液熏罗非鱼片在25℃贮藏过程中生物胺的变化

蔡秋杏, 李来好, 陈胜军, 陈晓凤, 杨贤庆, 吴燕燕, 岑剑伟

蔡秋杏, 李来好, 陈胜军, 陈晓凤, 杨贤庆, 吴燕燕, 岑剑伟. 液熏罗非鱼片在25℃贮藏过程中生物胺的变化[J]. 南方水产科学, 2010, 6(5): 1-6. DOI: 10.3969/j.issn.1673-2227.2010.05.001
引用本文: 蔡秋杏, 李来好, 陈胜军, 陈晓凤, 杨贤庆, 吴燕燕, 岑剑伟. 液熏罗非鱼片在25℃贮藏过程中生物胺的变化[J]. 南方水产科学, 2010, 6(5): 1-6. DOI: 10.3969/j.issn.1673-2227.2010.05.001
CAI Qiuxing, LI Laihao, CHEN Shengjun, CHEN Xiaofeng, YANG Xianqing, WU Yanyan, CEN Jianwei. Changes of biogenic amines in liquid-smoked tilapia stored at 25 ℃[J]. South China Fisheries Science, 2010, 6(5): 1-6. DOI: 10.3969/j.issn.1673-2227.2010.05.001
Citation: CAI Qiuxing, LI Laihao, CHEN Shengjun, CHEN Xiaofeng, YANG Xianqing, WU Yanyan, CEN Jianwei. Changes of biogenic amines in liquid-smoked tilapia stored at 25 ℃[J]. South China Fisheries Science, 2010, 6(5): 1-6. DOI: 10.3969/j.issn.1673-2227.2010.05.001

液熏罗非鱼片在25℃贮藏过程中生物胺的变化

基金项目: 

农业部2007年公益性行业(农业)科研专项 3-49

国家农业产业技术体系项目 nycytx-48

国家农业科技成果转化资金项目 2009GB2E200303

国家农业科技成果转化资金项目 2010GB23260577

广东省农业重点项目 2008A020100006

广东省农业重点项目 2009B020201003

广东省海洋渔业科技推广项目 A200899B02

广东省海洋渔业科技推广项目 A200901C01

详细信息
    作者简介:

    蔡秋杏(1981-),女,硕士研究生,从事水产品加工与质量安全研究。E-mail: cindyqqcai@163.com

    通讯作者:

    李来好, E-mail: laihaoli@163.com

  • 中图分类号: S984.1;O623.73

Changes of biogenic amines in liquid-smoked tilapia stored at 25 ℃

  • 摘要:

    为考察液熏罗非鱼片在贮藏过程中生物胺的质量分数及其变化, 鱼片采用真空和普通2种包装方式在25℃下贮藏, 使用HPLC-紫外检测器分析腐胺(Put)、色胺(Try)、组胺(His)、苯乙胺(Phe)和亚精胺(Spd)5种生物胺的变化。结果表明, 5种生物胺在30min内得到有效的分离, 并且在0.25~10.0μg.mL-1质量浓度范围内呈良好的线性关系(R2 > 0.999), 最低检测限0.02μg.mL-1, 回收率73.8%~113.6%, 相对标准偏差(RSD)低于10%。在真空包装和普通包装样品中, Put的最终质量分数为(13.94±0.66)和(16.25±0.16)mg·kg-1, His为(8.76±0.17)和(6.38±0.21)mg·kg-1, Spd为(0.85±0.17)和(0.95±0.21)mg.kg-1, 而Try和Phe在贮藏全程未被检出。真空包装能明显延缓且抑制Put质量分数的增加, 但对His和Spd无影响, 且在2种包装的鱼片中检出的His均未超过国家标准。

    Abstract:

    In order to study the changes of biogenic amines(BA)in liquid-smoked tilapia slices during storage, the samples were stored in normal and vacuum packages at 25 ℃ to observe the changes of putrescine, tryptamine, histamine, phenethylamine and spermidine by HPLC-UV detector.The results indicate that the five BAs can be effectively separated within 30 min, and have a good linear relation when concentration is in the range of 0.25~10 μg·mL-1(R2 > 0.999);their lowest limit of detection(LOD)is 0.02 μg·mL-1 and the recoveries range from 73.8 % to 113.6 %; the RSDs are less than 10%.In vacuum package and normal package, the final mass fraction of putrescine are(13.94±0.66)and(16.25±0.16)mg·kg-1, respectively; histamine, (8.76±0.17)and(6.38±0.21)mg·kg-1, respectively; spermidine, (0.85±0.17)and(0.95±0.21)mg·kg-1, respectively.However, tryptamine and phenethylamine can not be detected during the storage.Vacuum package can effectively delay and inhibit the increase of putrescine, but does not affect histamine and spermidine.Additionally, the histamine content in both two packages does not exceed the national standard.

  • 生物胺(biogenic amine, BA)是脂肪族、杂环族或酯环族的低分子量有机碱,常存在于动植物体内及食品中[1]。食品中的生物胺主要是由食品中相关微生物产生的酶或食品原料中固有的酶,经催化脱去其中游离氨基酸的羧基而产生的[2]。但有人发现部分脂肪族生物胺可在活的有机体内由相应的醛通过氨基化而形成[3]。微量生物胺是生物体(包括人体)内的正常活性成分,在生物活细胞中具有重要的生理功能。当人体摄入过量的生物胺(尤其是多种生物胺同时摄入)时,会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化和呼吸紊乱等过敏反应[4],严重的还会危及生命。生物胺常存在于水产品等多种食品中,每年因食用金枪鱼、鲐鱼等鲭科鱼类而发生的中毒事件就是典型的生物胺中毒案例。由于生物胺的潜在毒性,目前有关食品中生物胺的研究已成为热点问题,对生物胺进行研究和认识可以提高和改善食品的质量及安全性。

    液熏罗非鱼片是一种新型的罗非鱼深加工技术,其以烟熏液代替木材对食品(尤其是水产品)进行熏制[5],具有低能耗、低污染和操作简单的特点,产品美味可口,具有良好的市场前景,但目前还处于初步研究阶段,要形成产业化生产尚需做很多基础工作,而考察液熏罗非鱼片的食用安全性是一项重要的基础研究工作。真空包装的熏制水产品如三文鱼在冷冻贮藏过程中已经发现了多种潜在的生物胺如组胺(His)、精胺(Sp)、酪胺(Tyr)、腐胺(Put)和尸胺(Cad)等[6],越来越多的学者把生物胺作为指示水产品质量安全的化学指标[6-7],特别是对于熏制水产品来说,生物胺作为质量指标是重要的,因为微生物计数和其他的传统化学指标[如pH和挥发性盐基氮(TVB-N)]已经不能提供充分的证据来指示该类产品的质量安全[8]。文章考察了普通和真空2种包装方式的液熏罗非鱼片在常温25 ℃贮藏过程中Put、色胺(Try)、His、苯乙胺(Phe)和亚精胺(Spd)5种生物胺的变化,旨在为研究和改善该种产品质量安全性提供理论依据。

    罗非鱼片购自广东恒发水产有限公司,由鲜活罗非鱼加工成鱼片,经真空包装后1 h内运回实验室。

    甲醇、乙腈和丙酮为色谱纯(Burdick & Jackson公司出品);丹酰氯纯度>99%(美国Sigma公司出品)。

    组胺(himstamine,99%)、β-苯乙胺(β-phenylethylamine,97%)、腐胺盐酸盐(putrescine hydrochloride,99%)、色胺(tryptamine,98%)、亚精胺(spermine, 98%)均购自Sigma公司。

    Agilent 1200高效液相色谱仪,配有Agilent 1100 G1315B DAD紫外检测器;Agilent 1100 G1313A自动进样器;Agilent 1100 G1322A真空脱气机;Agilent 1100 G1311A四元泵;Agilent 1100 G1216A柱温箱;HP化学工作站(美国Agilent公司出品);色谱柱超纯水机Millipore公司(Grace公司出品);均质机(IKA公司出品);pH计(美国Sartorius公司出品);电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司出品);离心机(德国Sigma公司出品);超净工作台(宁波江南仪器厂出品);RYX-50-XY-DL-18型烟熏炉(嘉兴市瑞邦机械工程有限公司出品)。

    对原料鱼片进行液熏加工,加工的流程为原料-腌渍-熏液浸泡-干燥-喷雾液熏-干燥-成品[9]。将液熏好的150片鱼片分为2组(每组75片,每片约100 g)包装,一组采用PE/AE真空袋进行抽真空包装,记为J组;另一组采用普通封口包装袋进行包装,记为K组。2组样品置于恒温25 ℃培养箱下贮藏。

    结合之前对液熏罗非鱼片的感观评价、pH和TVB-N值测定(文章另行发表),确定2种包装形式下样品在25 ℃贮藏条件下分析的时间,J组在第1,2,4,5,6,7,8,9和11天取样,K组在第1,2,4,5,6,7和8天取样,文中J、K下标数字表示取样天数,每组每次取4片液熏鱼片测定生物胺。

    分别称取His、β-苯乙胺、Try和Spd标准品0.010 0 g及腐胺盐酸盐标准品0.018 3 g(精确至0.000 1g)全部置于1个10 mL容量瓶中,超纯水完全溶解后定容至10 mL,得到质量浓度为1.0 mg · mL-1的混合标准储备液。然后分别制备0.25、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μg · mL-1的混合标准工作液。

    每组取2片鱼片,先全部剪碎再用组织捣碎机捣碎,称取2 g试样(精确至0.01 g),置于50 mL离心管中,加入10 mL 0.4 mol · L-1的高氯酸溶液[10],均质1 min, 3 000 rpm离心10 min,上清液移入25 mL棕色容量瓶中,重复抽提1次,合并上清液并用0.4 mol · L-1的高氯酸溶液定容至25 mL。

    吸取1.5.4得到的样品溶液1.0 mL,加入100 μL 2 mol · L-1的氢氧化钠溶液,吸取1.5.3得到的不同质量浓度的混合标准工作液1.0 mL,样品溶液和标准溶液分别置于5.0 mL棕色容量瓶中,加入300 μL饱和碳酸氢钠溶液和2 mL 10 mg · mL-1丹酰氯溶液,盖塞,40 ℃避光反应45 min,反应完毕后,加入100 μL氢氧化铵(25%~28%),静置30 min,用乙腈定容至刻度,震荡混匀,取适量溶液通过0.45 μm的滤膜,供液相色谱的测定。

    测定色谱条件。a)色谱柱: C18反相色谱柱(GraceSmart RP-18 5u,250 mm×4.6 mm),柱温40 ℃;b)流动相: 0.1 mol · L-1乙酸胺溶液(A);乙腈(B);超纯水(C);c)流速均为1.0 mL · min-1;进样量为10 μL;检测波长254 nm;d)梯度洗脱程序(表 1)。加标回收率试验。取真空包装25 ℃下贮藏10 d的样品,4份做空白,加标样中加入5种生物胺的混合标准溶液,使之相当于各添加质量浓度为1.0、2.5和10.0 μg · mL-1的混合标准品(每个质量浓度做4份平行),然后按照1.5.4~1.5.6的方法处理样品,扣除样品中空白试验生物胺的质量浓度后,求得其回收率。

    表  1  梯度洗脱程序
    Table  1  Gradient elution program
    t/min A/% B/% C/%
    0.00 5 50 45
    25.00 5 85 10
    25.10 5 50 45
    35.00 5 50 40
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    用SPSS 17.0软件的单因素方差(One-Way ANOVA)对不同包装下常温25 ℃贮藏过程中液熏罗非鱼片的5种生物胺的质量分数进行统计分析,采用Duncan ′s multiple-range test检验组间及组中差异,以P<0.05作为差异显著的要求,数据以平均值±标准偏差(X±SD)表示,用Excel 2003软件绘制生物胺的质量分数变化图。

    此试验采用乙酸铵、乙腈和水为流动相,并采用表 1所示的梯度程序洗脱。结果表明,5种生物胺能有效分离,且峰形对称,没有拖尾等现象(图 1图 2), 5种生物胺能在30 min内得到很好分离。生物胺的保留时间等相关指标见表 2。在0.25~10.00 μg · mL-1质量浓度范围内,5种生物胺显示了良好的线性相关(R2 > 0.999), 其中Put的线性回归方程图见图 3,检出限LOD > 0.02 μg · mL-1。向样品中添加3种不同质量浓度(1.0,2.5和10.0 μg · mL-1) 的生物胺混合标准溶液,平行测定4份,测得平均回收率在73.8%~113.6 %之间,相对标准偏差RSD为1.5%~7.3 %,采用此法完全分析液熏罗非鱼片, 其生物胺的分离效果好, 可完全满足检测需要。

    图  1  生物胺混标色谱图(1.0 μg · mL-1)
    Fig. 1  BA chromatogram of mix standard samples
    图  2  样品(J6-真空包装,25 ℃下贮藏6 d的样品)中生物胺色谱图
    Fig. 2  BA chromatogram of J6-vacuum packaged sample stored at 25 ℃ for 6 d
    表  2  生物胺测定的相关指标
    Table  2  Indices of BA determination
    编号
    No.
    生物胺
    biogenic amines
    保留时间/min
    retention time
    回归方程
    linear regression equation
    相关系数
    correlation coefficient
    检测限/μg·mL-1
    LOD
    平均回收率/%
    average recovery
    相对标准偏差/%
    RSD
    1 色胺Try 14.631 Y=9.714 X+1.38 0.999 19 0.09 98.8 4.4
    2 苯乙胺Phe 16.150 Y=12.259 X+0.44 0.999 92 0.07 73.8 1.5
    3 腐胺Put 18.361 Y=35.126 X+0.57 0.999 92 0.02 113.6 6.1
    4 组胺His 20.518 Y=22.412 X-0.104 0.999 97 0.04 107.9 7.3
    5 亚精胺Spd 27.411 Y=28.930 X-2.864 0.999 68 0.10 83.1 4.7
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    图  3  腐胺(Put)的线性回归方程图
    Fig. 3  Chart of linear regression equation of putrescine(Put)

    真空包装(J)和普通包装(K)的液熏罗非鱼片在常温25 ℃下贮藏的各种生物胺质量分数变化见图 4。2种不同包装的鱼片中,Put、His和Spd均呈上升的变化趋势,而Try和Phe在贮藏全程未被检出。J、K 2组间Put的差异比较显著(P<0.05),而His和Spd的差异不显著(P>0.05)(图 4)。2组检出的生物胺中,Put和His在贮藏全程的变化比较显著(P<0.05),而Spd的变化不显著(P>0.05)。

    图  4  J、K 2组液熏罗非鱼片25℃贮藏过程中生物胺质量分数的变化
    Fig. 4  Changes of BA mass fraction between groups J and K during 25 ℃ storage

    在普通包装样品中,w (Put)从第2天开始出现显著变化,w (Put)从最初的未检出,上升并最终达到(16.25±0.16)mg · kg-1(P<0.05),全程还出现2个显著变化阶段,分别是第2至第4天[w (Put)从0.84±0.06增加至7.5±0.10 mg ·kg-1] (P<0.05)以及第6至第8天[w (Put)从(9.65±0.20)mg · kg-1增加至(16.25±0.16)mg · kg-1](P<0.05),到第8天最终值为(16.25±0.16)mg · kg-1。而在真空包装中,Put在第5天前未被检出,此后才开始出现显著变化,到第9天增加至(5.67±0.39)mg ·kg-1(P<0.05)后又开始发生急剧变化,到第11天的最终值为(13.94±0.66)mg · kg-1,也即普通包装鱼片的Put出现显著性变化的时间要早于真空包装,且最终值要高。可见,真空包装能延缓并抑制Put质量分数的增加。

    而对于His来说,2种包装方式鱼片在贮藏过程的测定值差异不大(P>0.05),2组都是从第5天开始出现显著性差异,w (His)从2 mg ·kg-1左右增加到第6天的6 mg · kg-1左右(P<0.05),随后2组His都呈现平稳、缓慢的上升。受鱼片感官因素的影响,K组只测到第8天,w (His)达到(6.38±0.21)mg · kg-1,而J组最终w (His)为(8.76±0.17)mg · kg-1

    2种包装方式鱼片中Spd的测定值全程差异不大,普通和真空2种包装的最大w (Spd)分别为(0.95±0.21)和(0.85±0.17)mg · kg-1,从第4天开始,K组的测定值均大于J组,但2组间无显著性差异(P<0.05)。

    人们很早就研究发现鲭鱼、金枪鱼、沙丁鱼、鲱鱼等海洋鱼类体内含有多种生物胺[11],如His、Put、Tyr、Cad、Sp和Spd等,而发酵和熏制水产制品中则含有更高的生物胺。生物胺引起的食品安全问题也就是生物胺的毒性作用,其中His对人类健康的影响最大,口服8~40 mg His会产生轻微中毒症状,超过100 mg产生严重中毒症状。SENDRA等[12]报道,3 mg Phe会通过消除神经系统中的去甲肾上腺素使血压升高,从而引起偏头疼。Try也会引起人体血压升高,最终导致高血压病;Put和Cad会引起低血压与四肢痉挛。除了His、Tyr本身的作用外,其他生物胺的存在会增强His和Tyr的不良作用[13],Cad、Put等能够与亚硝酸盐反应生成亚硝胺等杂环类致癌物质。欧美国家及中国已经对部分食品中His质量分数做了限量要求,美国FDA要求进口水产品w (His)不得超过50 mg · kg-1;欧盟规定鲭科鱼类中w (His)不得超过100 mg · kg-1;其他食品中w (His)不得超过100 mg · kg-1[4];中国规定鲐鱼中w (His)不得超过1 000 mg · kg-1;其他海水鱼不得超过300 mg ·kg-1[14]。此研究检测到的液熏罗非鱼片最高w (His)为8.76 mg · kg-1,未超过任何标准。

    在熏制水产品如冷熏三文鱼中,JØRGENSEN等[8]发现了胍丁胺(Ag)、Put和His等多种生物胺,且其质量分数在腐败产品中存在很大的差异,有些腐败产品生物胺的质量分数为3 mg · kg-1左右,而另一些则高达200~300 mg · kg-1。据报道,一些熏制水产品所含生物胺的最高质量分数中,熏制鲱鱼w (Put)为440 mg · kg-1,熏制鲭鱼w (His)、w (Put)和w (Cad)的最高值分别为17 880、490和2 520 mg · kg-1[4],但淡水鱼制品生物胺的质量分数则少有研究报道。此研究中采用普通和真空包装的液熏罗非鱼片在25 ℃贮藏中出现Put及His的显著性升高,J、K 2组的最终w (Put)分别为(13.94±0.66)和(16.25±0.16)mg · kg-1,最终w (His)为(8.76±0.17)和(6.38±0.21)mg ·kg-1,同时Spd也出现了缓慢的上升,但2组的最终w (Spd)在1 mg · kg-1以下。而其他类型的胺类如Try和Phe则在贮藏全程均未被检出。

    水产品的包装方式会影响生物胺的产生。真空包装在抑制水产品的生物胺质量分数方面并无优越性,低温贮藏抑制效果要好于真空包装。经测定,在2与10 ℃下贮藏的水产品His的质量分数,后者比前者高约2 mg · kg-1。然而,气调包装在控制水产品中生物胺的产生方面则有一定的作用[15]。此研究发现,真空包装在抑制Put上有一定的效果,贮藏全程中J组与K组的Put质量分数有显著性差异(P<0.05),真空包装可明显延缓Put质量分数的增加,J组最终的Put质量分数要小于K组。但真空包装对His和Sed的影响不明显,这与上述研究者的结果既类似又略有不同。

  • 图  1   生物胺混标色谱图(1.0 μg · mL-1)

    Figure  1.   BA chromatogram of mix standard samples

    图  2   样品(J6-真空包装,25 ℃下贮藏6 d的样品)中生物胺色谱图

    Figure  2.   BA chromatogram of J6-vacuum packaged sample stored at 25 ℃ for 6 d

    图  3   腐胺(Put)的线性回归方程图

    Figure  3.   Chart of linear regression equation of putrescine(Put)

    图  4   J、K 2组液熏罗非鱼片25℃贮藏过程中生物胺质量分数的变化

    Figure  4.   Changes of BA mass fraction between groups J and K during 25 ℃ storage

    表  1   梯度洗脱程序

    Table  1   Gradient elution program

    t/min A/% B/% C/%
    0.00 5 50 45
    25.00 5 85 10
    25.10 5 50 45
    35.00 5 50 40
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    表  2   生物胺测定的相关指标

    Table  2   Indices of BA determination

    编号
    No.
    生物胺
    biogenic amines
    保留时间/min
    retention time
    回归方程
    linear regression equation
    相关系数
    correlation coefficient
    检测限/μg·mL-1
    LOD
    平均回收率/%
    average recovery
    相对标准偏差/%
    RSD
    1 色胺Try 14.631 Y=9.714 X+1.38 0.999 19 0.09 98.8 4.4
    2 苯乙胺Phe 16.150 Y=12.259 X+0.44 0.999 92 0.07 73.8 1.5
    3 腐胺Put 18.361 Y=35.126 X+0.57 0.999 92 0.02 113.6 6.1
    4 组胺His 20.518 Y=22.412 X-0.104 0.999 97 0.04 107.9 7.3
    5 亚精胺Spd 27.411 Y=28.930 X-2.864 0.999 68 0.10 83.1 4.7
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出版历程
  • 收稿日期:  2010-04-16
  • 修回日期:  2010-05-09
  • 刊出日期:  2010-10-04

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