大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 又名加州鲈，原产于北美洲，是我国淡水鱼类养殖品种之一，具有生长速度快、抗病能力强、肉质鲜美细嫩等特点^[1]。2023年全国大口黑鲈养殖总产量达88.8 万吨，养殖区域主要分布在广东、浙江、湖北等地，占全国大口黑鲈养殖总产量的81.0%^[2]。大口黑鲈养殖地主要分布在南方地区，以鲜活零售为主，活鱼可较好地保持原有肌肉品质及营养价值，但由于分布地区的局限性，难以满足其他省份的实际需求，因此活鱼运输成为限制当前大口黑鲈产业发展的关键问题。目前，活鱼运输主要方式仍为有水运输^[3]，运输过程中会采取低温冷训或麻醉等措施使其处于镇静或休眠状态，从而降低新陈代谢、减少机械损伤，保障存活率^[4]。

应激反应是鱼类长时间保活运输过程中关注的核心，温度、氨氮浓度及溶解氧的异常都会引发应激反应。温度是影响鱼类活动最重要的环境因素之一，大多数鱼类的体温与所处环境水温相差0.5~1.7 ℃，当周围温度超出其适宜生存温度范围时，会导致鱼类的生理与生化指标发生改变^[5]。John等^[6] 对虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 的研究中发现，线粒体在低温条件下具有一定的温度适应性，且线粒体的能量转换效率更高、电子传递系统 (ETS) 功能较强；这些适应性变化有助于虹鳟在低温环境中维持其生理功能和生存能力。Nam等^[7] 研究缺氧对真鲷 (Pagrus major) 的影响时发现，间歇与持续性缺氧均会显著降低免疫力，并增加皮质醇水平，诱导脂质过氧化和氧化细胞损伤，短期缺氧导致真鲷体内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著升高，这表明体内抗氧化酶有助于缓解氧化应激带来的损害。鳃的组织学变化在鱼类中被广泛用作健康状态的指标。鳃的表面积大，直接与水体环境接触，对水体中的温度、溶解氧等环境因子变化非常敏感，外界环境的变化会迅速引起鳃组织的生理和生化变化，其组织学和细胞变化能有效反应鱼体损伤的程度^[8]。热应激会导致大西洋鲑 (Salmo salar) 的鳃损伤，如鳃小片上皮增生、肿胀与炎症^[9]。青鳉 (Oryzias latipes) 在高温和低温胁迫下鳃细胞均发生凋亡现象，并释放大量活性氧 (ROS)，从而诱导鳃组织的凋亡，甚至影响鱼的存活时长^[10]。因此，鳃组织是研究鱼类对环境胁迫响应的理想对象。

目前关于大口黑鲈低温运输应激的研究主要集中在肝脏组织和血清生理的变化方面，且多数使用麻醉鱼体进入休眠状态，存在一定的食品安全隐患。应激研究也多集中于养殖过程热应激反应^[11]。因此，本研究通过冷训诱导模式使鱼体进入半休眠状态，通过行为学观察初步确定大口黑鲈半休眠温度；比较不同温度条件暂养鱼体肌肉理化指标、血清生化特性、血清抗氧化指标变化，探讨合适的暂养温度，获得大口黑鲈低温半休眠状态下暂养的关键参数；通过鳃组织病理变化阐释冷应激对大口黑鲈抗氧化能力的影响，旨在探讨低温长时间暂养时鱼体氧化应激的反应，为大口黑鲈保活运输提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与试剂

鲜活大口黑鲈购于广州市鹭江新街市，体质量 (500±50) g，眼球清晰，体表无明显外伤，鳞片完整，鳍部无充血。1 000 μg·mL⁻¹ 氨氮标准溶液：GSB 04-2832-2011，国家有色金属及电子材料分析测试中心；纳氏试剂 ：HgI₂-KI-NaOH，坛墨质检科技股份有限公司；PBS缓冲液、多聚甲醛 (φ, 4%)、生理盐水 (w, 0.9%)：北京兰杰柯科技有限公司；EDTA脱钙液：飞净生物科技有限公司；浓硫酸、浓盐酸、无水乙醇：分析纯，广州化学试剂厂；生理生化指标测定试剂盒：南京建成科技有限公司；皮质醇 (Cortisol, COR) ELISA分析测定试剂盒：北京莱伯沃德科技有限公司。

1.2   试验仪器

多参数测量仪 (Multi 3630 IDS，德国WTW公司)；紫外可见分光光度计 (UV255，日本岛津公司)；多功能酶标仪 (Varioskan LUX，美国赛默飞世尔科技公司)；高速台式冷冻离心机 (TGL16M，湖南湘仪实验仪器开发有限公司)；冷水机 (KD2AS，广州市澳鑫设备科技有限公司)。

1.3   试验方法

将试验鱼运输至实验室暂养4 h以缓解网捕及运输应激，试验水体均为曝气后的自来水，暂养期间运行水循环过滤系统 (见图1) 对暂养水体进行温度控制，空气泵不间断供氧，保持溶解氧质量浓度7.8 mg·L⁻¹以上。

图  1  冷训及暂养装置示意图

Figure  1.  Schematic diagram of gradient cooling equipment

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1.3.1   行为学试验

以1.0 ℃·h⁻¹的速率缓慢降低大口黑鲈的暂养水体温度。统计单位时间内鳃盖张合的次数，鳃盖一张一合记为1次呼吸；记录不同温度下每尾鱼的行为特征和对外界刺激 (触碰、扶倒或敲击箱体等) 的反应灵敏度。

1.3.2   冷训试验

将暂养箱水温以3.0 ℃·h⁻¹匀速从室温 (24±1 ℃) 分别降温至9 ℃、12 ℃、15 ℃和20 ℃，每组25 尾鱼，每12 h采集水样和鱼样5 尾。以降温后暂养时间为0 h的大口黑鲈作为对照组，暂养密度鱼水比为1∶6 (kg·L⁻¹)，暂养期间室内无照明。

1.3.3   水质测定

试验组分别于0、12、36和48 h取100 mL水样置于100 mL聚乙烯瓶中，参照纳氏试剂分光光度法 (HJ 535—2009) 测定水质氨氮浓度^[12]。

1.3.4   肌肉指标测定

取鱼背部肌肉组织用生理盐水漂洗，滤纸擦干切块。准确称取样品5 g ，加入9倍体积的预冷0.9% (w) 生理盐水，在冰水浴中以转速1.2×10⁴ r·min⁻¹匀浆3~5 次，每次匀浆10 s，间隔30 s。匀浆好的肌肉于4 ℃条件下，以2 000 r·min⁻¹离心12 min，移取上清液进行测定。pH使用多参数测量仪测定；总蛋白 (The total protein, TP)、糖原 (Glycogen, Gly)、乳酸 (Lactic acid, LD) 使用试剂盒 (南京建成科技有限公司) 测定。

1.3.5   血清生化指标测定

于鱼体尾部静脉处抽取约2.0 mL血液至离心管内，全血不加抗凝剂，取样后立即放入4 ℃冰箱静置4 h。待血液出现明显血清分离后，于4 ℃条件下2 000 r·min⁻¹离心10 min，取上层血清于冻存管内，置于 −80 ℃超低温冰箱冻存，保存过程中避免血清样品反复冻融。严格控制每尾鱼采血时长在60±30 s之间。TP、葡萄糖 (Glucose, GLU)、乳酸脱氢酶 (Lactate Dehydrogenase, LDH)、皮质醇 (Cortisol, COR)、总抗氧化能力 (Total Antioxidant Capacity, T-AOC)、总超氧化物歧化酶 (Total Superoxide Dismutase, T-SOD) 及谷胱甘肽过氧化物酶 (Glutathione Peroxidase, GSH-Px) 使用试剂盒测定。

1.3.6   鳃组织结构测定

取降温处理后暂养0 h的正常状态大口黑鲈为空白对照，以低温暂养12、24、36和48 h后的大口黑鲈为试验组。取左侧第二鳃弓中段约2 cm小块，以5% (w) 生理盐水冲洗后用吸水滤纸轻拭擦干，避免鳃丝受损，随后立即置于4% (φ) 多聚甲醛溶液固定24 h，EDTA脱钙液处理后用PBS缓冲液洗脱备用。(1) 切片制备：将组织从缓冲液取出修整后，75% (φ) 酒精、90% (φ) 酒精、无水乙醇、二甲苯逐级脱水后浸蜡，石蜡包埋处理后切片，厚4 μm；(2) HE染色、无水乙醇与二甲苯脱水封片、镜检。

1.4   数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据处理，组间差异采用双因素方差 (Two-way ANOVA) 结合邓肯检验法进行比较分析，显著性水平为p<0.05；用GraphPadPrism 8绘制相关图表；采用R软件 (4.3.0) 进行可视化分析。

2.   结果

2.1   降温过程中的呼吸频率及行为学特征

试验采用的降温速率为1.0 ℃·h⁻¹，在降温过程中，鱼体呼吸频率随温度的变化见图2。由试验结果可知，大口黑鲈呼吸频率与水温之间存在线性相关性，在6~24 ℃的研究范围内发现水温越低，呼吸频率越低。

图  2  不同温度下大口黑鲈呼吸频率

Figure  2.  Respiratory rate of M. salmoides at different temperatures

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根据报道成年大口黑鲈的最适宜生存温度为15~30 ℃^[13]。由大口黑鲈行为学试验 (表1) 可知，当水体温度在适宜生存温度区间时，18~24 ℃鱼体行为较为正常，鱼体游动缓慢或静于箱底，呼吸较有规律，对外界刺激反应敏感；随温度下降，鳃盖张合幅度减小，但仍易于观测；14~16 ℃时，鱼体对外界刺激反应明显减弱，当水温降至12 ℃时，鱼体外观无明显变化，眼球清澈，体表无明显充血，敲击水箱或轻触鱼体时反应不敏感；当水温降至10 ℃时，出现鳍条或体表充血，并伴随鳞片脱落；如果此时继续降低水温至8 ℃以下，会导致鱼体侧翻，并产生躁动不安、撞击箱体等应激行为，若短时间内置于常温水体中5 min可恢复正常状态，如果长时间处于此状态下会导致鱼体呼吸中断，出现死亡。

表  1  不同温度下大口黑鲈行为学特征

Table  1.  Behavioral characteristics of M. salmoides at different temperatures

温度 Temperature/℃	行为学特征 Behavioral characteristics
24	呼吸规律，缓慢游动，对外界刺激反应敏捷
22
20	鳃盖张合幅度减小，静止在水箱底部，尾部有摆动，对轻微触碰反应敏感
18
16	静止在水箱底部，尾部无摆动，对外界刺激有反应，反应较弱
14	呼吸缓慢，基本不游动
12	鳃盖张合幅度极小，对触碰反应迟钝，轻触使鱼体倾斜，能缓慢回正
10	眼睛有微弱浑浊出现，鱼体失去平衡左右倾斜
8	鱼体侧翻，出现浮头行为，鳍条充血
6	鳍条、体表充血，呼吸极不规律，开始出现裂鳃、死亡

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2.2   低温暂养过程中水质氨氮浓度的变化

与暂养结束时 (48 h) 相比，各温度试验组的ATN质量浓度均显著上升 (p<0.05)，且各温度下组间差异显著 (p<0.05)。其中水温20 ℃条件下ATN质量浓度上升速度最快；当水体温度降到12 ℃ (即大口黑鲈半休眠温度) 或更低时，暂养水体ATN质量浓度显著低于15 ℃和20 ℃ (p<0.05)，且随着暂养时间的增加，ATN质量浓度上升速度也相对缓慢。

图  3  温度对水质氨氮总质量浓度的影响

注：* 表示总体氨氮浓度差异 (双向重复测量方差分析，p<0.05)。

Figure  3.  Effect of temperature on total ammonia mass concentration in water quality

Note: *. Overall difference in ammonia nitrogen concentration (Two-way repeated measures ANOVA, p<0.05).

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2.3   低温暂养过程中肌肉生理生化指标的变化

肌糖原 (Gly) 含量在各试验组暂养初期普遍下降，随后9 ℃和15 ℃条件下暂养12 h后Gly逐渐上升，12 ℃条件下24 h后开始回升，且15 ℃组上升速率显著高于其他组，而20 ℃条件下Gly含量持续下降 (图4-a)。

图  4  温度对大口黑鲈肌肉组织糖原含量 (a)、乳酸含量 (b)、pH (c) 和总蛋白含量 (d) 的影响

注：*表示此温度与12 ℃组间差异显著 (双向重复测量方差分析，p<0.05)；ns表示此温度与12 ℃组间差异不显著 (双向重复测量方差分析，p>0.05)。

Figure  4.  Effect of temperature on Gly (a), LD (b), pH (c) and TP (d) of M. salmoides muscle tissue

Note: *. Significant difference between this temperature and the 12 ℃ group (Two way repeated measures ANOVA, p<0.05); ns. No significant difference between this temperature and the 12 ℃ group (Two way repeated measures ANOVA, p>0.05).

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9 ℃、15 ℃和20 ℃条件下肌肉组织LD含量在暂养期间整体呈先上升后下降的趋势 (图4-b)；鱼体肌肉组织pH随暂养时间延长呈略微下降的趋势，且变化幅度较小，其中15 ℃、20 ℃与9 ℃、12 ℃条件下肌肉pH差异显著 (p<0.05) (图4-c)。12 ℃试验组LD含量与pH在暂养期间均无显著性变化 (p>0.05)。

4个温度试验组中肌肉组织总蛋白定量 (TP) 在暂养48 h过程中均无显著性变化 (p>0.05)，且各温度试验组之间均无显著性差异 (p>0.05) (图4-d)。

2.4   低温暂养过程中血清生化指标的变化

TP含量在9 ℃条件下呈下降趋势；15 ℃和20 ℃暂养期间逐渐上升，至36 h达到峰值 (图5-a)。GLU浓度随暂养时间延长整体呈下降趋势，9 ℃和12 ℃条件下暂养24 h时略有升高，48 h时GLU浓度较0 h时显著降低 (p<0.05) (图5-b)。LDH活性在各温度试验组中均呈先上升后下降的趋势 (图5-c)。COR浓度在9 ℃条件下呈上升趋势；在15 ℃和20 ℃条件下，随着胁迫时间的延长呈下降趋势 (图5-d)。另外，在15 ℃和20 ℃条件下，TP和GLU水平整体显著低于9 ℃和12 ℃水平 (p<0.05)；LDH活性和COR浓度整体显著高于9 ℃和12 ℃水平 (p<0.05)。

图  5  温度对大口黑鲈血清总蛋白含量 (a)、葡萄糖含量 (b)、乳酸脱氢酶活性 (c) 和皮质醇浓度 (d) 的影响

Figure  5.  Effect of temperature on TP (a), GLU (b), LDH (c) and COR (d) in M. salmoides serum

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2.5   低温暂养过程中血清抗氧化相关酶能力的变化

各温度试验组中，大口黑鲈血清中T-AOC水平和T-SOD活性随暂养时间增加均呈先下降后上升趋势 (图6-a、6-b)；暂养48 h后，9 ℃、15 ℃和20 ℃组T-AOC活性整体下降，12 ℃组T-AOC活性提高。12 ℃、15 ℃组血清中GSH-Px活性在暂养过程中无显著性差异 (p>0.05) (图6-c)；在15 ℃、20 ℃条件下，T-AOC水平整体显著高于9 ℃、12 ℃水平 (p<0.05)，GSH-Px活性整体显著低于9 ℃、12 ℃水平 (p<0.05)。

图  6  温度对大口黑鲈血清总抗氧化能力 (a)、总超氧化物歧化酶 (b) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (c) 活性的影响

Figure  6.  Effect of temperature on T-AOC (a), T-SOD (b) and GSH-Px (c) in M. salmoides serum

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2.6   低温暂养条件下大口黑鲈鳃组织结构的变化

对鱼鳃切片 (图7) 观察发现，禁食暂养前鳃丝排列有序，左右对称，分布均匀，大小一致，顶端略有膨大，鳃小片细长且排列整齐，鳃丝中的氯细胞相对稀疏；呼吸上皮细胞和柱状细胞排列整齐有序；48 h结束暂养后大口黑鲈鳃组织与暂养前 (0 h) 相比，鳃丝明显弯曲，排列不规整，鳃丝宽度增加；泌氯细胞数量增加，体积增大；各试验组中均出现明显的黏液细胞肿胀现象；扁平上皮细胞出现与鳃小片分离的现象，形成空腔，有溶解、脱落趋势；在15 ℃组中能够观察到鳃丝充血，柱状细胞空泡变形且排列不规则，此外，呼吸上皮组织增生且水肿，鳃小片基部充血且轻微卷曲。在9 ℃和20 ℃组中能够观察到部分细胞轮廓不清且细胞核溶解，此外，呼吸上皮细胞水肿、变性、坏死且大面积脱落，鳃小片变厚、变短、弯曲且大面积融合。

图  7  (a) 为暂养0 h的对照组鳃组织；(b)、(c)、(d)、(e) 分别为9 ℃、12 ℃、15 ℃和20 ℃暂养48 h的鳃组织 (400×)

注：GL. 鳃小片；PVC. 呼吸上皮细胞；PC. 柱状细胞；BC. 血细胞；CC. 泌氯细胞；SSL. 鳃小片变短；CL. 鳃小片弯曲；LF. 鳃小片融合；LBS. 血窦；Hp. 增生；Ct. 顶部棒状结构；Ms. 黏液细胞肿胀。

Figure  7.  (a). Control group gills without holding for 0 h; (b), (c), (d), (e). Gills of low-temperature stress groups held for 48 h at 9, 12, 15, and 20 ℃, respectively (400×).

Note: PL. Gill filaments; GL. Gill lamellae; PVC. Respiratory epithelial cells; PC. Cuboidal cells; BC. Blood cells; CC. Chloride cells; SSL. Shortening of gill lamellae; CL. Curvature of gill lamellae; LF. Fusion of gill lamellae; LBS. Blood sinuses; Hp. hyperplasia; Ct. Top rod-like structure; Ms. Swollen mucus cells.

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水体温度为9 ℃、15 ℃条件下，暂养48 h后观察到泌氯细胞体积明显增大，鳃丝中血细胞排列疏松，数量明显减少，呼吸上皮细胞有明显溶解现象。而12 ℃条件下，暂养48 h后观察到鳃丝中血细胞仍有序排列，且细胞核清晰可见，鳃小片没有明显的弯曲变形情况发生。

3.   讨论

3.1   大口黑鲈的半休眠温度及行为学分析

鱼体的半休眠状态是指在特定环境条件下，如温度降低时代谢率和活动能力明显减弱的一种生理状态^[14]。在这种状态下，鱼类的呼吸和代谢水平降到最低，生命活动速率大幅度降低，但并未完全停止。这种状态有助于鱼类在不利的环境条件下，如低温环境中存活更长时间，因为它可以减少能量消耗，延长存活期^[15]。半休眠状态是一种适应性生理反应，使鱼类能够在水温降低时保持生命活动，但活动水平和代谢率均显著降低^[16]。

本研究表明温度的降低导致鱼类的代谢活动减缓、代谢率降低，因此呼吸频率也随之降低。在Anna Belcher等^[17] 的研究中通过测量不同温度下鱼类的呼吸电子传递系统 (electron transfer system, ETS) 活性，发现温度对鱼类的呼吸频率有显著影响，该研究中提到，通过Arrhenius方程和活化能15 kcal·mol⁻¹，可以将呼吸率估计值校正到原位温度，这表明温度是影响鱼类呼吸频率的一个重要因素，且这种影响可以通过线性方程来描述，与本研究趋势相一致。

当水温降至12 ℃时，鱼体对外界刺激反应不敏感，且在轻触扶倒后鱼体可缓慢回正，无应激反应出现；此时眼球清澈无浑浊，鳍部、尾部无明显充血，鱼体外观无明显变化，仍为健康状态；因此认为12 ℃为大口黑鲈的半休眠温度。

3.2   不同温度下暂养对水质氨氮指标的影响

大口黑鲈作为变温动物，其新陈代谢速率受水温影响显著^[18]。20 ℃水温条件下，较高水温加速了大口黑鲈新陈代谢。蛋白质代谢过程会产生氨氮等废物，从而导致氨氮浓度增加；另外较高温度可提高微生物分解有机物的速率，进一步增加了ATN质量浓度；同时，氨氮胁迫还会增加血清中的抗氧化酶活性，如SOD和CAT，这可能是机体对抗氧化损伤的一种补偿机制^[19]。

在12 ℃条件下，可能因为大口黑鲈为适应低温条件，主动降低代谢强度，进入半休眠状态，导致氨氮生成速度减弱。且低温可以增加水中溶氧量，高溶氧有助于维持硝化作用 (氨氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐的过程) 的进行^[20]，从而减少氨氮物质的积累。因此，维持水体温度于较低水平能够有效地控制水体中氨氮物质的积累。

3.3   暂养温度对肌肉生理生化指标的影响

暂养初期，鱼体没有外部能量摄入，会动用储备能源来维持血糖水平和能量供应^[21]。随着低温暂养时间的延长，由于鱼体饥饿且水体氨氮浓度升高，同时溶解氧下降，鱼体的有氧代谢受到抑制，无氧代谢 (特别是糖酵解) 增加，糖原在无氧条件下分解产生乳酸，乳酸的积累导致肌肉pH下降^[22]。随着暂养时长延长至36 h，可能由于鱼体长时间的缺乏食物和活动量减小，能量需求降低，导致肌肉组织中乳酸的产生减少。Mohamed等^[23] 关于运输过程对斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 肌肉品质影响的研究发现，运输后的鱼与未经运输的鱼相比，肌肉pH较低，与本试验结果相似。

一项调查大口黑鲈在急性缺氧应激下生理响应的研究^[24] 结果显示，缺氧应激显著增加了肝糖原的分解和血糖浓度，表明在急性缺氧下糖原是主要的能量来源。在本试验中，9、12和15 ℃试验组中Gly含量的回升可能是由于鱼体通过调节肝糖原的消耗以适应应激，或调节糖原分解和代谢途径来提供更多的能量来满足ATP的持续需求^[25]。在20 ℃的条件下，鱼类的代谢活动较为活跃，导致肌糖原的消耗速率增加，尤其在没有食物摄入的情况下，鱼体更多地依赖内部能量储备^[26]。并且，鱼体也可能通过调节如糖原和脂肪储备等其他能量来源来满足能量需求，从而减少对肌肉蛋白的依赖^[27]。崔雁娜等^[28] 的研究中提到，暂养处理对大口黑鲈肌肉中的营养成分影响不大，这表明在一定时间内，大口黑鲈肌肉中的总蛋白质含量能够保持稳定。这与本试验的结果相一致，尽管在短期内蛋白质含量可能因为分解代谢的增加而出现波动，这种代谢调节有助于肌肉组织中的蛋白质保持动态平衡。

代谢变化是鱼类适应性反应的核心，它们通过生理调节机制来适应应激，调动能量储备以抵御外界干扰^[29]。总体上，12 ℃试验组在12~48 h暂养期间肌糖原含量、肌肉组织pH、总蛋白质含量和乳酸含量在暂养期间均无显著性变化 (p>0.05)。在此温度下，鱼体活动强度降低，代谢速率减缓，蛋白质的分解和合成速率相对稳定，表明了鱼体在暂养过程中对代谢和应激的适应性管理，以及对肌肉品质的维持^[30]。

3.4   暂养温度对血清生化指标的影响

为适应低温环境，暂养初期葡萄糖的大量分解会导致血糖水平下降；随后，鱼体可能通过调节蛋白质代谢来维持其生理功能，特别是在没有食物摄入的情况下，通过肝脏糖原的快速动员和糖异生途径的短暂活跃来快速响应能量需求^[31-32]，从而引起血清TP含量和GLU浓度短暂上升。随暂养时间的延长，肝脏糖原储备的消耗和糖异生能力的下降会导致血糖水平逐渐下降^[33]，因此24 h后GLU浓度下降幅度较大。

在较适宜温度下，鱼体代谢活跃，增加的肌肉活动可能会导致乳酸增多^[34]，随着水质的劣化及溶解氧降低，无氧代谢增加，从而增加LDH活性。皮质醇作为硬骨鱼类的主要皮质类固醇激素^[35-36]，其浓度与温度下降相关。9 ℃条件下，COR浓度升高有助于抑制某些免疫反应，减小能量消耗。陆健等^[37] 研究表明急性高温胁迫导致大口黑鲈COR水平下降，与本试验结论相一致。

12 ℃试验组中，大口黑鲈开始进入半休眠状态，此时鱼体代谢减缓，对外界环境的压力较小，因此蛋白质合成和分解能够维持动态平衡，COR浓度波动不显著，血清中TP含量和COR浓度在暂养期间均无显著性变化 (p>0.05)。

3.5   暂养温度对血清抗氧化相关酶能力的影响

暂养期间，鱼体需要消耗更多的抗氧化物质来应对这些应激^[38]。暂养初期，T-AOC、T-SOD活性持续下降。鱼体的抗氧化系统可能无法得到有效的恢复和补充，T-SOD被快速消耗以应对增加的氧化压力^[39]。强俊等^[40] 对吉富罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 幼鱼的研究也表明，鱼体通过调节代谢应对胁迫，氧自由基也随之产生，抗氧化相关酶难以抵御氧化损伤，导致血清抗氧化酶活性降低。随后，鱼体逐渐适应新的环境条件，这种适应性调节可能包括上调抗氧化酶的表达、增加抗氧化物质的合成等，从而增强了总抗氧化能力^[41]，使得T-AOC、T-SOD活性上升。T-SOD活性的恢复还可能涉及到其他抗氧化酶和非酶性抗氧化剂的协同作用，这些物质可能在初期被消耗，随后通过生物合成途径得到补充，共同影响了T-SOD活性的变化。

GSH-Px与超氧化物歧化酶 (SOD) 等其他抗氧化酶协同，共同构成细胞的抗氧化网络。SOD将超氧阴离子 (${\mathrm{O}}_2^{\text{−}} $) 转化为H₂O₂，随后GSH-Px进一步将H₂O₂还原为水。在面对环境变化 (如温度、氧气水平、污染等) 时，鱼体可能需要调整其抗氧化系统的活性以适应这些变化。在20 ℃条件下，GSH-Px在暂养前期快速下降；张美东等^[42] 对鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 的研究也发现，由于代谢活动的增加，导致更多的自由基产生，鱼体对GSH-Px的需求增加。在9 ℃的条件下，GSH-Px活性随时间延长而下降，可能由于低温抑制了GSH-Px的活性，使其无法有效清除氧化产物。

12 ℃条件下，暂养48 h后T-AOC活性相较于暂养前显著升高，说明在此条件下鱼体抗氧化能力的整体增强，能够更有效地清除自由基和过氧化物，保护细胞免受氧化损伤。

3.6   暂养温度对鳃组织结构的影响

鳃是鱼类进行呼吸作用的器官，还具有调节渗透压、平衡酸碱、排泄废物的功能，受到外界胁迫时直观表现为微观组织结构的变化^[43]。鳃丝两侧有许多细板条状突起且彼此对称，并垂直于鳃丝，排列紧密，为鳃小片；扁平上皮细胞分布包被于鳃小片表面，不仅是气体交换的主要场所，还被认为具有渗透压调节功能^[44]。鳃丝的伸长和宽度的增加，有利于加大与水体的接触面积，增强呼吸作用和物质交换。泌氯细胞胞体变大可有效提高其泌氯功能以及代谢水平，鳃小片中血细胞增多以应对机体应激。

鱼类会以慢性及急性的方式对各种应激胁迫做出反应^[45]，鳃组织可能会遭受两种类型的损伤。第一种是由防御反应引起的损伤，Li等^[46] 发现随着低氧程度的加剧，鲢 (Hypophthalmichthys molitrix) 鳃组织上皮细胞层的肿胀和脱落加剧，血窦中的红细胞分布不均匀且堆积，普遍存在空泡现象。第二种是直接损伤，Jin等^[47] 发现，氨氮胁迫会导致四指马鲅 (Eleutheronema tetradactylum) 幼鱼鳃组织的严重损伤，暴露48 h后，呼吸上皮细胞坏死且部分脱落，泌氯细胞增生，部分肿胀且空泡化，鳃小片变短、弯曲。

在本实验中，大口黑鲈在48 h低温暂养过程中，受低温、低氧及氨氮等胁迫，作为响应，鳃呼吸上皮细胞脱落，泌氯细胞增殖，主动渗透调节机制被破坏。当鱼体的抗氧化能力较强时 (如T-AOC、T-SOD活性增强)，鳃组织的损伤程度较轻。例如，在12 ℃条件下，T-AOC活性显著升高，鳃组织的损伤主要表现为防御型损伤 (如水肿和细胞脱落)，而未出现严重的直接损伤。当抗氧化能力较弱时 (如GSH-Px活性被抑制)，鳃组织的损伤程度加重，出现上皮细胞坏死、鳃小片弯曲等直接损伤。

在12 ℃条件下，鱼体的抗氧化能力和鳃组织的功能均表现出较好的适应性。T-AOC活性升高，鳃组织的损伤以防御型为主。其余温度组鱼体暂养过程中，抗氧化能力下降，鳃组织的损伤加重，具体表现为鳃丝水肿、增生、坏死和融合，细胞脱落、破裂和坏死等。该结果与前述暂养过程行为学结果相符合，表明水体温度12 ℃为大口黑鲈半休眠温度。

4.   结论

大口黑鲈在12 ℃时进入半休眠状态。随着低温暂养时间的延长，水质中的氨氮含量随暂养时间的增加而增加，大口黑鲈肌肉组织、血清生化、鳃组织产生一定程度的应激损伤；血清抗氧化指标与鳃组织损伤存在一定的负相关性。当暂养水温维持在12 ℃时，鱼体肌肉组织中pH、Gly、LD与TP均无显著性变化，血清生化指标及抗氧化能力均能较好维持，总体优于其他温度试验组。因此，在实际保活流通过程中，建议12 ℃水体温度更适合作为大口黑鲈暂养及长途运输的初始条件。