. Relationship between Mg2+ concentration and mean of result
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图 4 dNTPs浓度与结果均值的关系图
Figure 4. Relationship between dNTPs concentration and mean of result
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图 5 TaqDNA聚合酶量与结果均值的关系图
Figure 5. Relationship between TaqDNA polymerase and mean of result
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图 6 引物浓度与结果均值的关系图
Figure 6. Relationship between primer concentration and mean of result
表 1 PCR反应体系的因素水平
Table 1 Factors and levels of PCR reaction
因素
factors水平(体系终浓度)/levels(final concentration) 1 2 3 4 Mg2+/mmol·L-1 1.60 2.00 2.20 2.40 dNTPs/mmol·L-1 0.10 0.20 0.30 0.40 TaqDNA聚合酶/U TaqDNA polymerase 0.50 1.00 1.50 2.00 引物/μmol·L-1 primer 0.10 0.20 0.30 0.40 模板/ng template 10 30 50 70 
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表 2 PCR反应的因素水平正交试验设计
Table 2 Factors and levels of PCR reaction based on orthogonal experimental design
编号
No.Mg2+
/mmol·L-1dNTPs
/mmol·L-1TaqDNA聚合酶/U
TaqDNA polymerase引物/μmol·L-1
primer模板/ng
template得分score 平均得分
average score1 2 3 1 1.60 0.10 0.50 0.10 10 11 10 10 10.33 2 1.60 0.20 1.00 0.20 30 13 12 11 12.00 3 1.60 0.30 1.50 0.30 50 14 11 10 11.67 4 1.60 0.40 2.00 0.40 70 2 1 2 1.67 5 2.00 0.10 1.00 0.30 70 10 9 9 9.33 6 2.00 0.20 0.50 0.40 50 10 7 14 10.33 7 2.00 0.30 2.00 0.10 30 11 14 10 11.67 8 2.00 0.40 1.50 0.20 10 16 15 14 15.00 9 2.20 0.10 1.50 0.40 30 13 15 13 13.67 10 2.20 0.20 2.00 0.30 10 15 16 14 15.00 11 2.20 0.30 0.50 0.20 70 15 12 13 13.33 12 2.20 0.40 1.00 0.10 50 12 11 12 11.67 13 2.40 0.10 2.00 0.20 50 11 12 11 11.33 14 2.40 0.20 1.50 0.10 70 10 12 12 11.33 15 2.40 0.30 1.00 0.40 10 13 16 16 15.00 16 2.40 0.40 0.50 0.30 30 11 10 10 10.33 T1 35.67 44.67 44.33 45.00 55.33 - - - - T2 46.33 48.67 48.00 51.67 47.67 - - - - T3 53.67 51.67 51.67 46.33 45.00 - - - - T4 48.00 38.67 39.67 40.67 35.67 - - - - t1 8.92 11.17 11.08 11.25 13.83 - - - - t2 11.58 12.17 12.00 12.92 11.92 - - - - t3 13.42 12.92 12.92 11.58 11.25 - - - - t4 12.00 9.67 9.92 10.17 8.92 - - - - R 4.50 3.25 3.00 2.75 4.91 - - - - 注：T1~T4为各水平的平均得分总和；t1~t4分别为T1，T2，T3和T4的平均值Note：T1~T4 represent the sum of average scores of each treatment; t1~t4 represent the mean of T1, T2, T3, T4.
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