Molecular cloning and characterization analysis of glutathione peroxidase 1 from Nile tilapia (Oreochromis niloticus)
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摘要:
采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术，克隆了罗非鱼(Oreochromis niloticus)谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase1，GPx1)基因完整的编码序列(complete coding sequence，CDS)。GPx1基因全长984 bp，5′UTR 56 bp，CDS 576 bp，3′UTR 352 bp，PolyA 20 bp；第791~885位碱基(位于3′UTR)形成1个硒半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence，SECIS)，协助174~176位密码子TGA(UGA)编码1个硒半胱氨酸(Sec)。GPx1包含191个氨基酸，分子量21.8 kDa，等电点8.04，无信号肽和潜在的N-糖基化位点。蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白。序列比对显示，GPx1单体具有Sec、Trp、Gln和Asn构成的催化四联体。罗非鱼GPx1与其他脊椎动物GPx1相比较，核苷酸序列相似性为43.2%~58.2%，氨基酸序列相似性为58.1%~80.6%。进化分析显示，处在分类学上不同纲的脊椎动物GPx1分别占据了不同分支。利用Swiss-Model预测了罗非鱼GPx1的3D结构，序列分析显示，GPx1可以形成1个同源四聚体。
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关键词:
- 罗非鱼 /
- 谷胱甘肽过氧化物酶1 /
- 基因克隆
Abstract:The complete coding sequence of glutathione peroxidase 1 (GPx1) of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) was cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE).The GPx1 contains 984 bp, including a 56 bp 5′-untranslated region, a 576 bp coding sequence (CDS), a 352 bp 3′-untranslated region and a 20 bp PolyA tail. A selenocysteine (Sec) was encoded by the unusual stop codon, TGA, with the selenocysteine insertion sequence (SECIS) located at 3′UTR. The GPx1 was predicted to encode 191 amino acids, and its molecular weight was 21.8 kDa with a pI of 8.04; neither signal peptide nor N-Glycosylation site was found. The analysis showed that GPx1 was a non-transmembrane protein, and it possessed classic catalytic tetrad comprising selenocysteine, tryptophan, glutamine and asparagine. We compared GPx1 between Nile tilapia and other vertebrate animals, and found that the similarity of nucleotide acid sequence was 43.2%~58.2%, and that of amino acid sequence was 58.1%~80.6%. Phylogenic analysis indicated that GPx1s of different classes of vertebrates split into different clusters. The 3D structure of tilapia GPx1 was predicted with Swiss-Model software, and sequence analysis suggested that GPx1 was homotetrameric.
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Keywords:
- Oreochromis niloticus /
- glutathione peroxidase1 /
- gene cloning
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谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)广泛存在于生物体中，是生物机体内重要的抗氧化酶之一，其活性中心含有1个硒代半胱氨酸(Sec)，可以清除机体内的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，阻断其对机体的进一步损伤，与体内的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)一起构成了机体的抗氧化防御体系[1-2]。
脊椎动物GPx的研究得到广泛开展，在哺乳动物中，GPx催化机理[3-4]、结构、功能和进化[5-7]等方面的研究日益深入。鱼类属低等脊椎动物，GPx在基因克隆、组织分布[8-9]、生长状况评价以及环境标志物(biomarker)应用等方面也得到逐步开展。目前已克隆到斑马鱼(Danio rerio)GPx1，金枪鱼(Thunnus maccoyii)GPx1，条石鲷(Oplegnathus fasiatus)GPx1，草鱼(Ctenopharyngodon idella)GPx1，日本鳗鲡(Anguilla japonica)GPx1的完整编码序列(complete coding sequence，CDS)。GPx表达量反映鱼体氧化还原水平，是评价鱼类生长状况的常用生化指标[10-11]。水体受到重金属、农药等污染会导致鱼体GPx表达量增加，因此，GPx也被用作监测水体环境污染的生物标志物[12-13]。
罗非鱼(Oreochromis niloticus)是联合国粮农组织向世界各国推荐的养殖鱼类之一，中国罗非鱼养殖产量居世界首位，但对其GPx全长CDS基因克隆的研究尚未见报道。该研究通过RT-PCR和RACE方法从罗非鱼肝脏克隆了谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx1)，并对其进行了生物信息学分析，为研究罗非鱼抗氧化防御体系中GPx1的结构与功能奠定了理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物
罗非鱼，体质量80~100 g，采集于笔者研究室实验鱼类养殖场。
1.1.2 菌株、试剂
Trizol购自Invitrogen公司，cDNA第一链合成试剂盒、Taq酶、TdT酶、pMD18-T载体、SYBR green premix购自TaKaRa公司，凝胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Axygen公司，TOP10工程菌为笔者实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 cDNA第一链的合成
用0.01%的H2O2浸泡罗非鱼，诱导GPx表达。0.5 h后取罗非鱼肝脏组织，参照Trizol说明书提取RNA，参照PrimeScript cDNA第一链合成试剂盒说明书，反转录cDNA第一链。
1.2.2 罗非鱼GPx1基因中间片段的克隆
根据已知的脊椎动物GPx1基因，使用Oligo 6.0软件设计简并引物GPXS1/GPXR1(表 1)，以cDNA第一链为模板，合成罗非鱼GPx1中间片段，PCR程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段与pMD18-T载体连接，转化到Top10菌株中，送华大基因科技深圳分公司测序。
表 1 GPx1基因扩增引物序列表Table 1. Primers used in GPx1 cloning引物名称primer 序列(5′~3′) sequence(5′~3′) GPXS1 CAGTTYGGCCAYCARGA GPXR1 AGRAACTTYTCRAARTTCCA LGPXS2 AGAAGGTGGATGTGAATGGA LGPXS3 TGATGCCCTGGGTCTCAT LGPXR2 TATCTGCCTCGATGTCACTTGTC LGPXR3 AGTTCCAGGATACGTCATTC FAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC17 RAP GGCCACGCGTCGACTAGTACT17 AP GGCCACGCGTCGACTAGTAC 注：Y. C/T；R. A/G 1.2.3 罗非鱼GPx基因3′RACE
根据克隆到的中间片段，用Oligo 6.0设计正向引物LGPXS2和LGPXS3，以及反向引物RAP和AP(表 1)。以cDNA第一链为模板，先用LGPXS2/RAP进行一扩，反应程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。再以扩增产物为模板，用LGPXS3/AP进行二扩，反应程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。同1.2.2进行目的片段回收、转化、测序。
1.2.4 罗非鱼GPx基因5′RACE
根据克隆到的中间片段及3′末端序列设计反向引物LGPXR2和LGPXR3，正向引物FAP(表 1)。将cDNA第一链纯化后，加同聚化polyG尾，以加尾产物为模板，先用FAP/LGPXR2进行一扩，反应程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。再以扩增产物为模板，用AP/LGPXR3进行二扩，反应程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。同1.2.2进行目的片段回收、转化、测序。
1.2.5 GPx1基因的生物信息学分析
使用SECISearch、DNA Star、ClustalX、MEGA 4.0、SignalP 3.0、ProtScale、NetNGlyc、PSORT、TMHMM和Swiss-Model等生物学软件对克隆的GPx1基因cDNA序列以及推测的蛋白质结构进行生物信息学分析。
2. 结果与分析
2.1 GPx1基因的克隆
将拼接以后的GPx核苷酸序列complete CDS登录GenBank，登录号GQ853451。
2.2 GPx1基因的生物信息学分析结果
2.2.1 GPx1基因cDNA序列和推测蛋白序列的分析
GPx1基因全长984 bp，5′UTR 56 bp，CDS 576 bp，3′UTR 352 bp，PolyA 20 bp；第174~176位密码子TGA(UGA)编码1个硒半胱氨酸(Sec)；第791~885位碱基(位于3′UTR)形成1个硒半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence，SECIS)(图 1)。GPx1包含191个氨基酸，分子量21.8 kDa，等电点8.04。SignalP 3.0和NetNGlyc软件分析结果表明，该基因编码的多肽链无信号肽和潜在的N-糖基化位点。用ProtScale、PSORT和TMHMM在线软件分别预测了GPx1基因编码蛋白氨基酸序列的跨膜趋势、亚细胞定位和跨膜结构，结果表明整个多肽链表现为亲水性且为非跨膜蛋白。
2.2.2 GPx1基因的同源性及进化分析
罗非鱼GPx1的核苷酸序列与其他脊椎动物的相似性为43.2%~58.2%，氨基酸序列相似性为58.1%~80.6%(表 2)。根据脊椎动物GPx1核苷酸序列建的进化树显示，处在分类学上不同纲的脊椎动物的GPx1基因分别占据了不同分支(图 2)。
表 2 罗非鱼与其他脊椎动物GPx1基因核苷酸、氨基酸序列相似性比较Table 2. Comparison of nucleotide and amino acid similarities between O.niloticus GPx1 and other vertebrate animals GPx1% 种类
species核苷酸相似性
nucleotide similarity氨基酸相似性
amino acid similarity草鱼Ctenopharyngodon idella 58.2 80.6 斑马鱼Danio rerio 56.6 78.5 日本鳗鲡Anguilla japonica 51.5 78.5 金枪鱼Thunnus maccoyii 54.6 73.1 人Homo sapiens 45.2 63.8 马Equus caballus 43.9 64.3 鼠Mus musculus 44.1 63.2 蟾Xenopus (Silurana) tropicalis 44.0 58.4 斑胸草雀Taeniopygia guttata 43.2 58.1 ![]()
图 2 基于GPx1基因全序列的20种脊椎动物的NJ进化树Figure 2. Phylogentic tree of 20 species of vertebrate animals based on complete sequence of GPx1 gene2.2.3 GPx1推测蛋白质序列的分析
与其他脊椎动物GPx1蛋白质序列的多重比对结果显示，罗非鱼GPx1具有构成催化四联体的Sec、Trp、Gln和Aln 4个保守氨基酸。它们所在的片段，氨基酸保守性也较强。3D模型显示，罗非鱼GPx1具有形成二聚体、四聚体的寡聚化环(oligomerization loop)和“PGGG”结构域(“PGGG”motif)(图 3)。从比对结果可以看出，GPx1具有寡聚化环结构域片段和“PGGG”结构域(图 4)。
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图 3 Swiss-model软件预测的罗非鱼GPx1 3D模型Figure 3. O.niloticus GPx1 3D model predicted with Swiss-model![]()
图 4 罗非鱼GPx1与其他脊椎动物GPx1氨基酸序列比对*表示相同氨基酸，催化四联体用粗斜体字母标出，PGGG结构域和寡聚化环用灰色方、框标出，有助予稳定酶结构的3个环用粗下划线表示，传递底物至催化中心的重要氨基酸用黑体加粗字母标出Figure 4. Comparison of Gpxl amino acid sequence between 0.niloticus and other vertebrate animals* indicates the same amino acid; catalytic tetrad are shown in bold italic letters; PGGG motif and oligomerizxagion loop are boxed in grey three loops that stabiloize enzyme structure are undertlined; amino acid delivering the substrates towrd catalytic centers are shown in bold letters.3. 讨论
硒代半胱氨酸(Sec)是第21种氨基酸，存在于含硒酶的活性中心，由1个读码框架内的终止密码子UGA编码，这种编码机制依赖于特殊的Sec t-RNA、延伸因子及位于mRNA 3′UTR中的硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence，SECIS)，后者形成的颈环结构协助tRNA识别UGA[14]。罗非鱼GPx1具有1个读码框架内的UGA，并且3′UTR中包含SECIS(图 1)，协助编码1个Sec。在GPx的过氧化反应中心，具有氧化还原活性的半胱氨酸(Cys)或硒代半胱氨酸(Sec)与Trp、Gln和Asn以氮氢键(N-H)连接，形成脊椎动物GPx家族典型的催化四联体[3]。罗非鱼GPx1氨基酸序列中也存在催化四联体位点(图 3，图 4)。
哺乳动物GPx中，在传递底物至催化中心过程中起重要作用的氨基酸残基Arg52、98、179、180和Lys86及部分鱼类GPx相应位点均高度保守[15]。GPx酶蛋白均包含有3个环结构，起到稳定酶三级结构的作用，其氨基酸序列在所有物种的所有亚型中均高度保守[16]。罗非鱼GPx1氨基酸序列中也存在这些位点和环结构(图 3)。
GPx家族的很多成员通过疏水作用和氢键形成同源二聚体、四聚体[17]。“PGGG”结构域和寡聚化环片段在寡聚体形成中起重要作用[5]。罗非鱼GPx1也存在这2个结构(图 3，图 4)，推测与其他脊椎动物类似，可以形成同源四聚体。GPx1可代谢过氧化氢和部分有机过氧化物，包括胆固醇和长链脂肪酸过氧化物，而生物膜产生的脂质过氧化物只有经过磷脂酶A2预处理才能作为GPx1的底物[18-20]，原因可能是GPx1的四聚体构象导致复杂的脂质或膜质过氧化物无法充分接近催化位点[4]。在哺乳动物中，GPx1被确定存在于细胞液、细胞核和线粒体中[21]，罗非鱼GPx1基因编码的肽链经生物软件预测，无信号肽、跨膜结构和N-糖基化位点，推测其可能作为胞内酶发挥其生物学功能。
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图 2 基于GPx1基因全序列的20种脊椎动物的NJ进化树
Figure 2. Phylogentic tree of 20 species of vertebrate animals based on complete sequence of GPx1 gene
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图 3 Swiss-model软件预测的罗非鱼GPx1 3D模型
Figure 3. O.niloticus GPx1 3D model predicted with Swiss-model
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图 4 罗非鱼GPx1与其他脊椎动物GPx1氨基酸序列比对
*表示相同氨基酸，催化四联体用粗斜体字母标出，PGGG结构域和寡聚化环用灰色方、框标出，有助予稳定酶结构的3个环用粗下划线表示，传递底物至催化中心的重要氨基酸用黑体加粗字母标出
Figure 4. Comparison of Gpxl amino acid sequence between 0.niloticus and other vertebrate animals
* indicates the same amino acid; catalytic tetrad are shown in bold italic letters; PGGG motif and oligomerizxagion loop are boxed in grey three loops that stabiloize enzyme structure are undertlined; amino acid delivering the substrates towrd catalytic centers are shown in bold letters.
表 1 GPx1基因扩增引物序列表
Table 1 Primers used in GPx1 cloning
引物名称primer 序列(5′~3′) sequence(5′~3′) GPXS1 CAGTTYGGCCAYCARGA GPXR1 AGRAACTTYTCRAARTTCCA LGPXS2 AGAAGGTGGATGTGAATGGA LGPXS3 TGATGCCCTGGGTCTCAT LGPXR2 TATCTGCCTCGATGTCACTTGTC LGPXR3 AGTTCCAGGATACGTCATTC FAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC17 RAP GGCCACGCGTCGACTAGTACT17 AP GGCCACGCGTCGACTAGTAC 注：Y. C/T；R. A/G 
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表 2 罗非鱼与其他脊椎动物GPx1基因核苷酸、氨基酸序列相似性比较
Table 2 Comparison of nucleotide and amino acid similarities between O.niloticus GPx1 and other vertebrate animals GPx1
% 种类
species核苷酸相似性
nucleotide similarity氨基酸相似性
amino acid similarity草鱼Ctenopharyngodon idella 58.2 80.6 斑马鱼Danio rerio 56.6 78.5 日本鳗鲡Anguilla japonica 51.5 78.5 金枪鱼Thunnus maccoyii 54.6 73.1 人Homo sapiens 45.2 63.8 马Equus caballus 43.9 64.3 鼠Mus musculus 44.1 63.2 蟾Xenopus (Silurana) tropicalis 44.0 58.4 斑胸草雀Taeniopygia guttata 43.2 58.1
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