Construction of whole body normalized cDNA library of Haliotis diversicolor Reeve challenged by Vibro harveryi
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摘要:
提取了哈维氏弧菌(Vibrio harveryi)感染的杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)总RNA，采用SMART方法合成双链cDNA，并用双链特异核酸酶进行均一化处理。割取0.5~1.0和1.0~3.0 kb的片段分别连接pDNR-LIB并转化大肠杆菌(Esherichia coli)，最终构建2种片段大小的杂色鲍全组织均一化cDNA文库。2文库库容均在2.5×105 cfu · mL-1左右，PCR检测阳性重组率为100%。随机挑取200个克隆测序，获得高质量EST序列174条。组装后得到149条Unigenes，冗余率为14.37%。序列注释结果表明，有39条Unigene序列与已知基因高度相似。综上所述，文章所建cDNA文库质量良好，可以满足后续研究工作的需要。
Abstract:We extracted the total RNA of Vibrio harveyi-challenged abalone (Haliotis diversicolor Reeve).First and second strand cDNA were synthetized by using Creator SMART cDNA Construction Kit and further homogenization of cDNA library was carried out with duplex-specific nuclease (DSN) treatment. Fragments at length of 0.5~1.0 kb and 1.0~3.0 kb were ligated to pDNR-LIB and transformed into Esherichia coli strain DH10B. Both two cDNA libraries have a capacity of 2.5×105 cfu · mL-1, and all of the 30 randomly picked colonies are identified as positive recombinant plasmids by PCR. Furthermore, 200 randomly selected clones were sequenced and 174 high quality ESTs were acquired, which belong to 149 unigenes including 12 contigs and 137 singlets after assembling with a redundancy rate of 14.37%. The result indicates that 39 unigenes get high similarity with known genes. In conclusion, the cDNA library we have constructed has good quality and can facilitate further research work.
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Keywords:
- Haliotis diversicolor Reeve /
- cDNA library /
- Vibro harveryi
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杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)营养丰富、生长迅速，是中国南方沿海海域广泛养殖的鲍品种[1]。由于近年来环境污染加剧、养殖密度增加以及鲍种质资源的退化等因素影响，鲍的各种病害频发，严重制约了鲍养殖业的健康发展[1-5]。目前发现的鲍病原多种多样，其中由哈维氏弧菌(Vibrio harveryi)引起的弧菌病是常见的鲍传染病之一[6-7]。近年来中国南方杂色鲍养殖场频繁受到这种病害的威胁，在感染后的1~2月内，杂色鲍死亡率高达80%以上，至使许多养殖场面临关闭[5]。由于人们对鲍等贝类的免疫机理了解相对较少，尤其是从分子水平上对其先天免疫系统以及免疫因子的研究还十分有限。因此，广泛而深入地开展鲍分子生物学水平的免疫相关研究，对鲍病害的防控、诊治，以及促进鲍养殖业的健康发展具有重要意义。该研究采用哈维氏弧菌人工感染杂色鲍，提取不同组织mRNA构建均一化全长cDNA文库，以期获得高质量的基因文库，为寻找鲍免疫相关基因及其免疫机理研究打下良好基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
健康杂色鲍采自汕尾某鲍养殖场，壳长(40±5)mm，运回后暂养于水族箱供人工感染试验用。哈维氏弧菌菌株B2D从患病杂色鲍中自行纯化、鉴定，并经人工感染验证(相关数据待发表)。
1.2 主要试剂
弧菌选择性培养基(TCBS)购自北京路桥生物技术有限公司；Trizol总RNA提取试剂购自Invitrogen公司；Creator SMART cDNA Construction Kit购自Clontech公司；Trimmer-Director kit购自Evrogen公司；Ex TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000 Marker、pDNR-LIB载体连接试剂盒等购自TaKaRa公司。
1.3 试验方法
1.3.1 处理与采样
杂色鲍暂养于水温(24±1)℃、盐度30的过滤海水中，观察3 d后用于试验。取哈维氏弧菌B2D接种至营养琼脂培养基，28 ℃培养24 h后，接种于TCBS培养基，28 ℃培养24 h，用灭菌生理盐水稀释至5×105 cfu · mL-1，取暂养的雌、雄各5只杂色鲍，分别注射100 μL菌液，24 h后分别取肌肉和内脏团(包括鳃、肝胰腺、外套膜、性腺等)组织、提取总RNA。
1.3.2 cDNA文库的构建
按照Trizol操作手册提取杂色鲍肌肉和内脏团总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA完整性和含量，等质量混合2种RNA。按照Creator SMART cDNA Construction Kit的操作手册将混合后的总RNA合成一、二链，用LD-PCR方法扩增二链。根据Trimmer-Director Kit(Evrogen，Cat. No. NK002)操作，去除高拷贝基因，并对双链特异核酸酶(duplex-specific nuclease，DSN)处理的样品进行第二次PCR扩增。将2次PCR产物纯化后进行酶切和胶回收，并与pDNR-LIB载体连接转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH10B感受态。取适量菌液按比例稀释后涂于氯霉素平板上，37 ℃培养过夜，统计克隆数并计算文库滴度。
1.3.3 菌落鉴定
挑取平板上15个菌落克隆，进行菌落PCR鉴定。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min，35个循环；94 ℃变性40 s，53.6 ℃退火40 s，72 ℃延伸4 min；72 ℃充分延伸10 min。取适量PCR产物电泳检测并估算片段长度。
1.3.4 随机克隆测序及分析
随机挑取200个克隆送北京华大基因研究中心测序，使用phrap软件对EST序列进行拼接，并在NCBI网站上进行Blast比对分析。
2. 结果与分析
2.1 总RNA提取
杂色鲍肌肉和内脏团组织总RNA提取结果见图 1，箭头所示的上方条带为28S rRNA，下方为18S rRNA，OD260nm/280nm比值分别为2.02和2.05，介于1.9~2.2之间，符合RNA纯度要求。
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图 1 肌肉和内脏团总RNA电泳1. 肌肉总RNA；2. 内脏团总RNAFig. 1 Electrophoresis of total RNA in muscle and visceral mass1. muscle total RNA; 2. visceral mass total RNA2.2 cDNA一、二链的合成与均一化
取5 μL产物，于1.1%含EB的胶上电泳检测cDNA合成结果(图 2-a)。可见cDNA长度大于5 000 bp，smear条带主要位于0.5~5.0 kb之间，尤其在0.75~2.0 kb处有明显的高拷贝基因带，说明需要对产物做均一化处理。
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图 2 cDNA一、二链的合成与均一化电泳图M. DL2000 plus；泳道1. LD-PCR扩增cDNA双链结果；2~5. 分别为11个循环的Control，1/4倍DSN酶处理，1/2倍DSN酶处理和1倍的DSN酶处理；6. 1倍DSN处理的样品再次PCR扩增12个循环Fig. 2 Electrophoresis of first and second strand cDNA synthesis and homogenizationM. DL2000 plus marker; Lane 1. double strand cDNA amplified by LD-PCR; 2. 11 cycles without DSN treatment; 3. 1/4×DSN treatment; 4. 1/2×DSN treatment; 5. 1×DSN treatment; 6. 12 plus PCR cycles after 1×DSN treatment根据Trimmer-Director Kit操作说明，进行均一化处理。从图 2-b可以看出，1倍DSN处理(泳道5)后，高拷贝基因条带已全部消除、smear带很均匀。取1倍DSN处理的样品进行第2次PCR扩增，12个循环后取5 μL产物电泳检测(图 2-c)。由第6泳道的结果可见，cDNA片段长度比图图 2-b中的结果提高明显，达到了预期效果。
2.3 连接产物的转化和文库鉴定
对2次PCR产物进行纯化后，SfiⅠ酶切，分别割胶回收0.5~1.0和1.0~3.0 kb之间的片段，与载体连接并转化大肠杆菌涂板。37 ℃培养过夜后，根据平板的菌落数计算菌液滴度，2个文库库容均为2.5×105 cfu · mL-1。从2个平板中分别挑取15个克隆进行菌落PCR鉴定(图 3)，由图 3-a可见插入片段长度基本在0.5~1.0 kb之间，图 3-b中插入片段基本在1.0~3.0 kb之间，并且PCR阳性率均达到了100%。
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图 3 菌落PCR鉴定插入片段电泳图a. 插入片段为0.5~1.0 kb的文库克隆；b. 插入片段为1.0~3.0 kb的文库克隆；M. DL2000 plusFig. 3 Electrophoresis of colony PCR for inserted fragmentsa. library clones with 0.5~1.0 kb inserted fragments; b. library clones with 1.0~3.0 kb inserted fragments; M. DL2000 plus marker2.4 序列分析及比对
对随机挑取的200个克隆进行测序，结果表明有187个获得了测序结果，其中高质量ESTs(长度大于100 bp)有174条。进一步对这些序列进行拼接，发现37条EST序列分属12条Contigs，其余137条EST序列均为Singlets，Unigenes数(=Contigs+Singlets)为149条，冗余率(Redundancy)只有14.37%。对149条Unigene序列Blastx比对NCBI的非冗余蛋白质序列库(NR)，结果显示有39条(26.2%)序列获得了可靠的比对结果(Identity>80%)(表 1)。在这些已知基因序列中，核糖体蛋白(ribosomal protein)亚基的cDNA序列最多(9条)，分析可能与核糖体本身含量很高有关；另外有2个Unigene属于钙调蛋白(calmodulin)；其他基因还包括组织蛋白酶(cathepsin)、胶转蛋白(transgelin)、动力蛋白(dynein)、ATP合成酶等。值得注意的是，这些Unigene中有18条(12.1%)序列与鲍属(Haliotis)的已知基因相似性最高，其中10个来自皱纹盘鲍(H.discus)、7个来自杂色鲍、1个来自耳鲍(H.asinina)，这说明文章构建的cDNA文库来源可靠。
表 1 Unigene序列比对结果Table 1 Blast result of unigenesunigene
ID长度
length /nt相似度
identity /%E值
E ValueNCBI检索号
NCBI accession No.注释
notes原序列
origin1_A01 491 80 1.00E-49 ABW23182.1 ribosomal protein rpl27a 沙蠋属Arenicola marina 2_C04 519 80 3.00E-21 AAB09424.1 mitochondrial trifunctional protein beta subunit - 2_C09 509 80 3.00E-61 ABW23163.1 ribosomal protein rpl7a 沙蠋属A.marina 2_G01 494 80 2.00E-14 EDL85083.1 cathepsin Z, isoform CRA_a 褐家鼠Rattus norvegicus 1_A04 501 81 2.00E-34 AAB51325.1 C2f 人Homo sapiens 1_G03 496 81 5.00E-32 pdb|1E4U Chain A, N-terminal ring finger domain of human not-4 人H.sapiens 1_G05 497 81 4.00E-45 XP_967271.1 PREDICTED: similar to CG9172 CG9172-PA 赤拟谷盆Tribolium castaneum 2_B07 513 81 1.00E-59 ABO26639.1 transgelin 皱纹盘鲍H.discus discus 1_C03 509 82 8.00E-49 XP_783725.1 outer arm dynein LC3 紫海胆Anthocidaris crassispina 2_A02 496 82 3.00E-11 AAA61824.1 anti-proliferative protein - 2_A08 505 82 8.00E-59 ACJ65685.1 LIM protein 皱纹盘鲍H.discus discus 2_F10 506 83 7.00E-29 EEA73605.1 hypothetical protein BRAFLDRAFT_69314 文昌鱼Branchiostoma floridae 2_E05 419 84 9.00E-57 ABE72932.1 zona pellucida domain A 皱纹盘鲍H.discus hannai 2_G08 505 84 9.00E-47 ABO26647.1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, o subunit 皱纹盘鲍H.discus discus 2_H06 501 84 1.00E-72 BAD15288.1 78kDa glucose regulated protein 牡蛎Crassostrea gigas 1_F03 513 87 4.00E-61 ABU43069.1 60S ribosomal protein L15 杂色鲍H.diversicolor 1_F09 499 89 2.00E-34 P41384.1 Full=cyclin-dependent kinases regulatory subunit 欧洲帽贝Patella vulgata 2_F09 508 89 4.00E-76 XP_001653666.1 arp2/3 complex 20 kd subunit 埃及斑蚊Aedes aegypti 1_B01 496 90 7.00E-18 BAB32124.1 unnamed protein product 小鼠Mus musculus 1_H10 486 90 2.00E-77 BAE16013.1 ribosomal protein S5 牡蛎C.gigas 2_G02 463 92 3.00E-60 ACH56913.1 26S proteasome regulatory complex ATPase RPT2 带纳Simulium vittatum 1_C10 500 94 2.00E-56 AAM94275.1 ribosomal protein S20 栉孔扇贝Chlamys farreri Contig5 496 96 1.00E-71 ABO26685.1 ribosomal protein l17 皱纹盘鲍H.discus discus 1_A10 455 96 2.00E-62 ABO26685.1 ribosomal protein l17 皱纹盘鲍H.discus discus 1_B10 496 96 1.00E-71 ABO26685.1 ribosomal protein l17 皱纹盘鲍H.discus discus Contig2 497 97 5.00E-72 NP_001119640.2 calmodulin 豆宛豆蚜Acyrthosiphon pisum Contig3 503 97 8.00E-43 ABY87377.1 unknown protein 9 杂色鲍H.diversicolor 1_A05 503 97 8.00E-43 ABY87377.1 unknown protein 9 杂色鲍H.diversicolor 1_D05 509 97 8.00E-62 XP_001634403.1 predicted protein 星状海葵Nematostella vectensis 1_G07 496 97 2.00E-56 ABY87378.1 predicted protein 2 杂色鲍H.diversicolor 1_H07 497 97 5.00E-72 NP_001119640.2 calmodulin 豆宛豆蚜A.pisum 2_D07 488 97 1.00E-65 AAF26741.1 chlorophyll a/b binding protein precursor 乳浆大戟Euphorbia esula 1_F06 503 98 9.00E-47 ABY87346.1 unknown protein 杂色鲍H.diversicolor 1_H09 488 98 1.00E-71 ABO26682.1 ribosomal protein S14 皱纹盘鲍H.discus discus 2_F01 500 98 9.00E-84 ABO26671.1 26S protease regulatory subunit 6B 皱纹盘鲍H.discus discus 1_E06 509 99 7.00E-87 ABO26645.1 proteasome alpha type 2 皱纹盘鲍H.discus discus 2_A12 467 99 6.00E-62 ABV08873.1 actin depolymerisation factor/cofilin 杂色鲍H.diversicolor 1_H02 384 100 4.00E-41 ABY87377.1 unknown protein 9 杂色鲍H.diversicolor 2_C10 507 100 8.00E-41 AAP85231.1 tropomyosin 1 耳鲍H.asinina 3. 讨论
迄今国内有关鲍cDNA文库的报道主要以皱纹盘鲍和杂色鲍为主，其中皱纹盘鲍文库包括不同壳色杂交家系文库[8]、胚胎文库[9]、肝和肾文库[10]、外套膜文库[11-12]等。杂色鲍文库主要有多种细菌攻毒杂色鲍血淋巴细胞抑制性差减杂交文库[13]、副溶血弧菌感染的肝脏和血细胞文库[14-15]，以及三丁基锡(TBT)处理的杂色鲍肝胰腺文库[16]等。针对哈维氏弧菌这种病原的全组织文库尚未见报道。文章所用病原是笔者所在研究室从广东汕头某养殖场患肌肉萎缩症[5]的杂色鲍体内分离得到的，人工感染后证实了其病原致病性。通过进行形态学观察、生理生化检测及16S rRNA测序，证实该致病菌为哈维氏弧菌(相关数据待发表)。由于该病原的致病性很强，给鲍养殖业造成了严重损害[5-7]。笔者通过预试验摸索出感染剂量和取样时点，并以表现出轻微症状但不足以致死的剂量对试验鲍进行了注射感染，以期通过注射该病原诱导鲍免疫系统的防御反应，提高免疫相关基因在文库中的表达丰度。
构建表征性强的全长cDNA文库的基础是mRNA的质量，因此, 高质量总RNA的提取非常关键。文中采用了Trizol试剂分别提取了肌肉和内脏团的总RNA，纯度及电泳带型均符合要求(图 1)。将2种RNA等比例混合后，可减少组织大小和RNA含量的差异，使各组织中的RNA比例更加均衡。由图 1的电泳结果可见，18S rRNA的条带比28S rRNA条带更清晰、明亮，这与已报道的鲍组织RNA提取结果完全一致[8, 13]。研究中采用Clontech公司开发的SMART方法，LD-PCR合成双链cDNA，进一步保证了cDNA序列的完整性[17]。文中所建文库库容达到了2.5×105 cfu · mL-1，超过通常要求的1.7×105 cfu · mL-1，能够99%覆盖任意稀有基因[18]，并且PCR检测的阳性重组率达到100%，各项参数均符合建库要求。此外，cDNA文库的高冗余率一直是制约文库应用的一个瓶颈。有报道称未经均一化处理的cDNA文库冗余率可达60%[19]，经过均一化处理后一般能降到30%左右[16]。该研究中利用DSN酶对总cDNA进行了均一化处理，有效地消除了高拷贝的基因数(图 2)、提高了稀有基因的比率，文库冗余率降到了14.37%，远超出前人的研究结果，这对今后的大规模测序和文库筛选等将十分有利。对文库中部分Unigene序列比对结果表明，虽然该文库的结果可靠，但149条Unigene中只有1/4左右的序列获得了相似性较高的比对结果，提示鲍等软体动物的基因信息资源还十分缺乏，分子生物学的研究基础还相对薄弱、亟待加强。通过测序，该研究发现了钙调蛋白(calmodulin)、组织蛋白酶(cathepsin)、蛋白酶(protease)、蛋白酶体(proteasome)等免疫相关基因。在全部获得注释结果的Unigene序列中，免疫相关基因的比例达到了15.4%(6/39)，高于其他鲍cDNA文库的报道[10, 16]。但由于该研究的测序规模较小，尚未发现新的基因序列，要获得更多的免疫相关基因信息还需进一步扩大测序规模。
综上所述，该研究建立了哈维氏弧菌感染的杂色鲍全组织cDNA文库，该文库各项指标符合要求，质量较好，对后续的免疫基因鉴定与功能研究、文库筛选、微卫星标记(EST-SSR)开发以及哈维氏弧菌的致病机理和防病、抗病相关研究等都将具有重要意义。目前，大规模测序已经展开，期待通过该方法大量获得鲍基因序列，并对可能的免疫功能基因开展深入的研究。
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图 1 肌肉和内脏团总RNA电泳
1. 肌肉总RNA；2. 内脏团总RNA
Figure 1. Electrophoresis of total RNA in muscle and visceral mass
1. muscle total RNA; 2. visceral mass total RNA
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图 2 cDNA一、二链的合成与均一化电泳图
M. DL2000 plus；泳道1. LD-PCR扩增cDNA双链结果；2~5. 分别为11个循环的Control，1/4倍DSN酶处理，1/2倍DSN酶处理和1倍的DSN酶处理；6. 1倍DSN处理的样品再次PCR扩增12个循环
Figure 2. Electrophoresis of first and second strand cDNA synthesis and homogenization
M. DL2000 plus marker; Lane 1. double strand cDNA amplified by LD-PCR; 2. 11 cycles without DSN treatment; 3. 1/4×DSN treatment; 4. 1/2×DSN treatment; 5. 1×DSN treatment; 6. 12 plus PCR cycles after 1×DSN treatment
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图 3 菌落PCR鉴定插入片段电泳图
a. 插入片段为0.5~1.0 kb的文库克隆；b. 插入片段为1.0~3.0 kb的文库克隆；M. DL2000 plus
Figure 3. Electrophoresis of colony PCR for inserted fragments
a. library clones with 0.5~1.0 kb inserted fragments; b. library clones with 1.0~3.0 kb inserted fragments; M. DL2000 plus marker
表 1 Unigene序列比对结果
Table 1 Blast result of unigenes
unigene
ID长度
length /nt相似度
identity /%E值
E ValueNCBI检索号
NCBI accession No.注释
notes原序列
origin1_A01 491 80 1.00E-49 ABW23182.1 ribosomal protein rpl27a 沙蠋属Arenicola marina 2_C04 519 80 3.00E-21 AAB09424.1 mitochondrial trifunctional protein beta subunit - 2_C09 509 80 3.00E-61 ABW23163.1 ribosomal protein rpl7a 沙蠋属A.marina 2_G01 494 80 2.00E-14 EDL85083.1 cathepsin Z, isoform CRA_a 褐家鼠Rattus norvegicus 1_A04 501 81 2.00E-34 AAB51325.1 C2f 人Homo sapiens 1_G03 496 81 5.00E-32 pdb|1E4U Chain A, N-terminal ring finger domain of human not-4 人H.sapiens 1_G05 497 81 4.00E-45 XP_967271.1 PREDICTED: similar to CG9172 CG9172-PA 赤拟谷盆Tribolium castaneum 2_B07 513 81 1.00E-59 ABO26639.1 transgelin 皱纹盘鲍H.discus discus 1_C03 509 82 8.00E-49 XP_783725.1 outer arm dynein LC3 紫海胆Anthocidaris crassispina 2_A02 496 82 3.00E-11 AAA61824.1 anti-proliferative protein - 2_A08 505 82 8.00E-59 ACJ65685.1 LIM protein 皱纹盘鲍H.discus discus 2_F10 506 83 7.00E-29 EEA73605.1 hypothetical protein BRAFLDRAFT_69314 文昌鱼Branchiostoma floridae 2_E05 419 84 9.00E-57 ABE72932.1 zona pellucida domain A 皱纹盘鲍H.discus hannai 2_G08 505 84 9.00E-47 ABO26647.1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, o subunit 皱纹盘鲍H.discus discus 2_H06 501 84 1.00E-72 BAD15288.1 78kDa glucose regulated protein 牡蛎Crassostrea gigas 1_F03 513 87 4.00E-61 ABU43069.1 60S ribosomal protein L15 杂色鲍H.diversicolor 1_F09 499 89 2.00E-34 P41384.1 Full=cyclin-dependent kinases regulatory subunit 欧洲帽贝Patella vulgata 2_F09 508 89 4.00E-76 XP_001653666.1 arp2/3 complex 20 kd subunit 埃及斑蚊Aedes aegypti 1_B01 496 90 7.00E-18 BAB32124.1 unnamed protein product 小鼠Mus musculus 1_H10 486 90 2.00E-77 BAE16013.1 ribosomal protein S5 牡蛎C.gigas 2_G02 463 92 3.00E-60 ACH56913.1 26S proteasome regulatory complex ATPase RPT2 带纳Simulium vittatum 1_C10 500 94 2.00E-56 AAM94275.1 ribosomal protein S20 栉孔扇贝Chlamys farreri Contig5 496 96 1.00E-71 ABO26685.1 ribosomal protein l17 皱纹盘鲍H.discus discus 1_A10 455 96 2.00E-62 ABO26685.1 ribosomal protein l17 皱纹盘鲍H.discus discus 1_B10 496 96 1.00E-71 ABO26685.1 ribosomal protein l17 皱纹盘鲍H.discus discus Contig2 497 97 5.00E-72 NP_001119640.2 calmodulin 豆宛豆蚜Acyrthosiphon pisum Contig3 503 97 8.00E-43 ABY87377.1 unknown protein 9 杂色鲍H.diversicolor 1_A05 503 97 8.00E-43 ABY87377.1 unknown protein 9 杂色鲍H.diversicolor 1_D05 509 97 8.00E-62 XP_001634403.1 predicted protein 星状海葵Nematostella vectensis 1_G07 496 97 2.00E-56 ABY87378.1 predicted protein 2 杂色鲍H.diversicolor 1_H07 497 97 5.00E-72 NP_001119640.2 calmodulin 豆宛豆蚜A.pisum 2_D07 488 97 1.00E-65 AAF26741.1 chlorophyll a/b binding protein precursor 乳浆大戟Euphorbia esula 1_F06 503 98 9.00E-47 ABY87346.1 unknown protein 杂色鲍H.diversicolor 1_H09 488 98 1.00E-71 ABO26682.1 ribosomal protein S14 皱纹盘鲍H.discus discus 2_F01 500 98 9.00E-84 ABO26671.1 26S protease regulatory subunit 6B 皱纹盘鲍H.discus discus 1_E06 509 99 7.00E-87 ABO26645.1 proteasome alpha type 2 皱纹盘鲍H.discus discus 2_A12 467 99 6.00E-62 ABV08873.1 actin depolymerisation factor/cofilin 杂色鲍H.diversicolor 1_H02 384 100 4.00E-41 ABY87377.1 unknown protein 9 杂色鲍H.diversicolor 2_C10 507 100 8.00E-41 AAP85231.1 tropomyosin 1 耳鲍H.asinina 
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