Effect of bile acids on growth and body composition of cobia (Rachycentron canadum)
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摘要:
在4组等氮等能的军曹鱼(Rachycentron canadum)实用饲料中分别添加不同梯度水平的胆汁酸(0,0.015%,0.030%和0.045%),连续投喂初始体质量为(5.4±0.12)g的军曹鱼8周后,通过测定军曹鱼增重率(WGR,%)、特定生长率(SGR,%)和饲料系数(FCR),并进行肝脏成分分析和血清分析,比较各组军曹鱼生长和体组成的影响。结果表明,添加水平为0.03%组的增重率高于对照组和0.015%添加组,饲料系数低于上述2组;军曹鱼血清胆固醇和肝脏脂肪的质量分数均与饲料中胆汁酸质量分数呈负相关;4组的成活率、特定生长率、全鱼和肌肉灰分、水分质量分数没有显著性差异。由此可见,饲料中添加胆汁酸能够促进军曹鱼的生长,并能降低脂肪在军曹鱼体内中的沉积。
Abstract:To study the effect of bile acids on the growth performance and body compositon of cobia (Rachycentron canadum), we added four levels of bile acids (0, 0.015%, 0.03% and 0.045%) to four iso-energetic and iso-nitrogenous practical diets. The cobia with an initial wet weight of (5.4±0.12) g was fed for 8 weeks, and its weight gain rate (WGR, %), special growth rate (SGR, %), feed conversion rate (FCR) and liver and serum were analyzed. The results show that the WGR of 0.03% group is significantly higher than that of the control group and 0.015% group (P < 0.05), and the FCR is significantly lower than those two groups. The cholesterol in serum and the fat content of liver show a negative correlation with the bile acids amount in diets. There is no significant difference among the survival rate, SGR, ash and moisture in the whole fish body and meal. The results indicate that adding bile acid to diet can promote the growth of cobia and reduce the accumulation of body lipid.
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Keywords:
- cobia(Rachycentron canadum) /
- bile acids /
- growth /
- lipid
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孔雀石绿(MG)和结晶紫(CV)是一类三苯甲烷类染料,最先应用在纺织工艺,因其具有消毒和杀菌作用而被广泛应用于水产品的养殖过程中。由于MG和CV具有高毒、高残留和致癌、致畸、致突变等特点,当其进入生物体内,会产生具有更强危害的隐色孔雀石绿(LMG)和隐色结晶紫(LCV),因此,包括中国在内的许多国家都将MG和CV列为水产养殖中的禁用药物[1-4]。然而,由于MG和CV具有价格低廉、效果显著等优点,其在水产养殖中的使用屡禁不止,这不但对人体健康造成威胁,而且严重影响了中国水产品的出口[5];因此,如何快速、准确地测定该类禁用药物、特别是其代谢物在水产品中的残留量,对于水产品出口企业非常重要。
目前国内外检测MG、CV、LMG和LCV的分析方法有气相色谱质谱法[6]、高效液相色谱法[7-11]和液相色谱-质谱法[12-16],同时国内检测此类药物的标准方法有GB/T 19857-2005[17]、GB/T 20361-2006[18]和SN/T 1768-2006[19]等。然而,上述方法不是检出限高达不到出口要求,就是检测方法繁琐,特别是存在前处理操作步骤多、耗时较长、费用高及检测过程使用大量有毒试剂等缺点,因此,笔者在应用SN/T 1768-2006检测方法的基础上,多次利用超高效液相色谱-串联质谱对水产品中MG、CV及其代谢物的残留量进行检测,总结了一些经验,并对方法中的一些环节进行了改进。改进后的方法在FAPAS国际能力验证中得以证实,该法快速、准确、灵敏度高,完全可以达到水产品出口检测的要求。
1. 材料与方法
1.1 仪器与试剂
超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪(Waters公司出品);MASSLYNX 4.1质谱工作站软件;T10均质器(德国IKA公司出品);旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司出品);WH-3旋涡混合仪(上海沪西产);离心机(德国Beckman Coulter公司出品);CP224S电子分析天平(德国Sartorius公司出品);乙腈(Fisher色谱纯);试验用水为Milli-Q超纯水;乙酸铵(分析纯);标准品结晶紫盐酸盐购自Riedel-de公司(CV,纯度89.0%);孔雀石绿草酸盐(MG,纯度90.0%)、隐色孔雀石绿(LMG,纯度92.0%)、隐色结晶紫(LCV,纯度99.0%)及内标氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG,纯度98.5%)均购自Dr. Ehrenstorfer公司;氘代孔雀石绿购自WITEGA公司(D5-MG,纯度99.0%);标准溶液:分别准确称取适量MG、CV、LMG、LCV、D5-MG和D6-LMG标准品,用乙腈分别配制成100 μg · mL-1的标准贮备液,-18 ℃避光保存。使用前,根据需要用初始流动相配制混合标准溶液,现配现用。试验样品为斑点叉尾
(Ictalurus punctatus),取其肌肉搅碎,于-18 ℃冰箱保存备用。1.2 液相色谱条件
色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:溶剂A为乙腈,溶剂B为5 mmol乙酸铵溶液(pH=4.5),梯度洗脱条件见表 1;样品室温度10 ℃;进样体积10 μL;流速0.3 mL · min-1。
表 1 梯度洗脱条件Table 1. Gradient elution conditionst/min ϕ(乙腈)/% acetonitrile ϕ(乙酸铵缓冲液)/% ammonium acetate buffer 曲线curve 0 60 40 - 8 90 10 6 10 60 40 1 1.3 质谱条件
电喷雾离子源ESI+;毛细管电压0.7 kV;离子源温度120 ℃;锥孔反吹气50 L · h-1;脱溶剂气温度350 ℃;脱溶剂气流量650 L · h-1。第一重四极杆和第二重四极杆的低端分辨率及高端分辨率均为13;碰撞气流量0.2 mL · min-1;锥孔电压和碰撞能量见表 2,检测方式为多反应监测(MRM)扫描模式。
表 2 MRM扫描模式的参数Table 2. MRM parameters待测物analyte 母离子/m/z parent ion 子离子/m/z daughter ion 锥孔电压/V cone voltage 碰撞能量/eV collision energy 孔雀石绿MG 329.10 208.00, 313.10* 65 36, 36 隐色孔雀石绿LMG 331.10 239.10*, 315.90 50 34, 22 结晶紫CV 372.10 340.10, 356.10* 75 50, 38 隐色结晶紫LCV 374.16 238.30, 358.20* 55 32, 30 氘代孔雀石绿D5-MG 334.10 318.10* 65 40 氘代隐色孔雀石绿D6-LMG 337.16 322.10* 50 22 注:*.定量离子
Note: *. quantitative ion1.4 样品处理
准确称取已搅碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,加入适量D5-MG和D6-LMG内标混合标准溶液,使2种内标最终测定质量浓度为2 ng · mL-1(标准曲线的制作与样品处理同步,分别在空白样品中加入最终测定质量浓度为0、0.2、0.5、1.0、5.0和10 ng · mL-1的MG、CV、LMG和LCV标准溶液),加入孔雀石绿和结晶紫快速检测前处理试剂盒中的提取剂1(液体20.0 mL),用均质器以8 000 r · min-1的速度均质30 s,再加入提取剂2(固体粉末),振荡1 min,4 000 r · min-1离心5 min,取上清液4.0 mL于鸡心瓶中,40 ℃水浴减压旋转蒸干,加入2 mL初始流动相涡旋混合1 min,充分溶解残留物,0.22 μm滤膜过滤后,供上机测试。
2. 结果
2.1 LC-MS/MS分析
采用电喷雾离子源,正离子扫描模式,分别对MG、CV、LMG、LCV和D5-MG、D6-LMG监测其母离子和2个信号较强的子离子,以母离子和子离子组成监测离子对,以多反应监测模式对待测物进行定性和定量分析。该法完全满足欧盟2002/675/EC指令规定对于禁用药物的质谱确证方法需要4个确证点(IP)的要求(其中1个母离子1 IP和2个子离子2×1.5 IP),其中样品定量离子与定性离子的离子强度比不超过其标准系列相应的离子强度比均值的±20%作为定性确证的质量控制依据[20]。
在上述测定条件下,选择空白鱼肉加混合标准样品(0.5 μg · kg-1)进行测定,谱图见图 1。试验结果表明,MG、CV、LMG、LCV、D5-MG和D6-LMG保留时间分别为1.43、1.99、5.74、5.88、1.41和5.64 min。
2.2 标准曲线线性和检出限
用空白鱼肉样品作基质,加入最终测定质量浓度为0、0.2、0.5、1.0、5.0和10 ng · mL-1的MG、CV、LMG和LCV混合标准溶液(相当于样品中添加0、0.4、1.0、10.0和20.0 μg · kg-1的待测物),加入2 ng · mL-1的D5-MG和D6-LMG内标混合标准溶液,用HPLC-MS/MS进行测定。试验结果以标样质量浓度(ng · mL-1)为横坐标,以MG和CV(LMG、LCV)的标准峰面积与内标D5-MG(D6-LMG)的峰面积之比值为纵坐标制作标准曲线,线性回归方程和相关系数见表 3。以10倍信噪比计算检出限,MG、CV、LMG和LCV检出限均为0.1 μg · kg-1,满足水产品出口检测要求。
表 3 标准曲线线性回归方程及相关系数Table 3. Linear equations and correlation coefficients of standard curves待测物analyte 线性回归方程linear equation 相关系数correlation coefficient 孔雀石绿MG Y=0.7903X+0.0209 0.999 6 结晶紫CV Y=1.9924X+0.1134 0.996 0 隐色孔雀石绿LMG Y=1.0259X+0.0939 0.998 7 隐色结晶紫LCV Y=0.5141X-0.0075 0.999 7 2.3 回收率与精密度
对空白鱼肉样品在0.5和1.0 μg · kg-1 2个水平上进行加标回收试验(表 4)。试验结果表明, MG、CV、LMG和LCV的回收率在92.1%~111.0%之间,测定结果的相对标准偏差为2.2%~9.5%。
表 4 样品加标回收率及精密度(n=4)Table 4. Recovery and RSD of fortified samples待测物analyte 加标量/μg·kg-1 fortification level 平均回收率/% average recovery 精密度/% RSD 孔雀石绿MG 0.5 96.5 6.2 1.0 101.0 6.1 结晶紫CV 0.5 111.0 4.0 1.0 109.1 2.6 隐色孔雀石绿LMG 0.5 96.6 2.2 1.0 97.9 9.5 隐色结晶紫LCV 0.5 92.1 4.4 1.0 98.4 2.2 3. 讨论
3.1 方法选择及改进
目前,国内同时检测MG、CV及其代谢物的标准方法有GB/T 19857-2005和GB/T 20361-2006和SN/T 1768-2006等,但GB/T 19857-2005和GB/T 20361-2006存在检测方法繁琐,特别是前处理操作步骤多、耗时较长、费用高及检测过程使用大量有毒试剂等缺点,因此,笔者采用SN/T 1768-2006快速检测方法进行水产品出口检测。然而,由于待测物的不稳定性,完全采用SN/T 1768-2006方法检测,其MG和CV回收率偏低,而LMG和LCV回收率偏高,不能满足检测要求。该法在应用SN/T 1768-2006检测方法的基础上,采用空白样品添加不同质量浓度标准溶液的方式绘制校准曲线,以最大限度排除基体干扰。同时定量方法采用D5-MG和D6-LMG为内标进行内标法检测,降低由于前处理过程中目标化合物的损失所带来的偏差,从而提高定量的准确性,加标回收率稳定、重现性好,整个检测过程仅需30 min左右。
3.2 色谱条件的选择
研究采用了超高效液相色谱仪和1.7 μm填料的超高效液相色谱柱对样品进行分离,与传统的高效液相色谱柱相比,该法能更好地使待测物与抑制电离的基质分离,降低基质对质谱检测的影响,同时提高分离效率。对于电喷雾离子源正离子扫描模式,流动相在弱酸性环境条件下加入适量乙酸铵可以提高待测物离子化效率,因此,试验中采用乙腈和5 mmol乙酸铵溶液(pH=4.5)作为流动相体系,并且对流动相比例进行优化。结果显示,当乙腈和乙酸铵溶液初始比例为60︰40梯度洗脱条件下(表 1),待测物在6 min左右全部出峰,并且灵敏度高、分离效果好,满足检测要求。
3.3 样品溶液放置时间对检测结果的影响
由于MG、CV及其代谢物的不稳定性,文章研究了样品溶液放置时间对检测结果的影响。研究比较了4种待测物平均添加水平为3.0 μg · kg-1的鱼肉样品处理完后在10 ℃下避光放置0、30、60 min及6、12 h检测对回收率的影响。结果显示,MG和CV在研究时间内对放置时间影响较小,而LMG和LCV回收率随着放置时间的延长而呈下降趋势。与样品处理好后及时上机相比,LMG在放置30、60 min及6、12 h后检测的回收率分别下降了13%、24%、30%和34%,而LCV分别下降了10%、19%、25%和30%;因此,为了保证检测数据准确可靠,样品前处理时间不宜太长,样品处理完后应及时上机检测,可考虑对标准工作溶液和样品溶液进行穿插进样检测,特别是检测隐色代谢物。同时为了保证检测数据准确可靠,检测过程也应注意以下事项:1)整个检测过程要尽量避光,防止待测物降解;2)标准贮备液应在-18 ℃以下避光保存,有效期3个月,混合标准工作溶液应现配现用;3)待测样品应在-18 ℃以下避光保存,尽量避免样品的反复解冻;4)检测过程避免交叉污染,包括样品之间、样品与标准溶液之间等。
3.4 方法的验证
运用该法,2009年6月笔者参加了英国FAPAS(食品分析领域全球第一的国际评价体系)组织的鳗鱼中MG、CV质量分数的能力验证测试,MG、LMG、MG总量、CV、LCV和CV总量6项结果全部满意。结果表明,该法能够满足美国FDA对水产品MG、CV及其代谢物残留量检测的准确性和检出限的要求,且更加简单快速。
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表 1 试验配方以及营养组成(干物质)
Table 1 Ingredients and proximate composition of experimental diets(dry matter)
% 原料ingredient w(胆汁酸)/组别bile acid/group 0(对照) (Ⅰ) 0.015% (Ⅱ) 0.03% (Ⅲ) 0.045% (Ⅳ) 鱼粉fishmeal 45 45 45 45 小麦面筋wheat gluten 16.7 16.7 16.7 16.7 酵母粉yeast protein 2 2 2 2 鱼油fish oil 6 6 6 6 玉米油corn oil 2 2 2 2 面粉corn starch 19.8 19.8 19.8 19.8 胆汁酸bile acid 0 0.1 0.2 0.3 复合维生素vitamin premix 1 1 1 1 复合矿物盐mineral premix 0.3 0.3 0.3 0.3 磷脂lecithin oil 2 2 2 2 维生素C Vc 0.2 0.2 0.2 0.2 氯化胆碱choline chloride 0.5 0.5 0.5 0.5 K2HPO4 0.3 0.3 0.3 0.3 Ca(H2PO4)2 1 1 1 1 牛黄酸taurine 0.2 0.2 0.2 0.2 纤维素cellulose 3.0 2.9 2.8 2.7 营养组成nutrition 粗蛋白crude protein 44.97 45.47 45.12 44.66 粗脂肪crude lipid 15.95 15.59 16.17 16.31 粗灰分crude ash 9.8 9.34 9.33 10.1 注:1. 复合矿物盐(mg · kg-1饲料)包括:MgSO4 · 7H2O 1 179;FeSO4 · 7H2O 315;CoCl2 · 6H2O 45;MnSO4 · 4H2O 36;KIO3 0.45;AlCl3 ·6H2O 63;CuSO4 · 5H2O 90;NaCl 450;ZnSO4 · 7H2O 180;Na2SeO3 1.08。2. 复合维生素(mg或IU · kg-1饲料) 包括:维生素B1 60;维生素B2 200;维生素B6 40;维生素B12 0.1;泛酸钙280;烟酸800;叶酸15;肌醇400;维生素K3 40;维生素A 0.1;生物素6;维生素E 400
Note:1. Mineral premix consists of (mg · kg-1 premix): MgSO4 · 7H2O 1 179;FeSO4 · 7H2O 315;CoCl2 · 6H2O 45;MnSO4 · 4H2O 36;KIO3 0.45;AlCl3 · 6H2O 63;CuSO4 · 5H2O 90;NaCl 450;ZnSO4 · 7H2O 180;Na2SeO3 1.08. 2. Vitamin premix (mg or IU · kg-1 dry diet):thiamin hydrochloride 60;riboflavin 200;pyridoxine hydrochloride 40;cyanocobalamin 0.1;D-Ca pantothenate 280;nicotinic acid 800;folic acid 15;inositol 400;menadione 40;retinyl acetate 0.1;inositol 400;biotin 6.0;all-rac-a-tocopherol 400.表 2 军曹鱼生长以及饲料利用和成活率(X ±SD,n=4)
Table 2 Growth, SGR, FCR and survival of cobia
组别group 初始质量/g initial weight 增重率/% WGR 特定生长率/% SGR 饵料系数FCR 成活率/% survival Ⅰ 111.57±1.05 1545.25±72.56ab 4.69±0.10 1.12±0.05ab 100 Ⅱ 111.52±0.88 1530.45±48.73a 4.68±0.07 1.14±0.05b 100 Ⅲ 111.07±1.49 1618.45±28.11b 4.78±0.05 1.07±0.01a 100 Ⅳ 111.39±1.01 1608.88±20.80b 4.77±0.02 1.09±0.02ab 100 注:表中同列不同字母表示差异显著(P<0.05),后表同此
Note:Within a column, values with different superscripts are significantly different(P<0.05),the same case in the following tables.表 3 军曹鱼的肥满度、肝体比以及脏体比(X ±SD,n=4)
Table 3 CF, HIS and VSI of cobia
组别group 肥满度CF 肝体比HIS 脏体比VSI Ⅰ 0.966±0.04 2.26±0.28 10.12±0.74 Ⅱ 0.971±0.03 2.41±0.39 10.32±0.84 Ⅲ 0.968±0.05 2.31±0.39 10.68±1.12 Ⅳ 0.981±0.04 2.43±0.28 10.89±0.84 注:差异不显著(P>0.5)
Note:No significant difference(P>0.5)表 4 军曹鱼血清胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白以及低密度脂蛋白(X ±SD,n=4)
Table 4 CHO, TG, HDL, LDL of cobia
组别group 血清胆固醇CHO 甘油三酯TG 高密度脂蛋白HDL 低密度脂蛋白LDL Ⅰ 2.307±0.05b 1.110±0.020a 0.350±0.030a 0.037±0.01 Ⅱ 2.147±0.140ab 1.337±0.050b 0.420±0.020b 0.043±0.01 Ⅲ 2.110±0.110ab 1.220±0.010ab 0.447±0.030b 0.033±0.01 Ⅳ 1.960±0.080a 1.487±0.140c 0.417±0.040b 0.030±0.01 表 5 军曹鱼全鱼、肌肉以及肝脏组成(X ±SD,n=4)
Table 5 Whole body, meal and liver composition of cobia
% 组别group Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 全鱼组成whole body composition 水分moisture 69.49±0.48 70.29±0.84 70.46±0.88 70.22±0.53 蛋白protein 55.18±0.54b 56.19±0.66ab 56.20±0.57ab 56.66±0.34a 脂肪lipid 33.56±1.49a 34.81±0.87ab 32.93±1.39ab 31.39±1.20b 灰分ash 9.18±0.17 9.34±0.20 9.22±0.16 9.22±0.09 肌肉组成meal composition 水分moisture 76.08±0.30 76.07±0.17 75.46±0.45 75.87±0.50 蛋白protein 83.29±0.38ab 81.95±2.29b 84.54±0.46ab 85.15±1.20a 脂肪lipid 13.38±0.24a 12.90±1.72ab 12.75±1.77ab 10.63±0.97b 灰分ash 4.70±0.40 4.62±0.61 5.11±0.95 4.89±0.30 肝脏组成liver composition 水分moisture 46.07±1.32 44.59±2.16 44.31±0.66 44.15±2.93 蛋白protein 16.77±1.59 16.56±0.84 15.91±0.96 16.84±0.82 脂肪lipid 87.73±2.98a 85.25±1.70ab 83.25±1.26ab 79.60±4.82b -
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