波纹唇鱼不同组织5种同工酶表达的差异

区又君, 齐旭东, 李加儿

区又君, 齐旭东, 李加儿. 波纹唇鱼不同组织5种同工酶表达的差异[J]. 南方水产科学, 2009, 5(2): 51-55. DOI: 10.3969/j.issn.1673-2227.2009.02.009
引用本文: 区又君, 齐旭东, 李加儿. 波纹唇鱼不同组织5种同工酶表达的差异[J]. 南方水产科学, 2009, 5(2): 51-55. DOI: 10.3969/j.issn.1673-2227.2009.02.009
QU You-jun, QI Xu-dong, LI Jia-er. Five kinds of isozyme in different tissues of Cheilinus undulatus[J]. South China Fisheries Science, 2009, 5(2): 51-55. DOI: 10.3969/j.issn.1673-2227.2009.02.009
Citation: QU You-jun, QI Xu-dong, LI Jia-er. Five kinds of isozyme in different tissues of Cheilinus undulatus[J]. South China Fisheries Science, 2009, 5(2): 51-55. DOI: 10.3969/j.issn.1673-2227.2009.02.009

波纹唇鱼不同组织5种同工酶表达的差异

基金项目: 

国家高技术研究发展计划(863计划)项目 2006AA10A414

详细信息
    作者简介:

    区又君(1964-), 女, 研究员, 从事鱼类生物学与水产增养殖技术研究。E-mail: ouyoujun@126.com

  • 中图分类号: Q55

Five kinds of isozyme in different tissues of Cheilinus undulatus

  • 摘要:

    运用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法对波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)6组织(肌肉、心脏、肝脏、肾脏、脑和脾脏)的5种同工酶[酯酶(EST)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶(ME)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)]进行了研究,并对其同工酶位点及其酶谱表型进行了分析。结果表明,波纹唇鱼5种同工酶系统具有不同程度的组织特异性。EST检测到2条酶带,由2个基因座位编码。LDH在6种组织中都存在,共检测到9条酶带,由3个基因座位编码,具有多态性现象。MDH在6种组织中均可检测到,可分为线粒体型和上清液型,各由1个基因座位编码,组织差异性不显著。ME检测到2条酶带,肝脏的含量比较丰富,线粒体型和上清液型的区分不明显。AST在6种组织中都没有发现。

    Abstract:

    Five isozymes (EST, ME, AST, LDH and MDH) in six tissues (muscle, heart, liver, kidney, brain and spleen) of Cheilinus undulatus were studied by using vertical polyacrylamide gel gradient electrophoresis. The results showed that the five isozymes presented tissues specificity to some degrees. The number of EST bands was 2, which were encoded by 2 loci. LDH existed in all tissues studied. The number of LDH bands was 9, which were encoded by 3 loci, and the polymorphism was strong. Two types of MDH (m-MDH and s-MDH) were found and also existed in the six tissues. The number of ME bands was 2. ME in liver were rich, but it was not distinct between m-ME and s-ME. There was no AST in all six tissues.

  • 盐度是与海水鱼类生长和繁育有着密切关系的外在环境因素之一,对海水鱼类的生长繁殖具有重要的影响,尤其在进行海水鱼类的人工繁殖和种苗培育时,盐度更是重要的环境因子。有关盐度对海水鱼类胚胎和早期仔鱼发育影响的研究国内外已见有不少文献报道,所涉及的研究种类有大西洋油鲱(Brevoortia tyrannus)[1],黑鲷(Sparus macrocephalus)[2]、花鲈(Lateolabrax japonicus)[3]、NFDBF状黄姑鱼(Nibea miichthioides)[4]、梭鱼(Liza haematocheila)[5]、鲻(Mugil cephalus)[6]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[7]、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)[8]以及鲯GF6FA (Coryphaena hippurus)和遮目鱼(Chanos chanos)[8-9]等。

    卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus),俗称黄腊鲳、黄腊鲹、卵鲹、短鳍鲳鲹、金鲳、红杉、红沙等[10],隶属于鲈形目(Perciformes)鲹科(Carangidae)鲳鲹亚科(Trachinotinae)鲳鲹属,广泛分布于印度洋和太平洋的温暖水域,在中国东海、南海和黄海均有分布。卵形鲳鲹是海水养殖优质的种质资源,是近年来海湾深水网箱养殖的重要鱼类之一。近年来,国内外陆续开展了对卵形鲳鲹人工繁育技术的研究[11-12],但尚未见有关盐度对该鱼早期发育影响的文献报道。文章研究观察了卵形鲳鲹受精卵在不同盐度中的沉浮性,测定其在不同盐度海水中的孵化率、初孵仔鱼的畸形率以及仔鱼在不投饵条件下的存活系数(survival activity index,SAI),旨在为卵形鲳鲹的种苗生产提供参考依据,并为该种类的发育生物学研究积累基础资料。

    试验用卵形鲳鲹于2008年4月取自南海水产研究所深圳试验基地,亲鱼自然产卵后立即用手抄网收集漂浮在水表面的受精卵运回实验室。选取一批由质量好的受精卵在适宜水温和盐度条件下孵化的仔鱼,挑选其中肉眼观察体形正常、活力好的个体用做不同盐度下SAI的观察试验。

    试验用水为经沉淀及沙过滤的当地自然海水,温度为26.8±1.4 ℃,盐度28.2±0.8。

    供试海水均经过历时36 h以上的黑暗沉淀,再经沙池过滤及紫外线消毒。盐度试验所需高盐度海水用普通海水与加盐后的海水调配,低盐度海水用普通海水加淡水调配而成,用日产ATAGO型折光计测定海水盐度。

    试验在盐度5.0~50.0范围内共设置10个盐度梯度组,每个盐度梯度为5,各设置3个平行,数据计算时取其平均值。用1 L烧杯作为试验容器,各放入100粒受精卵。试验开始时卵细胞还没有开始分裂,观察其在各种盐度海水中的沉浮状态。

    设置10个海水盐度梯度(同1.2.2),采用1 L烧杯做实验容器,取受精卵100个。试验过程中用空气压缩机连续微充气,室温培育(温度26.8±1.4 ℃),待仔鱼破膜孵化后,观察仔鱼的孵化率和畸形率;孵化率和畸形率取3个平行组的平均值;孵化率为孵出成形的仔鱼与放入受精卵的比值。畸形仔鱼指油球异位或异数、尾部或脊柱弯曲的个体。

    试验共设置8个盐度梯度组:10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0和45.0;实验容器采用1 L烧杯,各放入100尾初孵仔鱼,置于实验室内阴凉通风处(水温26.8±1.4 ℃),试验期间不充气,不投喂,每天用玻璃吸管吸去死亡的仔鱼,记录存活的仔鱼尾数,一直到所有仔鱼全部死亡为止。仔鱼SAI计算公式如下:

    $$ \mathrm{SAI}=\sum\limits_{i=1}^k\left(N-h_i\right) \times i / N $$

    式中N为试验开始时的仔鱼尾数,k为仔鱼全部死亡所经历的时间(天数),hi为第i天仔鱼的累积死亡尾数。

    试验期间,定期观察并记录各试验胚胎组的发育情况。胚胎孵化时间(h: min)指从卵受精开始到约有50%以上鱼苗孵化出膜所经历的时间;孵化率(%)指全部孵出的仔鱼尾数与受精卵总数的比率×100;胚胎发育的适宜盐度范围指孵化率不低于50%的盐度范围[13]

    应用Excel和SPSS统计软件进行分析,计算其平均值和标准差,并对变化趋势进行回归等相关分析。

    卵形鲳鲹受精卵圆形、透明、浮性、单油球,卵径为1.2 mm,油球径为0.16 mm,每1 g受精卵的数量约1 000~1 200粒。从观察结果可以看到,在相对静止的水环境条件下,卵形鲳鲹受精卵在盐度25.0以下时全部沉到烧杯的底部;当盐度在30.0时50%浮在中层,其余50%沉底;当盐度35.0以上时全部浮在水的表面(表 1)。

    表  1  卵形鲳鲹受精卵在不同盐度下的沉浮情况
    Table  1.  Buoyancy observation of T.ovatus fertilized eggs at different salinities
    盐度 salinity 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0
    状态 state 半浮沉
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    观察到在室温26.8±1.4 ℃,盐度15.0~45.0条件下,卵形鲳鲹受精卵经20 h左右孵化出仔鱼,盐度变化对孵化时间的影响不大。当盐度较低(5.0~10.0)时,胚盘于受精后4~6 h起呈现严重扩散和融合状,分裂球间界线模糊不清,胚胎在受精后6~8 h即发育到多细胞期至高囊胚期间死亡;在盐度最高(50.0)组,胚盘在受精后4~6 h开始出现收缩,分裂球界线模糊不清,而且随着盐度的升高胚盘加剧收缩,当发育到多细胞期至高囊胚期间形成死胚。试验结果显示,卵形鲳鲹胚胎在盐度15.0~45.0之间都能完成发育过程并孵化出仔鱼;盐度低于15.0或高于45.0时都无法孵化出仔鱼。总孵化率与盐度变化呈反抛物线形分布,其回归关系可用y=-0.0025x2+0.1409x-1.0557(R2=0.9607,P < 0.05)来表达,畸形率呈正抛物线形分布,其回归关系可为y=0.0023x2-0.1214x+1.8500(R2=0.9572,P < 0.05),计算可得在微充气的试验条件下,卵形鲳鲹胚胎孵化的适盐范围为14.9~39.4,孵化率为50.4%~63.7%,畸形率在55.17%~63.72%。最适盐度为26.0~28.2,孵化率为91.2%~93.4%,畸形率为25.00%~26.60%(图 1)。

    图  1  盐度对卵形鲳鲹胚胎形成、总孵化率、畸形率的影响
    Figure  1.  Effects of salinity on embryo formation, total hatching rate and abnormality of T.ovatus

    卵形鲳鲹仔鱼从孵化后3日龄开始能够从环境中摄食,进入内源营养和外源营养混合期的生长发育阶段,在盐度25.0~30.0的试验范围内,SAI为44.19~47.44,仔鱼的活力较强(表 2)。盐度10.0时,SAI为3.17,仔鱼在开口或开口后1 d全部死亡;盐度15.0时,SAI为16.43,并在4日龄时存活率下降到70%以下;盐度35.0~40.0时,SAI为13.26~24.66,仔鱼的畸形率较高,活性较差;盐度达到45.0时,SAI仅为1.00,第2天均全部死亡。从表 2中所列的SAI可见,卵形鲳鲹早期仔鱼发育的最适盐度范围应在25.0~30.0之间。

    表  2  盐度10.0~45.0条件和饥饿状态下卵形鲳鲹仔鱼成活率和生存活力指数
    Table  2.  Survival rate and SAI of larval T.ovatus under starvation at salinity of 10.0~45.0
    盐度
    salinity
    仔鱼不同天数的成活率/%
    the survival rate of larval on different days
    SAI
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    10.0 100 52 37 8 0 0 0 0 0 0 0 0 3.17
    15.0 100 88 74 69 54 45 13 2 0 0 0 0 16.43
    20.0 100 93 90 85 84 83 54 34 16 2 0 0 26.18
    25.0 100 98 95 95 93 88 86 73 70 60 4 0 44.19
    30.0 100 99 98 98 98 89 89 86 85 60 12 0 47.44
    35.0 100 96 93 90 89 80 70 15 0 0 0 0 24.66
    40.0 100 85 70 63 49 35 13 6 0 0 0 0 13.26
    45.0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.00
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    在不同盐度范围内,受精卵在水层中的分布情况有所不同。此试验中,卵形鲳鲹受精卵在盐度小于25.0时全部沉底;在盐度大于35.0时全部为浮性。花尾胡椒鲷(Plectorynchus cinctus)的受精卵在盐度小于26.47的海水中全部为沉性,在大于30.12的海水中则呈现为浮性[14]。在试验温度下,点带石斑鱼(E.malabaricus)受精卵的相对比重与盐度30或31的海水比重相当,大致界于1.020~1.021之间[15]。高体NFDA4 (Seriola dumerili)受精卵在盐度为30.0以下呈沉性;在盐度32.0以上的海水呈浮性[16]。黄鲷(Dentex tumifrons)在相对静止的环境条件下,其胚胎在盐度32.0以下的海水时全部都沉到容器底部;在盐度33.0时40%的胚胎浮在水体中层, 60%沉底;在34.0时90%的胚胎分布于水体中间,呈现悬浮状态,10%的胚胎浮在水体表面;在35.0时40%的胚胎呈悬浮状态,60%的胚胎浮在水体表面;在盐度36.0以上时胚胎全部浮在水的表面[17]。在26.8~29.5 ℃条件下,军曹鱼(Rachycentron canadum)受精卵在盐度26.0以下的海水中呈现完全沉性;在盐度29.0时呈现半沉浮状态,大多数的受精卵悬浮在水体的中间;在盐度32.0以上的海水中受精卵呈现完全浮性[18]。由此可见,鱼类卵子在不同盐度水中的沉浮状态具有种间差异。因此,在种苗繁育过程中,为了获得高的成活率,应根据不同鱼类受精卵的沉浮特性,调整好生产用水的盐度,使之处于悬浮状态,以避免因盐度过低,受精卵下沉堆积,胚胎无法摄取充足的溶氧。

    鱼类卵的发育实际上受渗透压的调节。随着胚胎和仔鱼的发育,渗透调节的能力和过程都在变化。在早期胚胎发育过程中,渗透调节是有积极意义的,调节主要归因于细胞质膜的半渗透性和胚盘细胞的紧密连接[19]。盐度主要影响鱼类卵内渗透压的稳定性,在适盐范围内,卵内渗透压可通过自身调节保持在相对稳定的水平,故而有较高的孵化率。因此,海水鱼类的早期发育都有一定的适盐范围。外界水环境的高渗作用会促进鱼类胚胎发育的进程,缩短其孵化时间。但若海水的盐度过高、培育周期太短,则会影响鱼类胚胎发育的正常进行,结果造成孵出的仔鱼成活率低、对环境变化的耐受力差。低盐度条件下孵化率较低,低盐度影响了卵胚胎发育过程的能量消耗、利用规律和效率,使卵黄和油球内营养物质不能正常地转化为胚胎内组织的生长所需,从而破坏其正常的胚胎发育进程,导致孵化时间延长。根据受精卵的孵化时间、孵化率和畸形率等指标来判断,斜带石斑鱼(E.coioides)受精卵孵化的适宜盐度范围为15.0~45.0,以20.0~30.0为最适盐度[20]。高体NFDA4胚胎的最适发育盐度为32.0~35.0,当盐度低于30.0时,仔鱼的孵化率及成活率都呈现出明显的下降趋势[16]。赤点石斑鱼受精卵发育的适宜盐度为24.0~38.0,最适盐度为27.0~35.0,盐度高于35.0,孵化率随盐度的升高而降低、仔鱼畸形率随之升高[21-22]。与上述几种海水鱼类相比,卵形鲳鲹胚胎孵化的适盐范围与斜带石斑鱼相似,较赤点石斑鱼宽,但最适盐度范围比斜带石斑鱼窄,比赤点石斑鱼宽。这可以反映出卵形鲳鲹早期生活阶段的适盐性与一般海水鱼类大致相同。

    日本在海水鱼类种苗生产中,常用SAI来判断早期仔鱼的活力。在不投饵的情况下,初孵仔鱼仅靠自身携带的卵黄营养可存活一定的时间。存活时间的长短受其卵黄营养物质的质量和数量影响[22]。在无投饵(饥饿)和静水的条件下,观察仔鱼的耐受能力及存活天数,SAI越大,表明仔鱼的活力越强,用于种苗生产时成活率则较高。根据对目前不少开展人工繁育的海水鱼类的观察,SAI小的仔鱼,往往在第3~4天就会死亡,应整批弃之不用。从不同盐度下仔鱼SAI的变化结果来看,卵形鲳鲹在适宜的盐度内,仔鱼的SAI较高,反之则低。这也表明盐度对仔鱼活力的影响程度,从中得出仔鱼存活的适盐范围。卵形鲳鲹仔鱼在盐度为25.0和30.0的2个组仔鱼的SAI最高,分别为44.19和47.44;经深入观察,在这2组条件下,仔鱼发育及摄食正常,这与盐度对胚胎发育影响的范围几乎一致,这也表明适时调节培育用水的盐度,是种苗生产工艺流程中一个重要的环节。

    ①   KEINOSUKE I.日本栽培渔业协会在海水鱼人工孵化方面的最新进展[J].刘少明,译.南海研究与开发,1995(3):78-81.

    ②   LI Jiaer, LEE Chengsheng, BANNO J E.Influence of salinity and temperature on the development and hatching in gdolphin fish, Coryphaena hippurus L[J].南海水产研究,1994(8):65-74.

  • 图  1   波纹唇鱼不同组织的EST电泳图谱

    M. 肌肉;L.肝脏;S. 脾脏;K. 肾脏;H. 心脏;B. 脑

    Figure  1.   Electrophoretogram of EST in tissues of C.undulatus

    M. muscle; L.liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

    图  2   波纹唇鱼不同组织的LDH电泳图谱

    M. 肌肉;L.肝脏;S. 脾脏;K. 肾脏;H. 心脏;B. 脑

    Figure  2.   Electrophoretogram of LDH in tissues of C.undulatus

    M. muscle; L.liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

    图  3   波纹唇鱼不同组织的MDH电泳图谱

    M. 肌肉;L.肝脏;S. 脾脏;K. 肾脏;H. 心脏;B. 脑

    Figure  3.   Electrophoretogram of MDH in tissues of C.undulatus

    M. muscle; L.liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

    图  4   波纹唇鱼不同组织的ME电泳图谱

    M. 肌肉;L. 肝脏;S. 脾脏;K. 肾脏;H. 心脏;B. 脑

    Figure  4.   Electrophoretogram of ME in tissues of C.undulatus

    M. muscle; L. liver; S. spleen; K. kidney; H. heart; B. brain

    表  1   用于分析波纹唇鱼同工酶名称、编号、缓冲系统和凝胶浓度

    Table  1   The name, serial number, buffer system and gel concentration for analyzing the isozyme of C.undulatus

    酶的名称name of enzyme 编号serial number 缓冲系统buffer system 梯度胶/% gel concentration
    酯酶EST 3.1.1.1 TVB4~28 4~28
    乳酸脱氢酶LDH 1.1.1.27 TC 4~15
    苹果酸脱氢酶MDH 1.1.1.37 TC 4~7.5
    苹果酸酶ME 1.1.1.40 TC 4~7.5
    天门冬氨酸氨基转移酶AST 2.6.1.1 TC 4~15
    注:TC. Tris-柠檬酸(pH 7.0);TVB. Tris-硼酸-EDTA(pH 8.4)
    Note:TC. Tris-citric acid(pH 7.0);TVB. Tris-boric acid-EDTA(pH 8.4)
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出版历程
  • 收稿日期:  2008-08-24
  • 修回日期:  2008-09-11
  • 刊出日期:  2009-04-04

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