Phylogenetic relationship of pearl oysters in genus Pinctada based on partial mitochondrial 16S rRNA sequence
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摘要:
利用PCR技术分别扩增合浦珠母贝(Pinctada fucata)、长耳珠母贝(P.chemnitzi)和企鹅珍珠贝(Pteria penguin)的16S rRNA基因片段，PCR产物直接测序，删去引物及部分端部序列后，得到439 bp可供分析的核苷酸片段，用MEGA 3.1软件分析了核苷酸差异。结果表明，合浦珠母贝种内个体间序列完全相同，长耳珠母贝种内个体间有2个颠换(Transversion)突变位点，而企鹅珍珠贝种内个体间有1个转换(Transision)突变位点，5个颠换(Transversion)突变位点。与GenBank数据库中其他9种珍珠贝的序列进行比较，得到464个同源比对位点，包括51个插入/缺失位点和231个变异位点(173个简约信息位点和53个单突变子)。合浦珠母贝与长耳珠母贝的同源性为83.2%，合浦珠母贝、长耳珠母贝与企鹅珍珠贝的同源性分别为55.4%和59%。NJ系统进化树表明合浦珠母贝和长耳珠母贝与珠母贝属的种类聚在一起，而企鹅珍珠贝与珍珠贝属的种类聚在一起，与形态学分类一致。
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关键词:
- 珍珠贝 /
- 16S rRNA基因 /
- 序列分析
Abstract:Mitochondrial 16S rRNA gene fragments were amplified from Pinctada fucata, P.chemnitzi and Pteria penguin using PCR technique. The PCR products were directly sequenced, and 439 bp nucleotide sequences were obtained after excluding the primers and truncating partial sequences at the end. Sequence variation was analyzed using MEGA 3.1 software. The results indicated that base substitution was not found among P.fucata, but two transversions were found among P.chemnitzi, one transition and five transversions among P.penguin. Alignment with nine homologous sequences from Pteridae species in GenBank revealed 51 insertion/deletions and 231 variable sites (173 parsimony-informative sites and 53 singletons) among 464 truncated alignment sites. The percentage of the identity of the 16S rRNA gene fragments was 83.2% between P.fucata and P.chemnitzi, 55.4% between P.fucata and Pteria penguin, and 59% between P.chemnitzi and P.penguin. The NJ tree indicated that P.fucata and P.chemnitzi were assembled together with Pinctada species, yet P.penguin assembled together with the Pteria species, which was consistent with the morphological classification.
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Keywords:
- pearl oyster /
- 16S rRNA gene /
- sequence analysis
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合浦珠母贝(Pinctada fucata)是培育海水珍珠的主要贝类之一, 但人工育珠中插核手术后育珠贝的高死亡率一直是影响珍珠养殖业效益及产业发展的重要问题[1]。建立有效的贝类免疫水平评价体系并据之进行针对性的高免疫力合浦珠母贝选育是解决这一问题的重要途径。贝类是无脊椎低等动物, 其免疫系统包含细胞免疫与体液免疫2种方式。其中抗氧化系统是贝类最重要的体液免疫方式之一[2], 它包含抗氧化酶与非酶类的天然抗氧化剂两部分, 各成分间相互协同、代偿与依赖, 共同清除过量的活性氧和自由基, 维持机体的氧化/还原平衡。
组织损伤对机体的抗氧化系统会产生显著影响[3-4], 据报道贝类对外界刺激较为敏感, 即便是不损伤软体部的搅动也会造成其抗氧化指标的波动[5]。此外, 在插核过程中小片和珠核的植入会引起血细胞的吞噬、包囊、形成细胞结等细胞免疫反应[6], 而伴随吞噬引起的呼吸爆发会产生大量活性氧。期间有效的抗氧化成分会将过量的自由基清除以保证机体免受损伤[7]。但是当机体的抗氧化系统不足以清除过量的自由基时, 后者会造成机体DNA、蛋白质以及脂肪酸的氧化[8-10], 从而导致机体细胞与组织的损伤、免疫能力降低以及个体的病害与死亡。有学者认为较高的抗氧化能力对于生物体应对各类胁迫因子起着重要作用, 如赵艳芳等[11]在对栉孔扇贝(Chlamys farreri)和菲律宾蛤(Ruditapes philippinarum)的镉(Cd)胁迫研究中推断, 扇贝内脏团中较高的谷胱甘肽(GSH)含量以及谷胱甘肽硫转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性等高抗氧化指标可能在扇贝高富集、高耐受Cd方面起重要作用。刘晓华等[12]在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)饲料中添加GSH后发现实验组总抗氧化能力有所提高, 同时成活率亦显著提高。说明较高的总抗氧化能力水平对生物体的生长、成活率以及抗逆存在积极意义。由此推断, 合浦珠母贝个体的抗氧化防御体系能力的强弱与其健康程度存在密切联系, 对插核的成败也存在着潜在影响。
到目前为止, 中国关于插核过程中珍珠贝抗氧化免疫水平变化特征的报道还比较少见。周畅等[13]对插核手术前后合浦珠母贝血清的超氧化物歧化酶(SOD)活性、溶菌活性和抗菌活性以及血细胞的吞噬活性进行了比较研究; 焦钰等[14]则探讨了插核后珍珠囊的不同发育阶段血清中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、SOD和溶菌酶(LZM)的活性变化规律。而何秀娟等[15]、LI等[16]对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii Lea)的研究发现插核手术后机体的免疫防御调节增强, α2M基因的表达水平以及ACP和SOD活性均有明显变化。但插核过程涉及多个水平的生物学反应, 只有对其中的各个环节分别进行了解, 才能更为准确地理解插核过程对合浦珠母贝免疫状态的影响。因此, 该研究对合浦珠母贝进行了施加手术创伤而不插入小片与珠核的实验, 除了检测SOD和CAT活性之外, 还对总抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)及丙二醛(MDA)含量进行检测分析, 以期探明纯粹的手术损伤对机体抗氧化免疫水平的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验所用材料为吊养在海南省陵水县新村港的17月龄合浦珠母贝, 壳长(59.60±5.12)mm, 壳高(58.50±5.12)mm, 壳宽(23.66±2.54)mm, 湿质量(36.82±7.59)g。将实验用贝60只清理后于海区吊养3 d, 然后依照一般插核流程制造长约0.5 cm创口, 重新装进养殖笼具放回海区吊养, 并分别于手术后第1、第3、第6、第12、第24、第48小时取样, 每次取样3只, 分别取其闭壳肌、鳃和外套膜至防冻管中, 于液氮中保存待用。于实验开始前(即第0小时)对未损伤个体进行同样的取样, 作为对照组, 保存条件同上。
1.2 方法
测定的免疫指标包括SOD、CAT活性、TAC和MDA含量。这4种生理指标的具体测定方法为：SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定, CAT活性采用钼酸铵法测定, 总抗氧化能力(TAC)测定采用化学比色法, 丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法, 实验所用试剂均为南京建成生物工程研究所提供的相关试剂盒。
1.3 数据处理
采用SPSS 19.0软件对实验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)、组间多重比较分析(LSD)以及相关性分析(Pearson/Linear correlation)。
2. 结果
2.1 对SOD活性的影响
插核手术损伤对SOD活性的影响见图 1-a。在损伤后第3小时SOD活性在闭壳肌、鳃与外套膜中均降到最低值, 而在第12小时升至最大值或者恢复到损伤之前的水平, 之后随着时间的延长各组织中SOD活性再次出现不同程度的降低。即整个实验过程中SOD活性在闭壳肌、鳃以及外套膜3种组织中均呈现降低-升高-再降低的变化趋势。另外由图中可以看出, 同一时间点SOD活性以鳃中最高(P＜0.05), 而闭壳肌与外套膜SOD活性在不同时间点的高低并不稳定。
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图 1 合浦珠母贝超氧化物歧化酶、过氧化氧酶活性, 总抗氧化能力和丙二醛含量在3种组织中的变化不同大写字母表示相同时间不同组织的差异显著(P＜0.05);不同小写字母表示相同组织不同时间的差异显著(P＜0.05)Figure 1. Change of SOD, CAT activities, TAC and MDA content in three tissues of P.fucataDifferent capital letters indicate significant difference in different tissues at the same time (P < 0.05);different small letters indicate significant difference at different time within the same tissue (P < 0.05).2.2 对CAT活性的影响
插核手术损伤对CAT活性的影响见图 1-b。除鳃之外, 闭壳肌与外套膜CAT活性均出现了一个显著的、大幅度的下降(P < 0.05), 之后又有一个升高的过程。除此之外, CAT活性在3种组织中均于第12小时达到最大值, 之后又出现大幅下降。因此, 在该实验过程中闭壳肌、鳃及外套膜CAT活性的变化特点与SOD基本一致, 不同的是鳃中CAT活性在第12小时之前并没有显著地降低(P>0.05)。另外, 对同一时间不同组织间CAT活性比较发现, 在多数时间点鳃中的CAT活性相对于闭壳肌与外套膜中均显著较高(P＜0.05);而除第12小时外套膜中CAT活性显著高于闭壳肌外(P＜0.05), 其他时间两者均没有显著差异(P>0.05)。
2.3 对TAC水平的影响
当施以损伤之后各组织的TAC均出现不同程度的下降, 并且除闭壳肌外, 鳃与外套膜中的TAC水平在第1~第6小时整体上比较稳定(图 1-c)。不过这3种组织的TAC均在第12小时达到最大值或者恢复到对照组水平, 之后又再次呈现出下降趋势。在同一时间, 多数情况下TAC以闭壳肌中为最高, 而鳃与外套膜中TAC在多数时间点没有显著差异(P>0.05)。
2.4 对MDA含量的影响
在整个实验过程中MDA含量在3种组织中整体均呈上升的趋势(图 1-d)。值得注意的是, 整体上各组织的MDA含量在最初的增高后趋于稳定直至第12小时, 之后再次增高并达到该实验的最高水平。而在第12小时之后多数呈现出增高的趋势。各个时间点不同组织间的MDA含量则均没有显著差异(P>0.05)。
2.5 SOD、CAT活性、TAC和MDA含量随不同组织和不同损伤时间的变化
利用主体间效应的检验进行方差分析, 检测了取样时间和组织对SOD、CAT活性、TAC和MDA含量的影响。组织以及组织与时间的交互作用对除MDA之外的SOD、CAT活性和TAC都有显著影响(P < 0.05), 取样时间对4个指标均有显著影响。说明同样的条件下, 不同组织间SOD、CAT活性和TAC存在显著差异(P < 0.05), 而MDA含量则不受取样组织差异的影响; 同时不同取样时间点对SOD、CAT活性、TAC和MDA含量有显著影响(P < 0.05)(表 1)。
表 1 取样时间与组织对超氧化物歧化酶、过氧化氧酶活性, 总抗氧化能力和丙二醛含量影响的方差分析Table 1. Effect of variance of sampling time and tissue on SOD, CAT activities, TAC and MDA content来源source 因变量dependent variable 偏差平方和SS 自由度DF 均方MS F P 组织tissue MDA 0.235 2 0.117 2.393 0.10 TAC 2.540 2 1.270 59.297 <0.01 SOD 133.841 2 66.921 156.893 <0.01 CAT 27.563 2 13.781 28.158 <0.01 时间time MDA 5.953 6 0.992 20.242 <0.01 TAC 2.873 6 0.479 22.358 <0.01 SOD 155.326 6 25.888 60.693 <0.01 CAT 130.328 6 21.721 44.381 <0.01 组织×时间tissue× time MDA 0.255 12 0.021 0.434 0.94 TAC 0.674 12 0.056 2.622 <0.01 SOD 32.072 12 2.673 6.266 <0.01 CAT 18.781 12 1.565 3.198 <0.01 误差error MDA 2.059 42 0.049 TAC 0.900 42 0.021 SOD 17.914 42 0.427 CAT 20.556 42 0.489 2.6 SOD、CAT活性、TAC和MDA含量的相关性分析
SOD与CAT之间存在极显著正相关关系(P＜0.01), 与TAC和MDA含量之间没有显著相关性(表 2)。而MDA含量与CAT活性和TAC之间均存在极显著的负相关关系(P＜0.01)。
表 2 合浦珠母贝超氧化物歧化酶、过氧化氧酶活性, 总抗氧化能力和丙二醛含量的相关性Table 2. Pearson correlation between SOD, CAT activities, TAC and MDA content of P.fucataSOD CAT TAC MDA SOD 1 0.538** 0.13 0.011 CAT 1 0.181 -0.365** TAC 1 -0.368** MDA 1 注：* *.极显著性相关(P＜0.01)
Note：* *.very significant at 0.01 level (P＜0.01)3. 讨论
个体的组织损伤对动植物机体的抗氧化系统存在普遍影响[3-4, 17], LACOSTE等[5]研究发现, 即便是不损害软体部的搅动也会对长牡蛎(Crassostrea gigas)体内抗氧化酶及活性氧含量产生影响。育珠过程中, 插核手术直接作用于合浦珠母贝软体部, 会对其机体造成直接损害, 进而影响其抗氧化免疫水平。如周畅等[13]发现插核手术后个体的血清SOD活性明显上升, 焦钰等[14]报道插核手术后血清SOD及CAT等抗氧化酶活性在珍珠囊不同发育阶段表现出不同的变化特点。因此, 不论是手术创伤本身对机体的影响, 还是贝类血细胞通过吞噬作用杀死被吞噬异物的过程, 抗氧化免疫系统都对维持机体正常的氧化/还原平衡起到至关重要的作用。该研究探讨了单纯的手术损伤本身对个体不同组织抗氧化水平的影响, 发现SOD、CAT活性和TAC在各组织间整体上均表现为先下降再升高后再次下降的变化特点, 这一点同赵美丽[18]研究中栉孔扇贝部分组织中SOD、CAT活性的变化特点存在较高的相似性, 与武晨虹[19]开展的土霉素废水对斑马鱼(Danio rerio)和锦鲤(Cyprinus carpio)的毒性试验中部分抗氧化酶在某些情况下的变化趋势也有一定的相似性。而在温度骤降对光滑河兰蛤(Potamocorbula laevis)的胁迫研究中, 中幅和大幅温度骤降模式下光滑河兰蛤肌肉中TAC均呈现升高-降低-再升高-再降低的波动趋势[20], 这与该研究有所不同, 原因可能与胁迫类型和强度有关。
此外, 除SOD与CAT之间表现出极显著的正相关(P＜0.01)外, SOD、CAT活性与TAC之间并无显著的相关性。可能是因为SOD的生物学功能在于催化超氧阴离子(O2-)生成H2O2, 而CAT则是将H2O2催化生成H2O与O2, 从而实现将强氧化性的O2-清除, 因此它们之间的相关性应该是抗氧化酶之间相互协同的表现。而TAC除了包含SOD与CAT在内的多种抗氧化酶之外, 还包含其他的非酶成分, 如吴小芬等[21]的研究就表明合浦珠母贝的个别个体含有丰富的类胡萝卜素, 而后者作为一种重要的天然抗氧化物质其抗氧化特性一直受到关注[22-23]。因此TAC与SOD及CAT的相关性不高应该反映出了贝类体内抗氧化体系构成的复杂与多样, 同时也说明单一或少数几种抗氧化酶可能难以准确、全面地反映个体的抗氧化水平及其变化特点。
O2-作为组织损伤后产生的主要自由基之一, 是个体体内其他自由基的最初引发剂, 能通过Fenton反应直接衍生成羟基自由基(OH-), OH-一旦生成就立即与邻近的细胞膜生物大分子反应, 成为脂质过氧化作用的主要引发剂[3]。MDA是个体组织及细胞脂质过氧化的产物之一, 直接反映了机体的过氧化损伤情况。这由表 2中所示MDA含量与TAC及CAT活性均存在极显著负相关关系(P < 0.01)亦可得到部分印证。由表 2还可以看出TAC与CAT活性之间的相关性并不显著(P>0.05), 因此MDA含量同TAC和CAT活性之间的关系还需进一步研究。同时, 由表 1可以看出不同的损伤时间对TAC、SOD、CAT活性以及MDA含量均有极显著影响(P＜0.01), 即在创伤后的不同时间点MDA含量随着各抗氧化活性成分降低而增高, 反之则其增高减缓或趋于稳定。此外, 组织的差异对TAC、SOD和CAT活性也表现出极显著(P＜0.01)的影响, 不过MDA含量在各组织间则没有表现出明显差异(P>0.05), 可能是由于小分子的特点利于其随着血液循环在各组织间的流动, 因而使得不同组织内MDA含量趋于一致。
综上所述, 插核手术造成的软体部的损伤对个体不同组织的抗氧化免疫系统均存在较大影响, 不同抗氧化成分之间由于相互协同与代偿作用, 整体表现出一定的变化规律。而作为衡量个体整体抗氧化水平的指标, TAC相对于SOD与CAT可以较为全面地反映机体的抗氧化免疫状态; MDA作为脂质过氧化产物则可以较好地指示机体损伤情况。至于实际的插核操作中小片和珠核对合浦珠母贝抗氧化体系的影响, 以及能否通过选育高抗氧化能力的品系改善合浦珠母贝插核后的生存状态则还需进一步探讨。
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图 1 12种珍珠贝类的16S rRNA序列变异位点
Figure 1. Variable sites in 16S rRNA sequences of 12 Pteriidae
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图 2 12种珍珠贝类16S rRNA基因片段的NJ树
Figure 2. The NJ tree based on partial mitochondrial 16S rRNA gene sequences of 12 species in Pteriidae
表 1 样品的种类和采集地点
Table 1 Species and sampling location
种类
species采样地点
sampling locationGenBank序列号
GenBank accession No.合浦珠母贝 Pinctada fucata 大亚湾、三亚和北海 长耳珠母贝 P.chemnitzi 大亚湾、香港 EF056475EF056476 企鹅珍珠贝 Pteria penguin 三亚 EF031242 
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表 2 16S rRNA基因片段的碱基组成
Table 2 Base composition of 16S rRNA gene fragments in pearl oysters
% 物种
species碱基组成base composition GC含量
GC contentA T C G 合浦珠母贝 Pinctada fucata 28.0 25.1 17.1 29.8 46.9 射肋珠母贝 P.radiata 27.5 25.3 17.6 29.7 47.3 长耳珠母贝 P.chemnitzi 29.0 27.9 15.8 27.2 43.0 黑珠母贝 P.nigra 29.7 26.8 16.2 27.3 43.5 斑珠母贝 P.maculata 28.0 25.6 17.4 28.9 46.3 大珠母贝 P.maxima 28.0 29.8 15.2 27.0 42.2 白珠母贝 P.albina 29.7 26.8 16.2 27.3 43.5 珠母贝 P.margaritifera 28.3 28.3 15.4 28.1 43.5 企鹅珍珠贝 Pteria penguin 27.9 30.2 14.8 27.1 41.9 燕子莺蛤 P.hirundo 26.0 26.9 17.3 29.8 47.1
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表 3 12种珍珠贝类用Kimura双参数法计算的遗传距离
Table 3 Pairwise genetic distances among 12 Pteriidae on the basis of Kimura two-parameter mode
种类 species 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 大珠母贝
P.maxima2 珠母贝
P.margaritifera0.146 3 黑珠母贝
P.nigra0.288 0.279 4 白珠母贝
P.albina0.288 0.279 0.000 5 长耳珠母贝-香港
P.chemnitzi-HK0.279 0.276 0.122 0.122 6 长耳珠母贝-大亚湾
P.chemnitzi-DB0.286 0.283 0.125 0.125 0.007 7 合浦珠母贝
P.martensi0.245 0.244 0.144 0.144 0.168 0.171 8 合浦珠母贝
P.fucata0.245 0.244 0.144 0.144 0.168 0.171 0.000 9 合浦珠母贝
P.imbricata0.274 0.269 0.147 0.147 0.195 0.191 0.070 0.070 10 射肋珠母贝
P.radiata0.256 0.248 0.157 0.157 0.188 0.191 0.057 0.057 0.056 11 斑珠母贝
P.maculata0.270 0.253 0.155 0.155 0.161 0.164 0.103 0.103 0.120 0.097 12 燕子莺蛤
P.hirundo0.457 0.433 0.490 0.422 0.413 0.436 0.436 0.436 0.474 0.470 0.459 13 企鹅珍珠贝
P.penguin0.418 0.483 0.468 0.468 0.410 0.401 0.446 0.446 0.464 0.442 0.441 0.163
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期刊类型引用(5)
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