Effects of flow velocity on swimming behavior of Lateolabrax maculatus juvenile with different population sizes
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摘要:
为研究花鲈 (Lateolabrax maculatus) 对流速的行为适应特征，采用泳道流速仪测定了不同数量 (1、2、4、6、8尾) 花鲈幼鱼在多种流速 (0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 BL·s−1，BL为体长) 下的游泳行为。结果显示，当流速达到4.5 BL·s−1时，各组群体运动速度 (Group movement speed, Gc) 均显著低于单尾鱼游泳速度 (p<0.05)。随着流速增加，反映鱼群凝聚力的个体间距离 (Inter-individual distance, IID) 在各组均呈先降低后上升的趋势，并在流速达到3.5~4.5 BL·s−1时出现最低值，且最低值对应的流速随着群体数量的增加而增大。反映鱼群协调性的游泳速度同步性 (Swimming speed synchrony, Sv) 与IID呈相反的变化趋势，且Sv峰值对应的流速也随着群体数量的增加而增大。当流速达到1.0 BL·s−1时，单尾鱼摆尾频率 (Tail beat frequency, TBF) 均显著高于相同流速下的其他各组 (p<0.05)。随着流速的增加，花鲈钻石型排布模式所占比例先下降后上升，方阵型模式所占比例则呈相反的变化趋势，但在各实验组中，不同流速下的花鲈均以钻石型排布模式为主。综上所述，随着流速的增加，花鲈群体的凝聚力和协调性均先升高后降低，群体数量的扩大有利于提高花鲈鱼群凝聚力和协调性，并且花鲈主要采用钻石型排布模式来降低游泳能量消耗。
Abstract:To investigate the behavioral characteristics to flow velocity, we measured the swimming behaviors of juvenile Lateolabrax maculatus of different individuals (1, 2, 4, 6 and 8) at various flow velocities (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 and 5.0 BL·s−1; BL: Body length) by using swimming ability test tank. When the flow velocity reached 4.5 BL·s−1, the group movement speed (Gc) of fish schooling was significantly lower than that of single fish (p<0.05). With an increase in the flow velocity, the inter-individual distance (IID) (Reflects the cohesion of fish swarm) first decreased and then increased in each group, and valley values were observed when the flow velocity reached 3.5–4.5 BL·s−1. Besides, the flow velocity corresponding to the above IID valley increased with the expansion of fish population. The trend of swimming speed synchrony (SV), reflecting the coordination of fish population, was completely opposite with that of IID, and the flow velocity corresponding to the SV peak also increased with the fish schooling expansion. When the flow velocity reached 1.0 BL·s−1, the tail beat frequency (TBF) of single fish wassignificantly higher than that of other groups at the same flow velocity (p<0.05). With the increase of flow velocity, the proportion of diamond lattice displayed in fish schooling first decreased and then increased, which was opposite to the phalanx lattice pattern. However, the pattern of diamond lattice was always dominant in each group at different flow velocities. In conclusion, with the increase of flow velocity, the cohesion and coordination of L. maculatus schooling first increased and then decreased. The expansion of the fish population is conducive to improving its cohesion and coordination, and the fish mainly adopts adiamond lattice pattern to reduce swimming energy consumption.
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Keywords:
- Lateolabrax maculatus /
- Flow velocity /
- Population size /
- Swimming behavior /
- Energy strategy
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鸢乌贼(Symplectoteuthis oualaniensis)属于柔鱼科、鸢乌贼属，在中国南海海域广泛分布，其资源丰富，价格低廉，蛋白质含量高，脂肪含量低，富含人体必需氨基酸[1]，是一种高品质的海洋来源蛋白；但由于其肉质较硬、口感不佳，仅被用于制备鱼糜制品等，并且在加工水平上较为薄弱，严重影响市场销量。肌原纤维蛋白是肌肉中最重要的蛋白质，占总蛋白的50%~55%，对肉制品的组织结构具有重要作用，但由于其较低的溶解性、热稳定性和化学稳定性导致应用受限[2]，因此通过一定改性方式提高蛋白的功能性质将能扩大其在食品中的应用范围。
糖基化反应是糖分子还原末端的羰基与蛋白质分子侧链中的氨基共价连接形成糖蛋白的过程，是一种无化学试剂参与的绿色安全的蛋白质分子修饰方法，糖接枝后蛋白质由于结构改变，使得一些功能性质如溶解性、起泡性、乳化性得到明显提高[3-4]，对于扩大其在食品中的应用具有重要意义。较多研究也表明糖基化会使接枝产物具有更高的抗氧化活性及抗炎活性[5-6]。利用蛋白质与糖类制备美拉德反应产物以替代合成抗氧化剂使用，已成为国内外研究热点[7]。
水产品是一种较好的制备抗氧化活性肽的来源，目前已有较多针对罗非鱼(Oreochromis spp.)、蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)等制备生物活性肽的研究[8]，但对鸢乌贼肌原纤维蛋白改性产物酶解及生物活性的研究较少。吴静等[9]研究了鸢乌贼木瓜蛋白酶酶解产物的抗氧化性，发现酶解产物在不同环境因素下均较稳定。褐藻寡糖是褐藻胶经裂解酶作用后产生的寡聚物，分子量低，水溶性强，具有一定的免疫、抗氧化和降血糖、降脂等生物活性[10]，同时褐藻寡糖具有还原末端[11]，是一种较好的糖基化接枝产物，前期研究表明肌原纤维蛋白与褐藻寡糖接枝可显著提高蛋白的溶解性和起泡性等功能性质[12-13]。Saigusa等[11]发现三文鱼肌原纤维蛋白与褐藻寡糖接枝产物酶解得到的多肽抗炎活性显著提高。人体摄入糖基化改性蛋白后在体内经胃肠道消化降解，能够被直接吸收达到相应的生物学功效。然而，糖基化对鸢乌贼肌原纤维蛋白消化后的酶解产物抗氧化性的影响尚未可知。因此，本文采用肌原纤维蛋白与褐藻寡糖接枝，对接枝产物及其体外模拟消化产物的抗氧化性及氨基酸组成进行分析，明确糖基化对鸢乌贼肌原纤维蛋白及其消化过程中水解程度和抗氧化性的影响，并从酶解液氨基酸组成方面分析酶解糖基化产物营养特性变化，以期为糖基化肌原纤维蛋白功能性的提升及其应用提供理论支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鸢乌贼购于湛江水产市场；褐藻寡糖购于青岛博智汇力生物科技公司；胰蛋白酶(250 U·g–1)、胃蛋白酶(250 U·g–1)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)购于美国Sigma aldrich公司；Tricine-SDS-PAGE试剂购于康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
THZ-82型恒温水浴震荡箱(金坛精达仪器制造厂)；T50型均质机(德国IKA公司)；3K30型冷冻离心机(德国Sigma公司)；Alphal-4冷冻干燥机(德国Christ公司)；UV2550紫外分光光度计(日本岛津公司)；Meter Sunrise酶标仪(奥地利Tecan公司)；Powerpac HV等电聚焦电泳仪(美国Bio-rad公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 鸢乌贼肌原纤维蛋白的制备
参照Saeki[13]的方法，取绞碎的乌贼肉置于3倍原料肉体积的50 mmol·L–1 氯化钠(NaCl)、质量分数0.5% Triton X-100溶液中漂洗10 min，倒掉悬浮物。漂洗过的肉置于8倍原料肉体积的上述溶液中，冰水浴条件下经均质机20 000 r·min–1均质2 min后纱布过滤，所得滤液离心机8 000 g、4 ℃离心10 min，取沉淀物。用50 mmol·L–1 NaCl漂洗并离心，重复3次。尼龙布过滤，沉淀即为肌原纤维蛋白。上述实验步骤通过冰水浴控制于8 ℃以下进行。
1.2.2 肌原纤维蛋白与褐藻寡糖接枝产物的制备
采用考马斯亮蓝法测定1.2.1中沉淀中肌原纤维蛋白的浓度，将肌原纤维蛋白溶解于50 mmol·L–1 的NaCl溶液中，使蛋白质量浓度为5.00 mg·mL–1，与褐藻寡糖按质量比1∶1混合均匀，之后冷冻干燥，取冻干粉在相对湿度35%、温度50 ℃条件下进行干热反应，分别在第0、第6、第12和第18小时取样，最终产物溶解后再次冻干并保存于 –18 ℃备用。
1.2.3 自由氨基浓度测定
准确称取40 mg的邻苯二甲醛溶解于1 mL的甲醇中，分别加入质量分数20%的SDS 2.5 mL、0.1 mol·L–1的硼砂25 mL及100 μL β-巯基乙醇，用蒸馏水定容至50 mL。糖基化反应产物(第0、第6、第12和第18小时)分散于Tris-HCl缓冲液(40 mmol·L–1，pH 7.5，分别含0.05 mol·L–1和0.5 mol·L–1的NaCl)，对所得溶液进行稀释。取稀释后的溶液200 μL加入4 mL邻苯二甲醛溶液中，摇匀后于室温下反应2 min，在340 nm的波长条件下测定其吸光值。在邻苯二甲醛溶液中加入200 μL的蒸馏水作为空白，以L-亮氨酸代替样品作标准曲线，计算得出样品中自由氨基的浓度。
1.2.4 肌原纤维蛋白模拟体外消化酶解
参考Saigusa等[11]的方法。将肌原纤维蛋白及接枝物分散于50 mmol·L–1的NaCl溶液中，将饱和硫酸铵溶液(pH 7.5)添加到蛋白悬浮液中，使硫酸铵溶液最终质量浓度为600 g·L–1。离心(10 000 g，30 min，4 ℃)得沉淀，重复2次以除去未反应的褐藻寡糖。将所得沉淀悬浮于50 mmol·L–1 NaCl溶液中，使得蛋白质量浓度为10 mg·mL–1，使用1.0 mol·L–1的盐酸(HCl)调节pH至2.0，将胃蛋白酶添加到悬浮液中[m (酶)∶m (底物)=1∶100]，37 ℃保温3 h，之后用1.0 mol·L–1 氢氧化钠(NaOH)调pH至8.0，将胰酶添加到悬浮液中[m (酶)∶m (底物)= 1∶100]，37 ℃保温3 h。酶解液煮沸15 min灭活酶，冻干后于 – 20 ℃保存备用。
1.2.5 SDS-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
对糖基化肌原纤维蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。样品液以5 mg·mL–1的质量浓度与上样缓冲液混合(体积比4∶1)，沸水中煮沸5 min，使蛋白变性，冷却，离心后上样，上样体积10 μL 。凝胶电泳过程中保持浓缩胶80 V恒压，分离胶100 V恒压。对蛋白酶解产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析[11]，浓缩胶浓度为4%，夹层胶浓度10%，分离胶浓度为16%，稳压操作条件下，电泳过程中浓缩胶电压27 V，夹层胶60 V，分离胶90 V，2种电泳胶均采用考马斯亮蓝R-250进行染色，高甲醇的乙酸溶液进行脱色。
1.2.6 DPPH自由基清除率测定
参考Chen等[14]的方法略做修改。将0.007 9 g的DPPH溶于100 mL无水乙醇中，取2 mL 5 mg·L–1样品加2 mL无水乙醇作为空白记为Aj；取2 mL无水乙醇加2 mL DPPH作为对照，记为A0；再取2 mL 5 mg·L–1样品与2 mL DPPH溶液混合，记为Ai。摇匀，室温避光30 min，在517 nm波长下测其吸光度。DPPH自由基清除率=[1 – (Ai – Aj)/A0]×100%。
1.2.7 还原力测定
参照Ahmadi等[15]的方法，取2 mL 5 mg·mL–1的样品加入2 mL 0.2 mol·L–1的磷酸(H3PO4)缓冲液(pH 6.6)和2 mL 1%的铁氰化钾溶液，50 ℃水浴振荡20 min，再加入2 mL 10%的三氯乙酸，震荡摇匀后离心(10 000 g，10 min)，取2 mL上清液加入2 mL去离子水和0.4 mL质量分数为0.1%三氯化铁(FeCl3)溶液，50 ℃水浴10 min，在700 nm波长下测其吸光度，表征还原力大小。
1.2.8 酶解产物氨基酸组成分析
取蛋白样品加入6 mol·L–1的HCl，110 ℃水解24 h后，采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量。其中色氨酸(Trp)用碱水解后测定。
1.2.9 数据处理
数据分析与结果绘图分别采用SPSS 17.0 和Origin 8.0 软件，数据均以3组数据的平均值表示，方差分析采用Duncan法，显著性水平为0.05。
2. 结果与分析
2.1 糖基化肌原纤维蛋白自由氨基浓度变化
糖基化反应过程中糖分子的还原羰基末端与蛋白质的自由氨基基团 [如赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)-NH2)] 发生缩合反应，随着糖基化反应程度增加，蛋白质中自由氨基浓度逐渐减少，因此自由氨基的浓度可反映蛋白质接枝的程度。随着反应时间的延长，肌原纤维蛋白糖基化改性产物的自由氨基浓度随时间延长显著降低(P<0.05)，由第0小时的6.86 mmol·L–1降至第18小时的2.65 mmol·L–1(图1)。此外，反应12 h内自由氨基浓度降低了75.78%，表明反应在前12 h较为迅速，同时前期研究结果已表明与褐藻寡糖接枝第12小时时蛋白溶解性最高，12 h后蛋白褐变强度增加变得缓慢[16]，因此后续糖基化反应控制接枝时间为12 h。
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图 1 肌原纤维蛋白自由氨基浓度随糖基化反应时间的变化Figure 1. Change of free amino acids concentration of glycosylated myofibrillar protein with reaction time2.2 SDS-PAGE电泳图谱
鸢乌贼肌原纤维蛋白的主要成分包括肌球蛋白(150 kD)和肌动蛋白(42 kD)[11]。糖基化后，条带3中蛋白的肌球蛋白条带、肌动蛋白条带以及小于20 kD的蛋白条带颜色均变浅，与此同时条带上移，在图谱顶端出现了分子量更高的聚合物条带，表明褐藻寡糖分子接枝在肌原纤维蛋白分子上，接枝产物具有更高的分子量(图2)。酶解后产物主要成分为小分子蛋白和多肽，因此酶解产物采用Tricine-SDS-PAGE电泳图分析。由条带4~6可看出，经胃蛋白酶和胰酶酶解6 h后肌原纤维蛋白的肌球蛋白条带已消失，大分子蛋白或肽链被水解为小分子的肽段，表明大多数肌原纤维蛋白可被消化酶有效降解。此外，肌原纤维蛋白酶解物在50 kD左右尚有部分条带可见，因此此部分蛋白未被有效水解，而肌原纤维蛋白第12小时接枝物在此分子量范围内并无蛋白残余，且在10~15 kD处的条带颜色明显比未接枝肌原纤维蛋白水解物更深，这表明糖基化使蛋白的酶解程度增强，推测可能与糖基化改变了蛋白结构有关。前期研究指出，糖基化使蛋白二级结构中的β-折叠含量降低，而β-转角含量显著升高[16]。二级结构的变化表明糖分子接枝使蛋白分子结构伸展，内部氨基酸残基暴露，因此更有利于蛋白酶水解，从而增加了模拟消化过程中小分子肽的生成量。
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图 2 肌原纤维蛋白接枝产物及酶解产物SDS-PAGE电泳图M. 标准蛋白；1~3. 肌原纤维蛋白，第0小时接枝物，第12 小时接枝物；4~6. 肌原纤维蛋白酶解产物，第0小时接枝物酶解产物，第12小时接枝物酶解产物Figure 2. SDS-PAGE pattern of glycosylated myofibrillar protein and its hydrolysatesM. protein marker; Lane 1–3. myofibrillar protein (Mf), glycosylated Mf (0th hour) and glycosylated Mf (12th hour); Lane 4–6. Mf hydrolysates, glycosylated Mf (0th hour) hydrolysates and glycosylated Mf (12th hour) hydrolysates2.3 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基是一种稳定的自由基，其乙醇溶液在波长517 nm处有特征吸收峰。DPPH自由基清除率被广泛用于抗氧化活性评价[17]。肌原纤维蛋白及其接枝产物均表现出一定的DPPH自由基清除效果，酶解前肌原纤维蛋白的清除力为38.78%，而糖基化反应第0小时已使产物DPPH清除能力提升至65.61%，糖基化反应第12小时时接枝物清除力达到79.53%，DPPH自由基清除力显著提高(P<0.05，图3)。因此糖基化改性可有效提升肌原纤维蛋白的抗氧化活性，且混合物未干热反应前即具有较高的抗氧化活性，这首先与褐藻寡糖本身即具有抗氧化及清除自由基的作用有关[18]。前人研究指出在混合物冷冻干燥过程中，已有部分接枝反应产生[11]；此外，糖基化也会使蛋白分子结构展开[16]，暴露出更多的疏水基团，使其更易与脂溶性的DPPH自由基反应，从而提升了DPPH自由基清除能力。Nishimura等[19]的研究发现鸡肉肌原纤维蛋白随着与麦芽糖干热反应时间延长，抗氧化性逐渐增强，表明中间产物氨基还原酮含量逐渐增加。
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图 3 糖基化肌原纤维蛋白酶解过程DPPH自由基清除能力的变化大写字母表示相同酶解时间时不同蛋白样品差异显著(P<0.05)；小写字母表示相同蛋白样品不同酶解时间差异显著(P<0.05)；后图同此Figure 3. DPPH radical-scavenging activity of glycosylated myofibrillar protein and its hydrolysatesUppercase letters indicate significant difference between protein samples at the same hydrolysis time; lowercase letters indicate significant difference for the same protein sample at different hydrolysis time. The same case in the following figure.对肌原纤维蛋白及糖基化产物进行酶解，其DPPH自由基清除率呈现略微下降趋势，这与Borawska等[20]、Teixeira等[21]报道的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)蛋白、鳕(Gadus)蛋白消化后抗氧化性的变化相一致，未水解的肌原纤维蛋白本身存在一些肌肉中的天然多肽，肌肉组织中还含有一些游离氨基酸、酶类、胡萝卜素、维生素C (VC)、维生素E (VE)、辅酶Q及一些金属离子，这些在蛋白提取过程中均被提取出来，从而使肌原纤维蛋白本身即具有较高的抗氧化性，而这些物质在模拟消化过程中活性降低。Borawska等[20]还指出，酶解产生了低分子量的氨基酸和多肽，体系极性增加，导致消化产物与疏水性评价体系中的DPPH自由基结合能力减弱。此外还可发现，酶解前后蛋白接枝物的DPPH自由基清除率均高于原始肌原纤维蛋白以及糖基化反应前的蛋白-褐藻寡糖混合物，因此糖基化反应可有效提高肌原纤维蛋白在消化过程中的抗氧化活性。
2.4 还原力
还原力的大小反映抗氧化剂供电子能力的强弱，还原力与抗氧化能力成正相关[22]。肌原纤维蛋白接枝物的还原力显著高于肌原纤维蛋白(P<0.05)，且在糖基化反应第0小时，还原力即由肌原纤维蛋白的0.25升至0.49，接枝反应12 h后产物还原力提升至0.55，表明褐藻寡糖的加入可显著提高肌原纤维蛋白的抗氧化活性(图4)。然而，采用胃蛋白酶和胰酶对蛋白溶液进行模拟消化后，酶解液的还原力均显著降低，这一趋势与DPPH自由基清除能力的变化一致，可能是由于模拟消化过程中，蛋白水解程度较高，较多氨基酸的产生降低了蛋白分子的完整性，因此减弱了清除自由基的能力。这与沙小梅等[22]的研究结果一致，该研究指出经过整个胃肠道水解后，蛋白的羟基自由基清除能力均比胃酶水解后降低。此外，糖基化第12 小时的酶解液还原力降低幅度明显低于糖基化第0小时的蛋白-褐藻寡糖的混合物，这可能是由于接枝后的蛋白在酶解过程中产生了更多具有抗氧化活性的多肽，图2中的电泳图谱也表明糖基化产物在消化后产生了更多低分子量的小肽，可更好地保持消化过程中蛋白的抗氧化能力。本研究中鸢乌贼肌原纤维蛋白模拟消化产物的还原力与Borawska等[20]报道的草鱼肌原纤维蛋白酶解物的还原力较为接近，但显著高于其他鱼类肌原纤维蛋白及菌类的模拟消化产物[20,23]。因此糖基化鸢乌贼肌原纤维蛋白能够作为良好的电子供体在食品中发挥较好的抗氧化能力。
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图 4 糖基化肌原纤维蛋白酶解过程中还原力变化Figure 4. Reducing power of glycosylated myofibrillar protein and its hydrolysates2.5 氨基酸组成
蛋白质中氨基酸组成对蛋白抗氧化能力及机体各项生理功能具有重要意义。在鸢乌贼肌原纤维蛋白及其接枝产物中，谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)含量较高，此外7种必需氨基酸含量也较高，约占总氨基酸的37.49%~39.63% (表1)。同时肌原纤维蛋白Lys含量较高，占7.76%~8.11%。Lys是人体重要的必需氨基酸，在谷物类主食中含量较少，因此鸢乌贼蛋白作为一种补充Lys较好的食物来源，可用于改善我国居民膳食氨基酸组成。
表 1 酶解液氨基酸组成及百分含量Table 1. Amino acids composition for different hydrolysates% 氨基酸种类
amino acid肌原纤维蛋白
myofibrillar protein第0小时接枝物
glycosylated protein at 0th hour第12小时接枝物
glycosylated protein at 12th hour苯丙氨酸 Phe 4.71 4.73 4.78 丙氨酸 Ala 5.88 6.11 6.24 蛋氨酸 Met 3.37 1.71 1.19 脯氨酸 Pro 1.70 1.96 2.06 甘氨酸 Gly 3.81 3.91 3.98 谷氨酸 Glu 17.36 18.34 18.31 精氨酸 Arg 7.95 7.99 8.16 赖氨酸 Lys 8.11 7.91 7.76 酪氨酸 Tyr 3.85 3.83 3.85 亮氨酸 Leu 9.25 9.37 9.49 丝氨酸 Ser 5.15 5.30 5.37 苏氨酸 Thr 4.87 4.97 5.11 天冬氨酸 Asp 11.03 11.17 11.21 缬氨酸 Val 3.81 4.07 4.05 异亮氨酸 Ile 4.54 4.24 4.25 组氨酸 His 2.56 2.44 2.46 色氨酸 Trp 0.97 1.06 0.86 胱氨酸 Cys 1.05 0.90 0.86 必需氨基酸
essential amino acids39.63 38.06 37.49 疏水性氨基酸
hydrophobic amino acids34.71 35.37 35.58 在模拟消化过程中，胰酶中的胰蛋白酶主要水解连接Lys和Arg的肽键，而胰凝乳蛋白酶主要水解疏水性氨基酸周围的肽键[24]。酶解产物具有较高含量的疏水性氨基酸 [酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)]，达34.71%~35.58% (表1)，这可能与糖基化提高了酶的水解程度有关，胰凝乳蛋白酶的水解作用使更多的疏水性氨基酸暴露，肌原纤维蛋白水解物含有较多的疏水性氨基酸，这一结论与Najafian和Babji[25]的研究结果一致，其指出通过色谱分离的抗氧化肽具有更强的疏水性。Suetsuna等[26]研究指出，组氨酸(His)具有咪唑基，具有较好的脂游离基淬灭能力，因而含有His的肽链抗氧化活性较高；Tyr为潜在的氢供体，故含Tyr的肽链抗氧化活性也较高。然而第12小时接枝物酶解液中以上2种与抗氧化有关的氨基酸含量比肌原纤维蛋白酶解液低(表1)，因此接枝物较高的抗氧化活性可能主要来自于含疏水性氨基酸的肽段。当抗氧化肽序列中疏水性氨基酸较多时，会增加脂质的溶解度，增强与自由基相互作用，从而增加多肽的抗氧化活性[27-28]。同时蛋白氨基酸与还原糖末端美拉德反应形成的类黑精抗氧化物质也会提升产物的抗氧化性[29]。此外，多肽的抗氧化活性除了与其氨基酸组成及含量有关，氨基酸的排布序列对其同样有重要影响[30]。糖基化蛋白酶解后必需氨基酸的比例略有下降，这主要是由于一些氨基酸如Lys的自由氨基与褐藻寡糖分子发生了美拉德反应。
3. 小结
本研究分析了褐藻寡糖糖基化对鸢乌贼肌原纤维蛋白体外消化特性及酶解产物性质的影响，结果表明糖基化反应后肌原纤维蛋白自由氨基浓度降低，高分子量条带加深，生成了接枝产物。糖基化蛋白酶解产物中低于10 kD的多肽含量显著增多，表明糖基化促进了蛋白的酶解。糖基化可显著提高肌原纤维蛋白及其酶解产物的DPPH自由基清除率及还原力，并可更好地保持蛋白质在体外消化过程中的抗氧化活性。糖基化蛋白酶解液中疏水性氨基酸的含量增加，但必需氨基酸的含量略有降低。综上所述，糖基化反应能够显著提高鸢乌贼肌原纤维蛋白的水解程度，蛋白接枝物的Lys和必需氨基酸含量较高，同时具有良好的抗氧化性，是一种优质营养的水产蛋白来源，具有较好的营养价值及应用前景。
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图 2 群体排布模式示意图
注：a. 方阵型；b、c. 钻石型。
Figure 2. Schematic diagram of fish schooling layout pattern
Note: a. Phalanx lattice; b, c. Diamond lattice.
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图 3 流速对花鲈幼鱼群体运动速度的影响
注：n代表花鲈数量。图中不同字母表示同一组别之间差异具有显著性 (p<0.05)。
Figure 3. Effect of flow velocity on group movement speed of L. maculatus juvenile
Note: n represents the number of L.maculatus. Different letters in the figure represent significant differences within the same group (p<0.05).
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图 4 流速对花鲈幼鱼个体间距离的影响
注：n代表花鲈数量。图中不同字母表示同一组别之间差异具有显著性 (p<0.05)。
Figure 4. Effect of flow velocity on inter-individual distance of L. maculatus juvenile
Note: n represents the number of L. maculatus. Different letters in the figure represent significant differences within the same group (p<0.05).
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图 5 流速对花鲈幼鱼个体游泳速度同步性的影响
注：n代表花鲈数量。图中不同字母表示同一组别之间差异具有显著性 (p<0.05)。
Figure 5. Effect of flow velocity on speed synchronization of L. maculatus juvenile
Note: n represents the number of L. maculatus. Different letters in the figure represent significant differences within the same group (p<0.05).
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图 6 流速对花鲈幼鱼摆尾频率的影响
注：n代表花鲈数量。图中不同字母表示同一组别之间差异具有显著性 (p<0.05)。
Figure 6. Effect of flow velocity on tail beat frequency of L. maculatus juvenile
Note: n represents the number of L. maculatus. Different letters in the figure represent significant differences within the same group (p<0.05).
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图 7 流速对花鲈幼鱼排布模式的影响
注：n代表花鲈数量。图中大写字母用来标记方阵型排列模式差异性，小写字母用来标记钻石型排列模式差异性，其中不同字母表示同一组别之间差异具有显著性 (p<0.05)。
Figure 7. Effect of flow velocity on schooling layout pattern of L. maculatus juvenile
Note: n represents the number of L. maculatus. Capital letters represent the differences in phalanx lattice pattern, while lowercase letters represent the differences in diamond lattice pattern. Different letters in the figure represent significant differences within the same group (p<0.05).
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