亚硝酸盐是水产养殖中一种重要的污染物，容易积累甚至严重超标而引发养殖动物病害或死亡^[1-2]。亚硝酸盐可以引起水产养殖动物呼吸作用、离子调节、心血管压力调节、内分泌及排泄等多种生理代谢紊乱^[3]，低质量浓度时对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannanei)的影响则是降低其免疫能力^[4]。亚硝酸盐在自然界的消除主要通过具有硝化能力的自养细菌和具有反硝化作用或产铵异化硝酸盐还原能力的异养细菌来完成^[5]。光合细菌中的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是一种新陈代谢机制多样的紫色非硫细菌，广泛存在于土壤和水体中^[6]，具有编码同化和异化亚硝酸盐还原酶的基因^[7]，能够消除亚硝酸盐^[8]，并在畜禽饲养、水产养殖、农业种植、污水处理、医疗保健、能源和新材料等领域广泛应用^[9-12]，水产养殖中主要用于控制水体化学需氧量(chemical oxygen demand，COD)、氨氮和亚硝酸盐^{[8, 13-14]}。

珠海市农业科学研究中心的1株专利菌株沼泽红假单胞菌2-8菌株(R.palustris strain 2-8，简称2-8菌株)具有很强的亚硝酸盐消除能力，从2007年开始在斗门六乡应用于高密度凡纳滨对虾养殖生产实践，通过持续的田间应用证实其不仅能够有效净化养殖水体的亚硝酸盐，还具有增产的效果，2007~2008年冬棚养殖对虾6个月的单产折合14 844 kg · hm^-2，2008年露天养殖对虾5个月的产量折合11 235 kg · hm^-2(未发表数据)。由于各地养殖水体存在差异，水体条件如光照、溶氧、盐度和pH等会在不同的养殖时间或时期发生变化，而这些因素会对沼泽红假单胞菌的生长^[15-17]和氮、磷消除功能产生影响^[18-20]。为了探讨养殖水体光照、氧气、盐度和pH等生态因子波动对2-8菌株生长和亚硝酸盐消除的影响，了解菌株的适用水环境范围以扩大其田间应用，笔者就相关问题在室内开展了模拟研究。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   供试菌株

2-8菌株由珠海市农业科学研究中心农业微生物学实验室保藏。

1.1.2   培养基和检测试剂

参考文献[9]配制Van Niel(VN)培养基，w (NH₄ Cl) 0.1%，w (NaCl)0.2%，w (Na₂HPO₄) 0.05%，w (MgCl₂)0.02%，w (蛋白胨) 0.2%，将各组分溶解到水中，121 ℃蒸汽灭菌20 min，分别制备下列溶液并过滤除菌，1)w(NaHCO₃)10%；2)乙醇；3)0.1 mol · L^-1 H₃PO₄。在基础培养基中加入NaHCO₃溶液50 mL，乙醇2.0 mL，并用H₃PO₄调节pH 7.0。参考文献[21]配制Griess试剂用于亚硝酸盐测定。

1.2   试验方法

1.2.1   光照和氧气组合对菌株生长和亚硝酸盐消除的影响

光照和氧气组合方式参考张李阳和吴向华^[20]的方法，包括光照厌氧、光照有氧、黑暗厌氧和黑暗有氧4个处理。试验开始时，将菌浓度为10¹⁰ cfu · mL^-1的2-8菌株种子液使用新鲜VN培养基稀释到10⁶ cfu · mL^-1并分装，其中厌氧处理用磨口三角瓶中加满培养液混合物模拟，有氧处理用50 mL三角瓶中加入25 mL混合物模拟；黑暗处理用锡箔纸和黑色塑料袋包裹三角瓶模拟。每个处理设3个重复，在30 ℃、光照强度1 800 lx的恒温箱中培养，每隔24 h测定1次不同处理培养液的光密度(OD₆₆₀)，以未接菌的VN培养基为空白对照调零。亚硝酸盐消除生测参考喻国辉等^[22]的方法，组合方式、菌体初始浓度和培养条件同上，仅在体系中添加亚硝酸钠使其终质量浓度为2.4 mg ·L^-1以模拟亚硝酸盐胁迫，培养16 h后开始检测培养基中亚硝酸盐剩余值，根据剩余值计算消除的亚硝酸盐值和消除率。

1.2.2   pH对菌株生长和亚硝酸盐消除的影响

生长和亚硝酸盐消除生测体系和方法同光照厌氧处理，用1 mol · L^-1的NaOH溶液和HCl溶液将体系的pH分别调节为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，在30 ℃、光照强度1 800 lx的恒温箱中培养，并按时测定OD₆₆₀和亚硝酸盐消除情况。

1.2.3   盐度对菌株生长和亚硝酸盐消除的影响

生长和亚硝酸盐消除生测体系和方法同光照厌氧处理，使用NaCl母液将体系的w (NaCl)分别调整为0、0.2%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.6%和2.0%以模拟盐度梯度，培养条件和测定方法同上。

1.2.4   体系亚硝酸盐的测定

测定时吸取1.5 mL培养液到2 mL离心管中，离心去除菌体，上清吸到玻璃试管中，加入适量固体Griess试剂显色5 min，测定OD₅₂₀，以不加菌、其他条件相同的处理为对照校正系统误差，以不含亚硝酸盐的培养基加入Griess试剂调零。

1.3   数据分析

将获得的数据在SPSS 13.0软件包中利用单因素方差分析和LSD多重比较，分析不同处理下菌株的生长差异和对亚硝酸盐消除率的差异，并在Excel软件中作图。

2.   结果与分析

2.1   光照和氧气组合对菌株生长和亚硝酸盐消除的影响

2.1.1   光照和氧气对2-8菌株生长的影响

在光照厌氧条件下，2-8菌株生长最好，最高OD₆₆₀达0.83±0.07，其次是光照有氧，而在黑暗条件下生长速率都显著低于光照条件(图 1)。显示光照有利于2-8菌株的生长。

图  1  光照和氧气组合对2-8菌株生长的影响

注：同一时间不同处理上的小写字母表示处理间SPSS方差分析和LSD多重比较差异显著(P<0.05)，后图同此

Figure  1.  Influence of different illumination-oxygen combinations on growth of strain 2-8

Note:Different lowercase letters on the same time column indicate different treatments influence the strain′s growth significantly (P<0.05, LSD, SPSS 13.0). The same case in the following figures.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.1.2   光照和氧气对2-8菌株亚硝酸盐消除能力的影响

光照和氧的不同组合对2-8菌株的亚硝酸盐消除能力影响显著(图 2)，光照厌氧条件最利于菌株消除亚硝酸盐，在此条件下，菌株25 h的亚硝酸盐消除率达到(91.33±1.27)%，显著高于其他处理；29 h时的测定结果显示，该条件下亚硝酸盐消除率已经达到(94.46±2.75)%，而光照有氧条件下的亚硝酸盐消除率仅为(45.50±2.80)%，2种黑暗条件的亚硝酸盐消除率分别为(8.34±2.89)%和(12.18±1.96)%；42 h时，光照厌氧条件下的亚硝酸盐消除率为100%，而光照有氧条件下的亚硝酸盐消除率也达(91.32±2.69)%，黑暗条件的消除率则分别仅为(21.55±15.28)%和(45.22±2.00)%。

图  2  光照和氧气的不同组合对2-8菌株亚硝酸盐消除能力的影响

Figure  2.  Influence of different illumination-oxygen combinations on nitrite removal effect of strain 2-8

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   pH对菌株生长和亚硝酸盐消除的影响

2.2.1   pH对2-8菌株生长的影响

2-8菌株在pH 7.0的环境条件下生长良好，其最高OD₆₆₀为0.87±0.04，其次是pH 6.0，偏酸偏碱都不利于2-8菌株的生长，pH为4.0、5.0和9.0时，2-8菌株几乎不能生长(图 3)。

图  3  不同pH水平对2-8菌株生长的影响

Figure  3.  Influence of different pH levels on growth of strain 2-8

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2.2   pH对2-8菌株亚硝酸盐消除能力的影响

生测体系的pH对2-8菌株亚硝酸盐消除能力影响显著，偏酸和偏碱环境不利于菌株的亚硝酸盐消除(图 4)。生测体系pH为4.0和9.0时，菌株基本不利用亚硝酸盐；生测体系pH为5.0时，菌株可以消除亚硝酸盐，但消除能力受到严重影响，到40 h时，亚硝酸盐的消除率仍然只有(44.87±3.16)%，显著低于其他处理；菌株在pH 7.0的环境条件下亚硝酸盐消除能力最强，在第25小时，体系的亚硝酸盐消除率已经达到(95.58±4.34)%，显著高于其他处理；pH 6.0和8.0对2-8菌株的亚硝酸盐消除有一定的影响，主要是使体系亚硝酸盐的消除时间延长，第28小时pH 6.0条件下菌株的亚硝酸盐消除率为(48.25±1.58)%，pH 8.0条件下菌株的亚硝酸盐消除率为(10.67±2.03)%，而此时pH 7.0条件下菌株的亚硝酸盐消除率达到了100%；到第40小时，这2个处理的消除率分别达到(97.52±0.59)%和(93.45±1.12)%。

图  4  pH对2-8菌株亚硝酸盐消除能力的影响

Figure  4.  Influence of different pH levels on nitrite removal effect of strain 2-8

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   盐度对菌株生长和亚硝酸盐消除的影响

2.3.1   w (NaCl)对2-8菌株生长的影响

2-8菌株在w (NaCl)为0%~0.80%范围内生长良好且在0.40%生长最好，其最高OD₆₆₀为1.26±0.14，随着w (NaCl)的升高，2-8菌株生长状况直线下降，在w (NaCl)为2.00%时，其最高OD₆₆₀仅为0.51±0.065(图 5)。

图  5  w (NaCl)对2-8菌株生长的影响

Figure  5.  Influence of different NaCl concentrations on growth of strain 2-8

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3.2   w (NaCl)对2-8菌株亚硝酸盐消除能力的影响

用w (NaCl)模拟的盐度水平测试显示，虽然菌株在所测定的盐度范围内最后都能将体系的亚硝酸盐消除，但高盐度的环境延缓了消除效果的发挥(图 6)。w (NaCl)在0%~0.8%的水平下，菌株在第24小时可以将体系中亚硝酸盐消除98%以上，而此时w (NaCl)1.2%~2.0%处理的消除率仅为6.93%~21.99%，到第40小时，w (NaCl)为1.2%、1.6%和2.0%处理的亚硝酸盐消除率分别为100%、(94.28±3.30)%和(75.80±12.37)%。

图  6  w (NaCl)对2-8菌株亚硝酸盐消除能力的影响

Figure  6.  Influence of different NaCl concentrations on nitrite removal effect of strain 2-8

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

亚硝酸盐污染是凡纳滨对虾养殖生产实践中仅次于病害的第二大制约因子，常与病害同时出现，严重影响了对虾养殖的健康发展。光合细菌在水产养殖中被广泛用于水质净化，发挥有益菌和生物饵料的作用^[13]。文章研究的2-8菌株在光照厌氧环境中生长最好，但在光照有氧时的生长和对亚硝酸盐消除能力也较强，适合在对虾养殖水体中生长繁殖和应用；pH中性或偏酸时菌株的生长最好，与倪黎纲等^[23]报道的相似；pH 7.0时亚硝酸盐消除功能最好，与张李阳和吴向华^[20]的结果类似；但菌株在pH 8.0时40 h亚硝酸盐的消除率也可以达到(93.45±1.12)%，能够满足生产实践的需要，可见2-8菌株的生长和功能发挥的pH水平与养殖水体的实际pH水平能够吻合；2-8菌株在低盐度的水体中繁殖能力较强，盐度超过12，繁殖能力明显受到抑制，亚硝酸盐的消除能力在24 h内受到盐度的影响较大，并有随盐度增加而所受影响增大的现象，显示菌株较适应珠三角的池塘养殖，尤其是养殖后期，水体盐度在0~4之间波动，与菌株生长和亚硝酸盐功能发挥的最佳盐度水平非常吻合。