罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii)，俗称金钱虾，是中国淡水养殖业中重要的经济虾类品种。近年来，随着育苗技术的不断创新与突破，罗氏沼虾养殖产业快速发展，苗种市场需求量持续增长。然而，日益严峻的重金属污染问题导致养殖水环境持续恶化，严重影响了虾苗的产量和品质，已成为制约产业可持续发展的关键因素^[1]。水环境重金属污染主要来源于农业面源污染 (化肥和农药的过量使用)、工业点源污染 (废水、废气和固体废弃物的违规排放)以及地表径流污染 (雨水冲刷导致土壤重金属向水体的迁移) 等多个途径^[2-3]。

镉 (Cd) 是一种具有强毒性的非必需重金属元素，其生物半衰期极长，易在生物体内蓄积并对多个器官系统造成毒性损伤^[4]。该重金属主要通过金属冶炼、化石燃料燃烧以及工业涂料等途径进入环境，对生态系统平衡和水生生物健康构成严重威胁。研究表明，镉经肠道吸收后可诱导过量活性氧 (ROS) 产生，引发机体氧化应激反应，进而导致肠道组织结构损伤和微生物群落稳态失衡^[5-6]。

肠道是机体重要的免疫器官之一，其在维持机体健康方面发挥着关键作用^[7-8]。肠道内具有复杂的微生物群落，其以细菌为主导，主要由益生菌、致病菌和条件致病菌构成，三者间的动态平衡对维持肠道微环境稳定和免疫功能至关重要^[9]。值得注意的是，肠道是镉毒性作用的主要靶器官之一^[10]。大量研究表明，镉暴露不仅会降低机体免疫抵抗力^[11]，还会破坏肠道菌群平衡，干扰营养物质的消化吸收和能量代谢调节功能。在甲壳类动物中，镉对肠道的毒性效应已在多个物种中得到证实，如日本沼虾 (M. nipponense)^[12]、克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)^[13-14]、日本囊对虾 (Marsupenaeus japonicus)^[15]等。然而，目前针对罗氏沼虾的研究主要集中于饲料添加剂^[16]、养殖模式^[17]、养殖密度^[18]等应用领域，对其重金属毒性机制的研究相对较少。因此，探究镉对罗氏沼虾幼苗肠道菌群的影响，有助于了解镉在虾体内的毒性效应，还可为制定有效的防控措施提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验所用罗氏沼虾幼苗 (南太湖2号) 的体长为 (1.06±0.05) cm，产自浙江省淡水水产研究所。试验开展前，将罗氏沼虾幼苗在水池中暂养2 d以消除应激。根据预试验结果，镉对罗氏沼虾幼苗的96 h半致死浓度 (LC₅₀) 为1.75×10⁻³ mg·L⁻¹，安全浓度为1.75×10⁻⁴ mg·L⁻¹，设定最大暴露浓度为0.4倍安全浓度。共设1个对照组 (C0) 和4个镉处理组 (C1：0.1×10⁻⁴ mg·L⁻¹，C2：0.3×10⁻⁴ mg·L⁻¹，C3：0.5×10⁻⁴ mg·L⁻¹和C4：0.7×10⁻⁴ mg·L⁻¹)，每组30尾，每组设置3个重复。将虾苗养殖在水池 (1.5 m×1.5 m×0.6 m) 中，控制养殖水体积为0.9 m³，在不同水池中加入不同剂量的镉以达到设置的重金属胁迫浓度，计算方法为水体体积乘以处理浓度等于所需镉的量，再通过所需镉的量计算出所需氯化镉 (CdCl₂·2.5H₂O) 的量。试验期间保持水温为26~28 ℃，pH为7.5~8.1，溶解氧质量浓度＞5 mg·L⁻¹。每天上午9点和下午5点分别喂食1次虾片，投喂量为虾体质量的2%，下次投喂时观察池中是否有饵料残留并进行吸污处理，每2 d换1次水，每次换水不超过1/3，换水时根据所加入水体积补充相对应的镉含量，试验为期42 d。试验期间观察是否出现死虾，及时对死虾进行淘汰处理。

1.2   研究方法

1.2.1   样品采样

罗氏沼虾幼苗经MS-222麻醉后，用75% (φ)乙醇擦洗体表，然后用无菌水冲洗3次，置于冰上解剖。解剖后采集罗氏沼虾幼苗肠道组织，每3尾幼苗混合为1个样本，每个重复采集4个样本共12尾幼苗，其中3个正式样本，1个备用样本。采样完成后将肠道装入冻存管并做好编号，用 液氮速冻后于 −80 ℃保存。

1.2.2   16S rRNA基因测序

按照DNA提取试剂盒的操作方法提取罗氏沼虾幼苗肠道总细菌DNA。DNA提取完成后使用NanoDrop NC2000微量分光光度计测定其浓度和纯度，在测定过程中需要保持低温减少降解概率。将合格的样品进行PCR扩增，扩增区域为 V3—V4区，扩增引物为细菌通用引物：338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') 和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。PCR 扩增程序设置为：95 ℃预变性2 min；98 ℃ 变性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸5 min，循环25次。将 PCR 扩增产物通过 2% (w)的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，使用AxyPrep 细菌基因组 DNA 凝胶回收试剂盒 (Axygen) 进行回收。采用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统对PCR产物进行检测定量，随后使用Illumina MiSeq PE300平台进行测序。最终由上海美吉生物医药科技有限公司完成文库构建及测序数据输出。

1.2.3   数据处理

对获得的序列数据进行拼接、质控和过滤。基于序列相似性水平，对所有序列进行操作分类单元 (Operational taxonomic unit, OTU) 划分，并采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似度水平的OTU代表序列进行物种分类学注释。采用Kruskal-Wallis秩和检验分析各组间的物种多样性及组间差异。同时，利用线性判别分析效应大小 (LEfSe) 方法，筛选不同分类水平上具有显著差异的生物标志物。此外，通过PICRUSt2方法预测肠道菌群功能，并对各样本的代谢通路变化进行深入分析。所有数据处理与分析均在美吉生物数据分析平台上完成，p<0.05视为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   物种数目分析

通过16S rRNA高通量测序处理，利用韦恩图展示各个样本的物种数目及重叠情况。如图1所示，C0—C4组的独有物种分别是45、47、48、148和155种，5个处理组共有的核心OTU为209个，5个组均拥有丰富的菌群种类。各组OTU数量比较显示，C0最低，C4最高。

图  1  镉胁迫下的罗氏沼虾幼苗肠道菌群OTU数量

Fig. 1  OTU counts in intestinal flora of M. rosenbergii seedlings under cadmium stress

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2.2   物种多样性分析

Alpha多样性分析采用多种指数评估微生物群落的丰富度和多样性特征。通过组间差异检验可比较不同处理组间Alpha多样性指数的统计学差异。本研究采用ACE、Chao1、Shannon和Simpson等常用多样性指数进行分析 (图2)。结果显示，C4处理组的ACE和Chao1指数显著高于对照组，表明该浓度镉胁迫显著提升了菌群丰富度。但各处理组间的Shannon和Simpson指数均无显著差异 (p>0.05)。Beta多样性用于评估微生物菌群组成的相似性与差异性。PCoA分析显示，主坐标1 (PC1) 和主坐标2 (PC2) 分别解释了33.70%和20.61%的群落变异。NMDS分析的压力系数为0.132 (<0.2)，表明二维排序图能较好地反映样本间的实际差异。如图2所示，C0—C4组的样本可明显区分，说明各组的样本结构差异较大。

图  2  镉胁迫下罗氏沼虾肠道菌群的多样性分析

注：ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数采用Kruskal-Wallis秩和检验方法进行分析；PCOA和NMDS采用Bray-curtis方法计算距离。

Fig. 2  Diversity analysis of intestinal flora of M. rosenbergii seedlings under cadmium stress

Note: ACE, Chao1, Shannon and Simpson indexes were analyzed by using the Kruskal-Wallis rank-sum test. PCOA and NMDS were distance calculated using the Bray-curtis method.

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2.3   物种组成分析

如图3所示，在门水平上各组样本排名前10的肠道菌群中，相对丰度 >1%的菌群包括厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、浮霉菌门和髌骨细菌门。并且厚壁菌门、变形菌门和放线菌门是5个组在门水平上共有的优势菌群，分别占74.66%、11.80%和4.23%。与对照组相比，C1、C3、C4组厚壁菌门的相对丰度分别降低了21.19%、5.22%、17.01%；变形菌门的相对丰度分别增加了6.39%、0.75%、7.52%；放线菌门的相对丰度分别增加了10.05%、0.03%、1.90%。C2组则相反，厚壁菌门的相对丰度增加了12.15%，变形菌门和放线菌门的相对丰度分别减少了4.56%和1.00%。说明不同浓度的镉对罗氏沼虾幼苗肠道菌群的影响不同。图4显示，C4组的拟杆菌门、髌骨细菌门和浮霉菌门丰度较对照组分别显著增加1.66%、1.96%和1.07% (p<0.05)，而Dadabacteria菌呈组间极显著差异 (p<0.01)。如图5所示，在属水平上，乳球菌属 (Lactococcus) 是各组的优势菌群，占65.22%。与对照组相比，C1—C4组乳球菌属的相对丰度分别降低了30.75%、12.86%、10.73%和22.75%。图6展示了在属水平上存在显著差异的菌群。C4组中假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、生孢噬纤维菌属 (Sporocytophaga)、芽孢菌杆菌属 (Bacillus) 和生丝微菌属 (Hyphomicrobium) 的比例显著高于对照组，分别高出3.22%、1.34%、3.43%和2.53% (p<0.05)。

图  3  各组样本在门水平上排名前10的肠道菌群

Fig. 3  Top 10 intestinal flora for each group of samples on phylum level

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图  4  各组样本在门水平上的肠道菌群组成差异

注：采用Kruskal-Wallis秩和检验方法进行组间差异显著性检验；*. p<0.05 (显著差异)，**. p<0.01 (极显著差异)。

Fig. 4  Differences in intestinal flora composition among groups of samples on phylum level

Note: The significance of differences among the groups was tested by using the Kruskal-Wallis rank sum test. *. p<0.05 (significant); **. p<0.01 (highly significant).

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图  5  各组样本在属水平上的肠道菌群相对丰度变化

Fig. 5  Changes in relative abundance of gut flora on genus level

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图  6  各组样本在属水平上的肠道菌群组成差异

注：采用Kruskal-Wallis秩和检验方法进行组间差异显著性检验；*. p<0.05 (显著差异)。

Fig. 6  Differences in intestinal flora composition among groups of samples on genus level

Note: The significance of differences among the groups was tested by using the Kruskal-Wallis rank sum test; *. p<0.05 (significant).

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2.4   LEfSe分析

进化分支图显示 (图7-a)，与对照组相比，镉处理组在门水平上的标志物种有拟杆菌门、变形菌门、浮霉菌门和髌骨细菌门。观察LDA值评分柱状图 (图7-b) 发现，共寻找到51个差异显著的标志物种。其中，C0组包括细菌目、纤维弧菌目、康奈斯氏杆菌属 (Conexibacter) 等10个菌群，C1组包括拟杆菌门、生孢噬纤维菌属 (Sporocytophaga)、黄单胞菌目等10个菌群，C2组包括梭状芽孢杆菌目、立克次体目、热带单胞菌属 (Tropicimonas) 等8个菌群，C3组包括青霉属 (Aquicella)、黏细菌门等10个菌群，C4组包括芽孢杆菌科、出芽菌科等10个菌群。

图  7  不同镉处理下肠道菌群物种分支图 (a) 和LDA评分柱状图 (b)

Fig. 7  Branching diagram of species of intestinal flora (a) and histogram of LDA scores (b) under different cadmium treatment

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2.5   功能预测分析

PICRUSt分析结果显示，5组样本的肠道菌群在1级通路水平上预测到了6条代谢通路，涉及29个2级通路 (图8)。具体包括：11个新陈代谢类通路、3个遗传信息处理类通路、2个环境信息处理类通路、4个细胞进程类通路、3个生物系统类通路和6个人类疾病类通路。这表明罗氏沼虾幼苗肠道菌群主要参与了肠道的物质代谢和消化过程。对各组间KEGG通路的显著性分析 (图9) 显示，对照组与镉胁迫组之间并没有差异显著的代谢通路，仅在C1和C2组间观察到氨基酸代谢、翻译、复制与修复、运输和分解通路的显著差异。

图  8  KEGG代谢通路富集分析

Fig. 8  KEGG metabolic pathways enrichment analysis

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图  9  各组之间KEGG代谢通路显著差异分析

注：*. p<0.05 (显著差异)。

Fig. 9  Analysis of significant differences in KEGG metabolic pathways among groups

Note:*. p<0.05 (significant).

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3.   讨论

近年来，随着我国工业的快速发展，水体重金属污染日趋严重。其中，镉作为水体中含量最丰富、分布最广泛的重金属污染物之一^[19]，对水生动物构成严重威胁。水生动物长期栖息在受污染的水域中，镉可通过食物链在肝、肾、骨骼、肠道等器官富集，从而危害其机体健康^[20]。现有研究表明，肠道菌群的结构和功能与宿主的营养代谢、能量稳态及免疫防御等关键生理过程密切相关，并在维持内环境稳定方面发挥着不可替代的作用^[21]。值得注意的是，肠道中细菌 (尤其是条件致病菌) 的丰度会受到饲料成分、环境因素以及硫化物等环境污染物的显著影响^[22]。

本研究中，镉胁迫增加了罗氏沼虾幼苗肠道菌群的OTU水平，尤其是0.7×10⁻⁴ mg·L⁻¹组最明显，同时ACE和Chao1指数显著高于对照组，表明镉在一定程度上可能会增加罗氏沼虾幼苗肠道菌群的丰富度。推测可能是在高浓度镉暴露下，镉改变了肠道环境 (如pH、氧化应激水平等)，这种环境变化可能给某些菌群提供了竞争优势，从而增加了肠道菌群的整体丰度。而0.1×10⁻⁴、0.3×10⁻⁴和0.5×10⁻⁴ mg·L⁻¹组没有显著变化，可能是因为镉浓度较低，罗氏沼虾通过生理调节机制如肠道屏障有效减弱了镉对肠道菌群的影响。但在对鲤 (Cyprinus carpio)^[23]和中华蟾蜍 (Bufo gargarizans) 幼虫^[24]的研究中，肠道菌群的物种多样性随着镉浓度的增加而逐渐降低，这与本研究结果不一致，这可能和镉对肠道菌群物种多样性的影响与物种、浓度、时间等因素紧密相关。除了物种多样性外，肠道菌群的结构组成也是衡量肠道健康的重要指标。多项研究表明，重金属会通过对机体的毒性作用，破坏肠道微生物的平衡使机体处于亚健康状态^[25]。通过16S rRNA高通量测序，检测到变形菌门、厚壁菌门和放线菌门构成优势菌群。其中厚壁菌门能够参与纤维素和淀粉的降解^[26]，放线菌门可以代谢碳水化合物产生乳酸以维持环境酸性并抑制肠道内致病菌的生长^[27]。本研究中镉改变了菌群物种的相对丰度，可能会对肠道产生一些负面影响。肠道是重金属主要的代谢部位，适量的重金属会抑制肠道有害菌的生长，但过量的重金属会破坏肠道的微生态平衡。本研究中，0.3×10⁻⁴ mg·L⁻¹的镉显著增加了厚壁菌门的丰度，降低了变形菌门和放线菌门的丰度。这可能是由于在低浓度镉的作用下，菌群通过自然选择逐渐形成对镉的适应性^[28]。随着浓度的增加，0.5×10⁻⁴和0.7×10⁻⁴ mg·L⁻¹组罗氏沼虾幼苗肠道菌群结构发生了显著变化：厚壁菌门的相对丰度降低，变形菌门和放线菌门的相对丰度增加。这种变化可能源于不同菌群对镉胁迫的差异性响应机制——部分菌群通过吸附或者沉淀镉离子实现解毒作用，从而在低镉环境中存活；而另一些菌群则因高浓度镉的毒性效应受到抑制。有研究表明，高碳酸盐碱度胁迫会显著抑制罗氏沼虾的生长^[29]。此外，镉胁迫诱导的肠道菌群结构紊乱还会削弱宿主的免疫防御能力。不同浓度的镉胁迫对肠道菌群丰度的差异化影响，不仅揭示了肠道菌群对镉胁迫的复杂适应机制，也反映了镉污染对肠道微生态平衡的破坏作用。这些微生态失衡可能导致罗氏沼虾生长性能下降，并对养殖生态系统产生潜在的负面影响。这些发现进一步证实了肠道菌群与宿主健康之间的密切联系。

肠道菌群可视为疾病的“指示器”，具有成为潜在疾病标志物的价值^[30]。本研究鉴定出拟杆菌门、变形菌门、浮霉菌门和髌骨细菌门为镉胁迫响应的重要门水平标志物种。其中，拟杆菌门在肠道菌群中占据优势地位 (约占总菌群的25%)^[31]，其功能包括预防病原体定殖和调节宿主免疫应答^[32]。变形菌门丰度升高与肠黏膜屏障损伤和上皮细胞功能紊乱相关，是菌群失调的典型特征^[33]。浮霉菌门主要生长在营养贫瘠环境，在碳氮循环中发挥关键生态作用^[34]。而髌骨细菌门作为外共生或寄生微生物，缺乏生物合成和DNA修复能力^[35]。由此可见，镉胁迫可能增加罗氏沼虾的疾病易感性，对养殖健康构成潜在风险。通过分析这些肠道菌群标志物的动态变化，可以了解镉影响宿主免疫和代谢功能，为防治镉相关虾类疾病提供科学依据。

有研究证明，镉引起肠道菌群紊乱会显著损害其正常代谢功能^[36]。肠道菌群与重金属之间存在双向关系：一方面重金属胁迫会改变菌群组成和代谢特征，另一方面菌群可通过调节pH和氧化还原平衡来影响重金属的吸收和代谢^[37]。本研究中，镉胁迫主要影响罗氏沼虾幼苗肠道菌群的新陈代谢。已有研究证实，拟杆菌门和厚壁菌门在肠道多种代谢活动中起关键作用^[38]。值得注意的是，0.1×10⁻⁴和0.3×10⁻⁴ mg·L⁻¹组在新陈代谢和遗传信息处理通路上表现出显著差异，提示不同镉浓度对肠道菌群的影响存在剂量效应。其原因可能是低浓度镉通过改变特定菌群丰度影响代谢通路，而高浓度镉则可能导致新陈代谢功能紊乱和遗传信息不稳定。若这种损伤加剧，可能引发肠道屏障功能破坏和炎症反应，显著增加疾病发生风险^[39]。因此，通过监测肠道菌群功能变化，可早期预警镉污染对罗氏沼虾健康的潜在危害，为采取针对性防控措施提供科学依据。

镉胁迫对罗氏沼虾幼苗肠道菌群的影响不仅揭示了肠道微生态的适应性变化，更对宿主的生长、免疫和疾病风险产生了深远影响。本研究结果为了解镉污染的生态毒理效应、优化水产养殖健康管理以及开发镉污染防治策略提供了重要理论依据。例如，通过益生菌调节肠道菌群是缓解镉胁迫所致肠道损失的有效手段^[40]。Zhai 等^[41]的研究发现，乳酸菌 (Lactobacillus spp.) 增加了小鼠 (Mus musculus) 粪便中的镉水平，有利于促进机体排镉。屈定武等^[42]也证实多形拟杆菌 (Bacteroides thetaiotaomicron) 能够有效改善铅暴露诱导的菌群紊乱。由此可见，特定益生菌在拮抗镉中毒方面具有显著潜力。基于此，建议在罗氏沼虾养殖过程中可适当补充益生菌，以增强机体免疫力。

4.   小结

综上所述，本研究采用16S rRNA测序技术分析了镉胁迫对罗氏沼虾幼苗肠道菌群的影响。结果表明，镉胁迫显著改变了肠道菌群的丰富度和结构组成，导致厚壁菌门和变形菌门等优势菌群的相对丰度发生变化，这些变化可能影响肠道菌群的代谢功能，打破菌群稳态。然而，肠道菌群影响代谢功能、免疫功能及其他靶器官的具体机制尚不清楚，需要结合其他指标进一步阐明。由于自然水体中常存在多种污染物复合胁迫，单一镉胁迫的研究结果可能无法全面反映实际污染情况。鉴于重金属毒性的不可逆性，预防措施尤为重要。虽然益生菌可能是缓解重金属污染的有效措施，但其具体机制仍需深入探究。