Influence of illumination,oxygen,pH and salinity on growth and nitrite removal effect of Rhodopseudomonas palustris strain 2-8
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摘要:
以1株具有亚硝酸盐消除能力的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)2-8菌株(简称2-8菌株)为材料, 研究了不同光照和氧组合、pH、盐度对菌株生长和亚硝酸盐消除能力的影响。结果发现, 光照厌氧条件最利于2-8菌株的生长, 该条件下菌株亚硝酸盐消除能力最强, 25h消除率达(91.33±1.27)%;菌株在pH7.0时生长和亚硝酸盐消除能力最强, 25h亚硝酸盐消除率达到(95.58±4.34)%, 在pH9.0以上和5.0以下时基本不生长;菌株在w(NaCl)为0和0.4%的培养基中生长和亚硝酸盐消除能力最强, 在w(NaCl)为0.8%~2.0%的培养基中, 生长和亚硝酸盐消除能力随w(NaCl)增高而减弱。测定的4个环境因子主要通过影响菌株的生长来影响其对亚硝酸盐的消除能力。
Abstract:We used Rhodopseudomonas palustris strain 2-8, a denitrifying non-sulfur photosynthetic bacterium, to study its growth and nitrite removal effect with different illumination-oxygen combinations, pH level and NaCl concentrations.The results show that illumination without oxygen is best for the strain′s growth and nitrite removal, with a nitrite removal efficiency of (91.33±1.27)% after 25 h inoculation;pH 7.0 is best for its growth and nitrite removal, and the nitrite removal efficiency reaches (95.58±4.34)% after 25 h inoculation, however, it does not grow at pH below 5.0 or above 9.0.Moreover, the strain grows best and removes nitrite most quickly with NaCl culture medium of 0.0% or 0.4%, but with a 0.8%~2.0% NaCl concentration, its growth and nitrite removal effect weaken with the increasing concentration.These four environmental factors influence the nitrite removal effect of stain 2-8 by influencing its growth.
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Keywords:
- nitrite removal /
- Rhodopseudomonas palustris /
- growth
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盐度是与海水鱼类生长和繁育有着密切关系的外在环境因素之一，对海水鱼类的生长繁殖具有重要的影响，尤其在进行海水鱼类的人工繁殖和种苗培育时，盐度更是重要的环境因子。有关盐度对海水鱼类胚胎和早期仔鱼发育影响的研究国内外已见有不少文献报道，所涉及的研究种类有大西洋油鲱(Brevoortia tyrannus)[1]，黑鲷(Sparus macrocephalus)[2]、花鲈(Lateolabrax japonicus)[3]、NFDBF状黄姑鱼(Nibea miichthioides)[4]、梭鱼(Liza haematocheila)[5]、鲻(Mugil cephalus)[6]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[7]、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)[8]以及鲯GF6FA (Coryphaena hippurus)和遮目鱼(Chanos chanos)[8-9]等。
卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)，俗称黄腊鲳、黄腊鲹、卵鲹、短鳍鲳鲹、金鲳、红杉、红沙等[10]，隶属于鲈形目(Perciformes)鲹科(Carangidae)鲳鲹亚科(Trachinotinae)鲳鲹属，广泛分布于印度洋和太平洋的温暖水域，在中国东海、南海和黄海均有分布。卵形鲳鲹是海水养殖优质的种质资源，是近年来海湾深水网箱养殖的重要鱼类之一。近年来，国内外陆续开展了对卵形鲳鲹人工繁育技术的研究[11-12]，但尚未见有关盐度对该鱼早期发育影响的文献报道。文章研究观察了卵形鲳鲹受精卵在不同盐度中的沉浮性，测定其在不同盐度海水中的孵化率、初孵仔鱼的畸形率以及仔鱼在不投饵条件下的存活系数(survival activity index，SAI)，旨在为卵形鲳鲹的种苗生产提供参考依据，并为该种类的发育生物学研究积累基础资料。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验用卵形鲳鲹于2008年4月取自南海水产研究所深圳试验基地，亲鱼自然产卵后立即用手抄网收集漂浮在水表面的受精卵运回实验室。选取一批由质量好的受精卵在适宜水温和盐度条件下孵化的仔鱼，挑选其中肉眼观察体形正常、活力好的个体用做不同盐度下SAI的观察试验。
1.2 盐度的配制及试验设计
试验用水为经沉淀及沙过滤的当地自然海水，温度为26.8±1.4 ℃，盐度28.2±0.8。
1.2.1 试验用水处理
供试海水均经过历时36 h以上的黑暗沉淀，再经沙池过滤及紫外线消毒。盐度试验所需高盐度海水用普通海水与加盐后的海水调配，低盐度海水用普通海水加淡水调配而成，用日产ATAGO型折光计测定海水盐度。
1.2.2 不同盐度对受精卵沉浮的影响
试验在盐度5.0~50.0范围内共设置10个盐度梯度组，每个盐度梯度为5，各设置3个平行，数据计算时取其平均值。用1 L烧杯作为试验容器，各放入100粒受精卵。试验开始时卵细胞还没有开始分裂，观察其在各种盐度海水中的沉浮状态。
1.2.3 不同盐度对胚胎发育的影响
设置10个海水盐度梯度(同1.2.2)，采用1 L烧杯做实验容器，取受精卵100个。试验过程中用空气压缩机连续微充气，室温培育(温度26.8±1.4 ℃)，待仔鱼破膜孵化后，观察仔鱼的孵化率和畸形率；孵化率和畸形率取3个平行组的平均值；孵化率为孵出成形的仔鱼与放入受精卵的比值。畸形仔鱼指油球异位或异数、尾部或脊柱弯曲的个体。
1.2.4 不同盐度下仔鱼SAI的测定
试验共设置8个盐度梯度组：10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0和45.0；实验容器采用1 L烧杯，各放入100尾初孵仔鱼，置于实验室内阴凉通风处(水温26.8±1.4 ℃)，试验期间不充气，不投喂，每天用玻璃吸管吸去死亡的仔鱼，记录存活的仔鱼尾数，一直到所有仔鱼全部死亡为止。仔鱼SAI计算公式如下：
$$ \mathrm{SAI}=\sum\limits_{i=1}^k\left(N-h_i\right) \times i / N $$ 式中N为试验开始时的仔鱼尾数，k为仔鱼全部死亡所经历的时间(天数)，hi为第i天仔鱼的累积死亡尾数。
1.3 相关生物学指标的确定
试验期间，定期观察并记录各试验胚胎组的发育情况。胚胎孵化时间(h: min)指从卵受精开始到约有50%以上鱼苗孵化出膜所经历的时间；孵化率(%)指全部孵出的仔鱼尾数与受精卵总数的比率×100；胚胎发育的适宜盐度范围指孵化率不低于50%的盐度范围[13]。
1.4 统计方法
应用Excel和SPSS统计软件进行分析，计算其平均值和标准差，并对变化趋势进行回归等相关分析。
2. 结果
2.1 不同盐度对卵形鲳鲹受精卵沉浮的影响
卵形鲳鲹受精卵圆形、透明、浮性、单油球，卵径为1.2 mm，油球径为0.16 mm，每1 g受精卵的数量约1 000~1 200粒。从观察结果可以看到，在相对静止的水环境条件下，卵形鲳鲹受精卵在盐度25.0以下时全部沉到烧杯的底部；当盐度在30.0时50%浮在中层，其余50%沉底；当盐度35.0以上时全部浮在水的表面(表 1)。
表 1 卵形鲳鲹受精卵在不同盐度下的沉浮情况Table 1. Buoyancy observation of T.ovatus fertilized eggs at different salinities盐度 salinity 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 状态 state 沉 沉 沉 沉 沉 半浮沉 浮 浮 浮 浮 2.2 不同盐度对卵形鲳鲹胚胎发育的影响
观察到在室温26.8±1.4 ℃，盐度15.0~45.0条件下，卵形鲳鲹受精卵经20 h左右孵化出仔鱼，盐度变化对孵化时间的影响不大。当盐度较低(5.0~10.0)时，胚盘于受精后4~6 h起呈现严重扩散和融合状，分裂球间界线模糊不清，胚胎在受精后6~8 h即发育到多细胞期至高囊胚期间死亡；在盐度最高(50.0)组，胚盘在受精后4~6 h开始出现收缩，分裂球界线模糊不清，而且随着盐度的升高胚盘加剧收缩，当发育到多细胞期至高囊胚期间形成死胚。试验结果显示，卵形鲳鲹胚胎在盐度15.0~45.0之间都能完成发育过程并孵化出仔鱼；盐度低于15.0或高于45.0时都无法孵化出仔鱼。总孵化率与盐度变化呈反抛物线形分布，其回归关系可用y=-0.0025x2+0.1409x-1.0557(R2=0.9607，P < 0.05)来表达，畸形率呈正抛物线形分布，其回归关系可为y=0.0023x2-0.1214x+1.8500(R2=0.9572，P < 0.05)，计算可得在微充气的试验条件下，卵形鲳鲹胚胎孵化的适盐范围为14.9~39.4，孵化率为50.4%~63.7%，畸形率在55.17%~63.72%。最适盐度为26.0~28.2，孵化率为91.2%~93.4%，畸形率为25.00%~26.60%(图 1)。
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图 1 盐度对卵形鲳鲹胚胎形成、总孵化率、畸形率的影响Figure 1. Effects of salinity on embryo formation, total hatching rate and abnormality of T.ovatus2.3 不同盐度下卵形鲳鲹仔鱼SAI的测定
卵形鲳鲹仔鱼从孵化后3日龄开始能够从环境中摄食，进入内源营养和外源营养混合期的生长发育阶段，在盐度25.0~30.0的试验范围内，SAI为44.19~47.44，仔鱼的活力较强(表 2)。盐度10.0时，SAI为3.17，仔鱼在开口或开口后1 d全部死亡；盐度15.0时，SAI为16.43，并在4日龄时存活率下降到70%以下；盐度35.0~40.0时，SAI为13.26~24.66，仔鱼的畸形率较高，活性较差；盐度达到45.0时，SAI仅为1.00，第2天均全部死亡。从表 2中所列的SAI可见，卵形鲳鲹早期仔鱼发育的最适盐度范围应在25.0~30.0之间。
表 2 盐度10.0~45.0条件和饥饿状态下卵形鲳鲹仔鱼成活率和生存活力指数Table 2. Survival rate and SAI of larval T.ovatus under starvation at salinity of 10.0~45.0盐度
salinity仔鱼不同天数的成活率/%
the survival rate of larval on different daysSAI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 10.0 100 52 37 8 0 0 0 0 0 0 0 0 3.17 15.0 100 88 74 69 54 45 13 2 0 0 0 0 16.43 20.0 100 93 90 85 84 83 54 34 16 2 0 0 26.18 25.0 100 98 95 95 93 88 86 73 70 60 4 0 44.19 30.0 100 99 98 98 98 89 89 86 85 60 12 0 47.44 35.0 100 96 93 90 89 80 70 15 0 0 0 0 24.66 40.0 100 85 70 63 49 35 13 6 0 0 0 0 13.26 45.0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.00 3. 讨论
3.1 不同盐度对鱼类受精卵沉浮的影响
在不同盐度范围内，受精卵在水层中的分布情况有所不同。此试验中，卵形鲳鲹受精卵在盐度小于25.0时全部沉底；在盐度大于35.0时全部为浮性。花尾胡椒鲷(Plectorynchus cinctus)的受精卵在盐度小于26.47的海水中全部为沉性，在大于30.12的海水中则呈现为浮性[14]。在试验温度下，点带石斑鱼(E.malabaricus)受精卵的相对比重与盐度30或31的海水比重相当，大致界于1.020~1.021之间[15]。高体NFDA4 (Seriola dumerili)受精卵在盐度为30.0以下呈沉性；在盐度32.0以上的海水呈浮性[16]。黄鲷(Dentex tumifrons)在相对静止的环境条件下，其胚胎在盐度32.0以下的海水时全部都沉到容器底部；在盐度33.0时40%的胚胎浮在水体中层, 60%沉底；在34.0时90%的胚胎分布于水体中间，呈现悬浮状态，10%的胚胎浮在水体表面；在35.0时40%的胚胎呈悬浮状态，60%的胚胎浮在水体表面；在盐度36.0以上时胚胎全部浮在水的表面[17]。在26.8~29.5 ℃条件下，军曹鱼(Rachycentron canadum)受精卵在盐度26.0以下的海水中呈现完全沉性；在盐度29.0时呈现半沉浮状态，大多数的受精卵悬浮在水体的中间；在盐度32.0以上的海水中受精卵呈现完全浮性[18]。由此可见，鱼类卵子在不同盐度水中的沉浮状态具有种间差异。因此，在种苗繁育过程中，为了获得高的成活率，应根据不同鱼类受精卵的沉浮特性，调整好生产用水的盐度，使之处于悬浮状态，以避免因盐度过低，受精卵下沉堆积，胚胎无法摄取充足的溶氧。
3.2 不同盐度对鱼类胚胎和早期仔鱼发育的影响
鱼类卵的发育实际上受渗透压的调节。随着胚胎和仔鱼的发育，渗透调节的能力和过程都在变化。在早期胚胎发育过程中，渗透调节是有积极意义的，调节主要归因于细胞质膜的半渗透性和胚盘细胞的紧密连接[19]。盐度主要影响鱼类卵内渗透压的稳定性，在适盐范围内，卵内渗透压可通过自身调节保持在相对稳定的水平，故而有较高的孵化率。因此，海水鱼类的早期发育都有一定的适盐范围。外界水环境的高渗作用会促进鱼类胚胎发育的进程，缩短其孵化时间。但若海水的盐度过高、培育周期太短，则会影响鱼类胚胎发育的正常进行，结果造成孵出的仔鱼成活率低、对环境变化的耐受力差。低盐度条件下孵化率较低，低盐度影响了卵胚胎发育过程的能量消耗、利用规律和效率，使卵黄和油球内营养物质不能正常地转化为胚胎内组织的生长所需，从而破坏其正常的胚胎发育进程，导致孵化时间延长。根据受精卵的孵化时间、孵化率和畸形率等指标来判断，斜带石斑鱼(E.coioides)受精卵孵化的适宜盐度范围为15.0~45.0，以20.0~30.0为最适盐度[20]。高体NFDA4胚胎的最适发育盐度为32.0~35.0，当盐度低于30.0时，仔鱼的孵化率及成活率都呈现出明显的下降趋势[16]。赤点石斑鱼受精卵发育的适宜盐度为24.0~38.0，最适盐度为27.0~35.0，盐度高于35.0，孵化率随盐度的升高而降低、仔鱼畸形率随之升高[21-22]。与上述几种海水鱼类相比，卵形鲳鲹胚胎孵化的适盐范围与斜带石斑鱼相似，较赤点石斑鱼宽，但最适盐度范围比斜带石斑鱼窄，比赤点石斑鱼宽。这可以反映出卵形鲳鲹早期生活阶段的适盐性与一般海水鱼类大致相同。
3.3 SAI与仔鱼活力的关系及其应用
日本在海水鱼类种苗生产中，常用SAI来判断早期仔鱼的活力①。在不投饵的情况下，初孵仔鱼仅靠自身携带的卵黄营养可存活一定的时间。存活时间的长短受其卵黄营养物质的质量和数量影响[22]。在无投饵(饥饿)和静水的条件下，观察仔鱼的耐受能力及存活天数，SAI越大，表明仔鱼的活力越强，用于种苗生产时成活率则较高。根据对目前不少开展人工繁育的海水鱼类的观察，SAI小的仔鱼，往往在第3~4天就会死亡，应整批弃之不用。从不同盐度下仔鱼SAI的变化结果来看，卵形鲳鲹在适宜的盐度内，仔鱼的SAI较高，反之则低。这也表明盐度对仔鱼活力的影响程度，从中得出仔鱼存活的适盐范围②。卵形鲳鲹仔鱼在盐度为25.0和30.0的2个组仔鱼的SAI最高，分别为44.19和47.44；经深入观察，在这2组条件下，仔鱼发育及摄食正常，这与盐度对胚胎发育影响的范围几乎一致，这也表明适时调节培育用水的盐度，是种苗生产工艺流程中一个重要的环节。
① KEINOSUKE I.日本栽培渔业协会在海水鱼人工孵化方面的最新进展[J].刘少明，译.南海研究与开发，1995(3)：78-81.
② LI Jiaer, LEE Chengsheng, BANNO J E.Influence of salinity and temperature on the development and hatching in gdolphin fish, Coryphaena hippurus L[J].南海水产研究，1994(8)：65-74.
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图 1 光照和氧气组合对2-8菌株生长的影响
注：同一时间不同处理上的小写字母表示处理间SPSS方差分析和LSD多重比较差异显著(P<0.05)，后图同此
Figure 1. Influence of different illumination-oxygen combinations on growth of strain 2-8
Note:Different lowercase letters on the same time column indicate different treatments influence the strain′s growth significantly (P<0.05, LSD, SPSS 13.0). The same case in the following figures.
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图 2 光照和氧气的不同组合对2-8菌株亚硝酸盐消除能力的影响
Figure 2. Influence of different illumination-oxygen combinations on nitrite removal effect of strain 2-8
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图 3 不同pH水平对2-8菌株生长的影响
Figure 3. Influence of different pH levels on growth of strain 2-8
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图 4 pH对2-8菌株亚硝酸盐消除能力的影响
Figure 4. Influence of different pH levels on nitrite removal effect of strain 2-8
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图 5 w (NaCl)对2-8菌株生长的影响
Figure 5. Influence of different NaCl concentrations on growth of strain 2-8
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[1] 徐培峰,曾宪凯. 南美白对虾淡水养殖中亚硝酸盐危害分析与对策[J]. 渔业现代化,2006(2):38-39. doi: 10.3969/j.issn.1007-9580.2006.02.015 [2] 高明辉, 马立保, 葛立安, 等. 亚硝酸盐在水生动物体内的吸收机制及蓄积的影响因素[J]. 南方水产, 2008, 4(4): 73-79. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2008.04.014 [3] JEBSEB F B. Nitrite disrupts multiple physiological functions in aquatic animals[J]. Comp Biochem Physiol A: Mol Integr Physiol, 2003, 135(1): 9-24. doi: 10.1016/S1095-6433(02)00323-9
[4] 黄翔鹄, 曾宪凯, 郑莲, 等. 亚硝酸盐氮对凡纳滨对虾毒性和抗病相关因子影响[J]. 水生生物学报, 2006, 30(4): 466-471. doi: 10.3321/j.issn:1000-3207.2006.04.016 [5] 王安利, 郑桂丽, 廖绍安, 等. 虾池中具有降解硝酸盐或亚硝酸盐能力的细菌多样性[J]. 生态学报, 2007, 27(5): 1937-1944. doi: 10.3321/j.issn:1000-0933.2007.05.033 [6] TABITA F R, HANSON T E. An oxygenic phototrophic bacteria[M]//FRASER C M, READ T D, NELSON K E. Microbial genomes. Totowa, New Jersey, USA: Humana Press, 2004: 225.
[7] LARIMER F W, CHAIN P, HAUSER L, et al. Complete genome sequence of the metabolically versatile photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris[J]. Nat Biotechnol, 2004, 22(1): 55-61. doi: 10.1038/nbt923
[8] 刘芳, 王敏, 杨慧, 等. 净化养殖水体紫色非硫光合细菌的筛选与鉴定[J]. 中国生物工程杂志, 2008, 28(8): 91-95. doi: 10.3969/j.issn.1671-8135.2008.08.017 [9] 刘如林, 刁虎欣, 梁凤来, 等. 光合细菌及其应用[M]. 北京: 中国农业科技出版社, 1991. [10] 杨启银, 曩潇潇, 何瑶, 等. 富硒沼泽红假单胞菌对D-半乳糖小鼠肝细胞修复作用的研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 497-501. doi: 10.3321/j.issn:1002-6630.2007.10.126 [11] 岳文洁, 刘春, 张小凡. 沼泽红假单胞菌累积聚β-羟基丁酸的研究[J]. 环境科学与技术, 2007, 30(4): 26-28. doi: 10.3969/j.issn.1003-6504.2007.04.010 [12] 王永忠, 廖强, 朱恂, 等. 序批式培养沼泽红假单胞菌光照产氢的能量分析[J]. 太阳能学报, 2009, 30(3): 390-396. doi: 10.3321/j.issn:0254-0096.2009.03.022 [13] 刘朝阳, 孙晓庆. 生物控制法在水产养殖水质净化中的综合应用[J]. 南方水产, 2007, 3(1): 69-74. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2007.01.012 [14] QI Zizhong, ZHANG Xiaohua, BOON N, et al. Probiotics in aquaculture of China-current state, problems and prospect[J]. Aquac, 2009, 290(1/2): 15-21. doi: 10.1016/j.aquaculture.2009.02.012
[15] 黄宁宇, 来琦芳. 三种光合细菌不同生态环境下的生长试验[J]. 海洋渔业, 2004, 26(3): 194-204. [16] 徐姗楠, 邱宏端, 林娟, 等. 紫色非硫光合细菌的分离鉴定及其功能研究[J]. 福州大学学报: 自然科学版, 2004, 32(2): 246-251. doi: 10.3969/j.issn.1000-2243.2004.02.027 [17] 周茂洪, 赵肖为, 周峙苗. 几种重金属离子对光合细菌生长的抑制效应[J]. 生态学杂志, 2002, 21(4): 6-11. https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/stxzz200204002 [18] 周茂洪, 王荟沪, 岑宇. Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cu2+对光合细菌沼泽红单胞菌的生长及净化氮、磷能力的影响[J]. 生态科学, 2002, 21(1): 55-58. [19] 蔡慧农, 倪辉, 苏文金. 沼泽红假单胞菌培养基的优化及降氨氮作用的研究[J]. 集美大学学报: 自然科学版, 2007, 12(3): 199-203. doi: 10.3969/j.issn.1007-7405.2007.03.002 [20] 张李阳, 吴向华. 不同条件光合细菌同化磷能力的初步探究[J]. 南京晓庄学院学报, 2004, 20(4): 1-4. doi: 10.3969/j.issn.1009-7902.2004.04.001 [21] 国家环保局《水和废水监测分析方法》编委会. 水和废水监测分析方法[M]. 3版. 北京: 中国环境科学出版社, 1989: 260-263. [22] 喻国辉, 陈远凤, 陈燕红, 等. 一株高效利用亚硝态氮的沼泽红假单胞菌及其应用: 中国, ZL200710089906.5[P]. 2007-10-10. https://www.zhangqiaokeyan.com/patent-detail/06120105249595.html [23] 倪黎纲, 王志鹏, 罗方妮, 等. 氧、光照时间、pH等理化因子影响光合细菌生长的研究[J]. 内陆水产, 2004(3): 41-42. doi: 10.3969/j.issn.1674-9049.2004.03.03
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