Study on preparation of Sargassum fusiforme oligosaccharides by enzyme and its antioxidant and antibacterial properties
-
摘要:
羊栖菜多糖 (Sargassum fusiforme polysaccharides) 是羊栖菜中含量最丰富且极具特色的有效成分。海洋寡糖是由海洋多糖降解而来的产物。为从羊栖菜中提取活性较高的寡糖，并探究其抗氧化性及抑菌活性，以水提法所得的羊栖菜多糖为原料，利用褐藻胶裂解酶对其进行酶解，制备羊栖菜寡糖。通过单因素和正交试验，对酶解工艺进行优化，考察底物质量分数、加酶量和酶解时间3个因素对羊栖菜寡糖还原糖含量及平均聚合度的影响，确定酶解羊栖菜寡糖的最佳工艺参数为：酶解时间48 h、底物质量分数1.5%、加酶量20 U·mL−1，测得还原糖的质量浓度为 (26.53±0.92) mg·mL−1。经薄层层析法分析所制备寡糖的主要成分为单糖、双糖和三糖。抗氧化性和抑菌活性的测定结果表明：当质量浓度为3.0 mg·mL−1时，寡糖对DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS [2,2'-联氮-双 (3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐]、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到63.1%、80.7%、71.3%和57.2%，当质量浓度为3.5 mg·mL−1时，寡糖的还原力为0.923。抑菌活性结果表明，当羊栖菜寡糖质量浓度在10和100 mg·mL−1时，对白色念珠菌 (Candida albicans)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌 (Escherichia coli)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)均具有较好的抑菌作用。相对于羊栖菜多糖，羊栖菜寡糖在抗氧化性和抑菌活性上均有更好的表现。
Abstract:Sargassum fusiforme polysaccharides are the most abundant and extremely distinctive ingredients in S. fusiforme. Marine oligosaccharides are products derived from the degradation of marine polysaccharides. To extract more active oligosaccharides from S. fusiforme, we investigated the effects of oligosaccharides on antioxidant and antibacterial properties. We took S. fusiforme polysaccharide through water extraction as the raw material and prepared it by using enzymatic hydrolysis with fucoidan lyase. Then, we conducted single factor and orthogonal trials to optimize the enzymatic hydrolysis process. We examined the average degree of polymerization and reduced sugar content of S. fusiforme oligosaccharides in relation to substrate concentration, enzyme dosage, and enzymatic hydrolysis time. The optimal process parameters for enzymatic hydrolysis of S. fusiforme oligosaccharides were as follows: enzymatic hydrolysis time of 48 h, substrate concentration of 1.5%, enzyme dosage of 20 U·mL−1, and a measured reducing sugar content of (26.53±0.92) mg·mL−1. Thin layer chromatography was used to produce the monosaccharides, disaccharides and trisaccharides. The antioxidant and antibacterial properties of oligosaccharides were determined: when the mass volume concentration was 3.0 mg·mL−1, the scavenging rates of DPPH, ABTS, hydroxyl radical and superoxide anion radical were 63.1%, 80.7%, 71.3% and 57.2%, respectively. When the mass volume concentration was 3.5 mg·mL−1, the reducing power of oligosaccharides was 0.923. The bacteriostatic results show that S. fusiforme oligosaccharides have good bacteriostatic impact on Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Compared with S. fusiforme polysaccharide, it shows enhanced antioxidant and antibacterial effects.
-
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种具有旋光活性的高效广谱抗菌药，农业生产上可以有效治疗家畜家禽及水产生物所患的由致病性革兰阴性菌引起的疾病[1-3]。然而，氯霉素可以引起一系列严重的“三致”毒性和临床不良反应[4]。氯霉素对实验动物的致癌性证据充分，而对人体的致癌性证据有限。因此世界卫生组织(World Health Organization，WHO)中的国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)在1990年将其归为2A类致癌物质(对人很可能致癌)[1,5]。此外，氯霉素可通过短期可逆性的骨髓抑制，引起各类血细胞的减少，如血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏症等。严重时氯霉素可引起不可逆的再生障碍性贫血，患者造血功能极少恢复，虽然发生较晚但死亡率高，而且存活者也容易发生粒细胞性白血病。氯霉素的另一个严重不良反应是会引起灰婴综合征(gray baby syndrome，GBS)，摄入大剂量氯霉素后，血药浓度异常增高引起婴儿的循环衰竭[6]。
因此，我国农业部235号公告明确规定，氯霉素为禁止用于所有食品动物的药物，在所有食品动物中不得检出[7]。近年来，有媒体报道称在贝类产品中检出氯霉素，原因可能是运输者为了防止贝类在运输途中滋生细菌，人为非法添加氯霉素。针对该情况，笔者对2015—2017年市场、渔获码头贝类进行了跟踪抽样调查，采用GB/T 20756—2006液相色谱-串联质谱法，对贝类样品中氯霉素残留状况进行了检测，并采用国际食品法典委员会(CAC)推荐的遗传毒性致癌物危险性评估技术——暴露边界比（margin of exposure，MOE）法[8]，通过@risk软件对贝类中非法添加氯霉素可能引起的食品安全风险进行了评估。
目前，MOE法在风险评估中应用广泛[9-10]。MOE是对人或实验动物产生很小但可测量作用的剂量，与估计的人的暴露量之间的比率。遗传毒性的致癌物的MOE值通过该类物质的基准剂量最低限值(lower confidence limit on the benchmark dose，BMDL) 与估计人群暴露量的比值计算得到，BMDL是描述遗传毒性致癌物危害特征的起点。MOE值越小，说明该物质对人类的致癌危险性越大，反之就越小。王君和吴永宁[8]运用MOE法评价了遗传毒性致癌物丙烯酰胺的危险性；Thompson等[11]综合了机械学和药代动力学信息，得出了六价铬的参考剂量和MOE值；Okauru等[12]运用MOE法比较了多环芳烃和热水对食管癌发病的风险。本研究采用MOE法评价氯霉素的暴露量，可以很好地衡量相关风险。
@risk软件是一款基于蒙特卡罗模拟技术[13]加载到Microsoft Excel上进行风险评估和决策分析的专业软件[14]，该软件为Excel增添了高级模型和风险分析功能，允许在建立模型时应用各种概率分布函数，对各种可能出现的结果进行模拟，得出构成风险的各种事件的发生概率，并能够以各种图表展示分析结果[13,15-16]。
本研究首次采用蒙特卡罗模拟技术，基于@risk 7.5.2版本，通过对检测到的市售贝类产品中氯霉素质量分数数据进行分布拟合，并模拟抽样10 000次[13,16-17]，进而得到膳食暴露量的概率分布曲线及其中位数(P50)和第95百分位数(P95)的值，通过计算膳食摄入量和人群估计暴露量，对所得结果进行暴露边界比评价。属于定量的风险评估方法，得到的数据直观，可与其他类似风险进行横向比较。该方法可以较好地评估市售贝类产品中氯霉素的暴露风险，对该风险曾经发生、现在已基本消除的情况进行量化描述，以期说明通过加大执法力度进行风险管理可以消除该风险。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 样品采集
2015—2017年，根据《水产品抽样规范》(GB/T 30891—2014)的抽样方法，在市场采集贝类样品，每个档口只采集1个贝类品种且只算作1个样品，样品取净肉400 g，共300个样品，包括东风螺(Babylonia areolata)、翡翠贻贝(Perna viridis)、文蛤(Meretrix meretrix)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)、杂色蛤仔(R. variegata)、波纹巴非蛤(Paphia undulata)等。具体采样情况见表1。所采样品包括蛤类、螺类、贻贝等，均为市场常见品种，能够一定程度上反映当地贝类的消费情况。
表 1 2015—2017年市售贝类产品采样情况Table 1. Sample collection of commercially available shellfish in 2015−2017年份
year样品种类
species数量
quantity2015 文蛤 Meretrix meretrix 23 菲律宾蛤仔 Ruditapes philippinarum 23 杂色蛤仔 R. variegata 33 波纹巴非蛤 Paphia undulata 10 东风螺 Babylonia areolata 11 小计 subtotal 100 2016 文蛤 M. meretrix 26 波纹巴非蛤 P. undulata 11 菲律宾蛤仔 R. philippinarum 8 翡翠贻贝 P. viridis 55 小计 subtotal 100 2017 文蛤 M. meretrix 15 杂色蛤仔 R. variegata 6 波纹巴非蛤 P. undulata 12 翡翠贻贝 P. viridis 67 小计 subtotal 100 总计 total 300 1.1.2 试剂耗材
氯霉素(Dr.Ehrenstorfer，99.9%)、氯霉素-d5溶液(Dr.Ehrenstorfer，100.0 μg·mL–1)、正己烷(Sigma，≥95%)、乙酸乙酯(Sigma，≥99.7%)、甲醇(Fisher Scientific，99.9%)、氢氧化铵溶液(Macklin，25%~28%)、无水硫酸钠(广州化学试剂厂，≥99.0%)
1.1.3 仪器
API 3000-Agilent 1200 Series液相色谱-串联质谱仪、METTLER TOLEDO XS204电子天平、Thermo Scientific BIOFUGE STRATOS离心机、IKA MS3 basic涡旋振荡器、IKA T25 digital组织匀浆机、BUCHI R-215旋转蒸发仪。
1.2 样品分析
根据《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20756—2006)的相关规定进行检测。测定中采用空白实验、平行双样、质控样品测定、阳性复测等进行内部质量控制。
1.3 数据分析
1.3.1 检测结果
采用标准曲线法得到供试液中氯霉素的体积分数，贝类产品中氯霉素的残留量X=cV/m，c为供试液中氯霉素的体积分数，V为溶解残余物所用体积，m为贝类样品的质量。
1.3.2 暴露评估
1) 贝类产品中氯霉素质量分数数据的分布拟合。采用@risk软件，将贝类产品中氯霉素质量分数的检测值进行分布拟合。参照世界卫生组织《食品中痕量污染物的可靠评价》[18]和美国环境保护署(USEPA)建议的数据处理方法[19-20]，对于未检出样品按方法最低检出浓度的1/2进行处理取值，本研究中氯霉素的方法检出限为0.1 μg·kg–1，故对于未检出样品按照0.05 μg·kg–1进行处理取值。将得到的不同拟合曲线的拟合度运用卡方检验、安德森-达林检验、柯尔莫可洛夫-斯米洛夫检验这3种统计检验方法进行检验，并综合考虑3种方法的结果，最终确定最佳拟合分布[16-17,21-22]。
2) 膳食摄入量。根据GEMS/Food在2012年发布的数据，我国所在的G09区(东亚及东南亚地区)，软体动物的平均摄入量为12.2 g·d–1 [23]，采用最保守的估计值10 g·d–1为贝类产品的膳食摄入量。本研究在软件中设定膳食摄入量为(10±3) g·d–1，μ=10 g·d–1，σ=1的随机变化正态分布函数。
3) 每人每日膳食平均暴露量 [以下简称膳食暴露量(estimated dietary exposure，EXP)]。计算公式为：
$${\rm{EX}}{{\rm{P}}_{\rm{D}}}{{ = C}} \times I_D$$ (1) 其中EXPD为日膳食暴露量，C为贝类产品中氯霉素的质量分数，ID为日膳食摄入量。根据以上公式，将相关参数(包括软件拟合的贝类产品中氯霉素质量分数的分布函数)输入@risk软件，随机从贝类产品中氯霉素质量分数分布中抽取数值计算膳食暴露量，每次模拟过程循环10 000次，得到膳食暴露量P50和P95的值。
1.3.3 风险特征描述
暴露边界比评估。采用CAC推荐的遗传毒性致癌物危险性评估技术——MOE法[8,10,24]对市售贝类产品中氯霉素残留进行风险特征描述。根据公式MOE=BMDL/EXP，结合动物及临床实验数据，将BMDL定为每千克体质量1 mg·d–1。
EXP计算公式为EXP=EXPD/mb，其中mb为标准人体质量，按照60 kg计算，膳食暴露量按照公式(1)得到的膳食暴露量的P50和P95取值。
通过得到的MOE的P50和P95值进行评价，参照加拿大卫生部对于具有遗传毒性致癌物的MOE结果判定方法进行判定，即MOE值<5 000、5 000~500 000以及>500 000时分别表示被评估的危害物属于高、中、低危害程度[7]。
2. 结果
2.1 检测结果
所有样品均采用国标方法检测，经仪器分析的数据见表2。其中2015年的检出率为33%，2016年的检出率为3%，2017年的全部100个样品均未检出氯霉素残留，故在本研究中不继续计算2017年氯霉素的膳食暴露量。
表 2 2015—2017年市售贝类产品中氯霉素残留检测结果Table 2. Result of determination of chloramphenicol residues in commercially available shellfish in 2015−2017年份
year采集样品数
quantity of collected samples阳性样品数
quantity of positive samples检出值/μg·kg–1
range of concentration2015 100 33 0.36~4 050 2016 100 3 50.4~820 2017 100 0 – 总计 total 300 36 0.36~4 050 2.2 膳食暴露量
2.2.1 贝类产品中氯霉素质量分数数据的分布拟合
根据2.1的检测结果，在软件中分别进行2015年、2016年数据的分布拟合，经3种检验综合评价，数据更符合正态分布，得到最优的拟合曲线，分别为：
2015年，RiskNormal (121.43, 524.71, RiskTruncate(0, ))
2016年，RiskNormal (9.412 5, 82.293, RiskTruncate(0, ))
2.2.2 暴露评估结果
根据公式 (1)，将得到的@risk相关参数(表3)输入软件中。
表 3 氯霉素的膳食暴露量分析@risk软件计算参数Table 3. @risk parameter to calculate dietary exposure of chloramphenicol描述
description分布
distribution2015年氯霉素残留量 chloramphenicol residue, 2015 RiskNormal (121.43, 524.71, RiskTruncate(0, )) 2015年膳食摄入量 daily intake, 2015 RiskNormal (0.01, 1, RiskTruncate(0.007, 0.013)) 2015年膳食暴露量 dietary exposure, 2015 RiskOutput()+B1*B2 2016年氯霉素残留量 chloramphenicol residue, 2016 RiskNormal (9.4125, 82.293, RiskTruncate(0, )) 2016年膳食摄入量 daily intake, 2016 RiskNormal (0.01, 1, RiskTruncate(0.007, 0.013)) 2016年膳食暴露量 dietary exposure, 2016 RiskOutput()+B4*B5 在@risk软件中进行蒙特卡罗模拟，每次模拟过程循环10 000次，得到的膳食暴露量的概率分布曲线见图1。
![]()
图 1 氯霉素的膳食暴露量概率分布曲线Figure 1. Probability distribution curve of dietary exposure of chloramphenicol根据得到的氯霉素的膳食暴露量概率分布曲线，分别得到对应年份膳食暴露量的P50和P95 (表4)。
表 4 氯霉素的膳食暴露量Table 4. Dietary exposure of chloramphenicol年份
year膳食暴露量/μg·kg–1 dietary exposure 概率分布中位百分数
P50概率分布第95百分位数
P952015 3.91 11.5 2016 0.579 1.73 2017 – – 2.3 MOE
本研究采用单一食品选择研究法，定量估计的分析方式，通过计算得到的暴露量以及MOE值见表5。2015年居民消费贝类产品所致氯霉素的平均暴露量为每千克体质量0.065 1 μg·d–1，计算得到的MOE值为15 361，介于5 000~500 000，按照加拿大卫生部的标准，属于中危害水平。高暴露量人群的暴露量为每千克体质量0.192 μg·d–1，计算得到的MOE值为5 208，介于5 000~500 000，按照加拿大卫生部的标准，属于中危害水平。2016年居民消费贝类产品所致氯霉素的平均暴露量为每千克体质量0.009 65 μg·d–1，计算得到的MOE值为103 627，介于5 000~500 000，按照加拿大卫生部的标准，属于中危害水平。高暴露量人群的暴露量为每千克体质量0.028 8 μg·d–1，计算得到的MOE值为34 722，介于5 000~500 000，按照加拿大卫生部的标准，属于中危害水平。2017年由于在市售贝类产品中未检出氯霉素，属于无危害水平。
表 5 氯霉素的人群估计暴露量及暴露边界比Table 5. Estimated dietary exposure and margin of exposure of chloramphenicol年份
year人群估计暴露量/μg·d–1
EXP暴露边界比
MOE概率分布中位百分数
P50概率分布第95百分位数
P95概率分布中位百分数
P50概率分布第95百分位数
P952015 0.065 1 0.192 15 361 5 208 2016 0.009 65 0.028 8 103 627 34 722 2017 – – – – 3. 讨论
3.1 氯霉素BMDL的取值
目前的致癌理论认为，遗传毒性致癌物是一类通过诱发体细胞基因突变从而激活致癌基因或者灭活抑癌基因的表达从而诱发癌变的致癌物，在体细胞基因中几个分子甚至一个分子的基因突变就有可能诱发癌症[8]。氯霉素的致癌性也有类似特征，给其危害的评估带来一定困难。对市售贝类产品中氯霉素残留进行暴露评估，是一种行之有效的方法。
在致畸性研究中，氯霉素未表现出对大鼠、兔的致畸作用，但即使小剂量给药，均可引起高死胎率。几乎所有氯霉素致突变研究，均可得到阳性结果。氯霉素在离体细胞实验中可引发DNA断裂、染色体畸变并增加姐妹染色单体互换[25]。对于具有遗传毒性和致癌性的物质，传统假设它们没有阈值，并在任意暴露水平都会存在一定风险。故氯霉素无每日允许摄入量(acceptable daily intake，ADI)值，在世界粮农组织/世界卫生组织的报告中同样认为其无ADI值[3]。
BMDL的取值通常根据实验动物及临床实验数据得到，根据WHO的国际化学品安全规划(International Programme on Chemical Safety，IPCS)提出的“化学品危险性评估的剂量-反应分析建模的原则”[9]，风险评估时可通过实验数据的拟合分析得到基准剂量(benchmark dose，BMD)，进而得到BMDL值。由于氯霉素尚缺少BMDL值，需要根据各方面的实验数据综合考虑。研究表明，小鼠单次口服每千克体质量50 μg·d–1和100 μg·d–1的氯霉素可以引起染色体畸变[8]。成人或较大儿童应用氯霉素剂量大于每千克体质量100 μg·d–1，早产儿或新生儿大于每千克体质量25 μg·d–1可能引起灰婴综合征[2]，氯霉素注射液的临床用量为成人每日0.5~1 g[6]，按60 kg标准人体质量折算后为每千克体质量8~17 μg·d–1。以上剂量均为短期给药剂量，综合考虑长期食用的影响，本研究采用的BMDL为每千克体质量0.1 μg·d–1。该取值是否合理，仍需要更多数据进行评估。
3.2 氯霉素的限量值及最低执行限量要求
我国农业部235号公告明确规定氯霉素为禁用药物[3]。早在1969年，世界卫生组织(WHO)食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和联合国粮农组织(FAO)第12届会议就建议禁止使用氯霉素[5,22]。在欧盟规定(EEC) No.2377/90以及以后的各版本限量标准中，氯霉素被列在不制定残留限量标准(禁用)的物质中[11]。氯霉素在各个国家均无最高残留限量值(maximum residue limit，MRL)。
我国相关水产品检验检测标准中，由于采用的方法不同，氯霉素的检出限在0.1~0.3 μg·kg–1。欧盟委员会2003/181/EC决议的官方公报[26]以及全球水产养殖联盟(Global Aquaculture Alliance，GAA)制定的最佳水产养殖规范(Best Aquaculture Practice，BAP)中关于水产品中氯霉素残留的最低执行限量要求(minimum required performance limits，MRPL)为0.3 μg·kg–1。
本研究氯霉素的检出限为0.1 μg·kg–1，符合相关规定和检测要求；同时对于未检出的样品采用检出限的1/2进行处理取值符合相关指南的要求。
3.3 膳食摄入量
相对其他海产品，我国消费者人群贝类的膳食摄入量数据在文献报道中较少涉及。根据GEMS/Food在2012年发布的数据，我国所在的G09区，软体动物(包括贝类和头足类)的平均摄入量为12.2 g·d–1，该区淡水鱼的平均摄入量为27.0 g·d–1，海水鱼的平均摄入量为1.29 g·d–1，甲壳类的平均摄入量为5.29 g·d–1 [23]。《2002年中国居民营养与状况调查报告》中只统计了鱼类及虾蟹类的数据，数据显示我国居民平均每标准人日鱼类摄入量为24.8 g、虾蟹类的摄入量为4.8 g[27]。《广东省居民膳食营养与健康状况十年变化分析》(2002—2012)中只统计了鱼虾类的数据，每标准人日鱼虾类摄入量为56.8 g[28]。《中国居民营养与健康状况监测2010—2013年综合报告》的数据也只统计了鱼虾类的数据，城乡居民平均每标准人日鱼虾类摄入量为23.7 g，与2002年相比下降了5.9 g[29]。唐洪磊等[30]2006年的调查显示，广东省沿海城市，虾蟹贝类居民日均摄入量中值为24.8 g·d–1，均值为66.6 g·d–1。综合以上数据，本研究将10 g·d–1定为估计的我国居民贝类产品的膳食摄入量。
3.4 MOE法及其安全边界值
MOE分析技术是欧洲食品安全局在2005年FAO/WHO JECFA第64次会议上提出的，是评估遗传毒性致癌物危险性的有效方法。目前，虽然对于MOE值的分界值界定，国际社会尚没有一个公认值，不同国家及其机构的判定标准不一，但均可作为判定物质安全性的参考。加拿大卫生部对于MOE值分别界定了5 000和500 000两个分界值，分别界定出被评估危害物质危害程度的高、中、低[8]。英国癌症委员会(COC)的一个草案认为，MOE值达到10 000时可能已经足够安全。欧盟也认为MOE值达到10 000或以上，风险即较低[8,10,31]。本研究综合以上标准，采用较严格的加拿大卫生部标准，可以较好地区分不同年度市售贝类产品中氯霉素残留风险的严重程度。
3.5 贝类产品中氯霉素残留对消费者健康的风险评估
在2015年之前，市售贝类产品中人为违规添加氯霉素的情况均无人报道，其严重程度亦无从考量。自从2015年有媒体报道相关问题以来，政府部门便采取了一系列行动，以期能有效地控制该问题。本研究在2017年的采样检测时发现，市售贝类产品中氯霉素残留量已低于检测限，证明该问题已基本得到有效控制，对消费者的健康危害低。同时，监管部门仍应持续保持对此类风险问题的关注，以防死灰复燃。
-
![]()
图 1 酶解时间、底物质量分数、加酶量对酶解效果的影响
注：相同颜色方柱上的不同字母表示具有显著性差异 (p<0.05)。
Figure 1. Effect of enzymatic hydrolysis time and substrate concentration and enzyme amount on enzymatic hydrolysis
Note: Different letters on the bars of the same color represent significant differences (p<0.05).
![]()
图 2 羊栖菜寡糖的薄层层析图 (左为羊栖菜寡糖，右为褐藻寡糖标准品)
Figure 2. TLC diagram of S. fusiforme oligosaccharide (Left is S. fusiforme oligosaccharide and right is brown algae oligosaccharide)
![]()
图 3 羊栖菜多糖、L-抗坏血酸、羊栖菜寡糖对DPPH、ABTS、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除率(p<0.05)
注：不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)。
Figure 3. Scavenging rate of DPPH, ABTS free radical, hydroxyl radical, superoxide anion radical by S. fusiforme polysaccharide, oligosaccharide and L-ascorbic acid (p<0.05)
Note: Different lowercase letters represent significant differences between treatments (p<0.05).
![]()
图 4 羊栖菜多糖、寡糖的还原力 (p<0.01)
注：不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)。
Figure 4. Reducing power of S. fusiforme polysaccharide and oligosaccharide (p<0.01)
Note: Different lowercase letters represent significant differences between treatments (p<0.05).
![]()
图 5 羊栖菜寡糖和羊栖菜多糖的抑菌效果
注：a、b、c、d分别为铜绿假单胞菌、白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌；1、2、3号点分别为100、10、1 mg·mL−1的羊栖菜寡糖溶液；4、5、6号点分别为100、10、1 mg·mL−1的羊栖菜多糖溶液；中心点为1 mg·mL−1青霉素-链霉素溶液。
Figure 5. Antibacterial effect of S. fusiforme oligosaccharide and polysaccharide
Note: a. P. aeruginosa; b. C. albicans; c. E. coli; d. S. aureus; S. fusiforme oligosaccharide solution of 100 mg·mL−1 at Point 1, 10 mg·mL−1 a Point 2, 1 mg·mL−1 at Point 3; S. fusiforme polysaccharide solution of 100 mg·mL−1 at Point 4, 10 mg·mL−1 at Point 5, 1 mg·mL−1 at Point 6; 1 mg·mL−1 of penicillin-streptomycin solution at center point.
表 1 正交试验因素水平编码表
Table 1 Coding table of orthogonal experimental factor level
水平
Level因素 Factor A：酶解时间
Enzymatic
hydrolysis
time/hB：底物质量分数
Substrate mass
concentration/
%C：加酶量
Enzyme
amount/
(U·mL−1)1 36 0.5 10 2 48 1.0 20 3 60 1.5 30 
下载: 导出CSV
表 2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal test
试验号
Test No.因素 Factor 还原糖质量浓度
Reducing sugar mass
concentration/(mg·mL−1)A：酶解时间
Enzymatic hydrolysis time/hB：底物质量分数
Substrate mass fraction/%C：加酶量
Enzyme amount/(U·mL−1)1 1(36) 1(0.5) 1 (10) 4.55 2 1 2 (1.0) 2 (20) 22.36 3 1 3 (1.5) 3 (30) 24.11 4 2 (48) 1 3 11.92 5 2 2 1 17.34 6 2 3 2 26.53 7 3(60) 1 2 12.13 8 3 2 3 24.97 9 3 3 1 17.80 K1 51.02 28.60 39.69 K2 55.79 64.67 61.02 K3 54.90 68.44 61.00 k1 17.007 9.533 13.23 k2 18.597 21.557 20.34 k3 18.30 22.813 20.333 R 1.59 13.28 7.103 主次顺序
Order of importanceB>C>A 最优组合
Optimal combinationA2B3C2
下载: 导出CSV
表 3 自由基清除率
Table 3 Free radical scavenging rate
mmol·L−1 样品
Sample半抑制浓度 IC50 DPPH
自由基
DPPH free
radicalABTS
自由基
ABTS free
radical羟基
自由基
Hydroxyl
radical超氧阴离子
自由基
Super anion
radical多糖
Polysaccharide0.435 0.646 0.121 0.788 L-抗坏血酸
L-ascorbic acid— — 0.005 0.003 寡糖
Oligosaccharide0.102 0.085 0.013 0.170
下载: 导出CSV
-
[1] CHOI E Y, HWANG H J, KIM I H, et al. Protective effects of a polysaccharide from Hizikia fusiformis against ethanol toxicity in rats[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 47(1): 134-139.
[2] LIU Q Q, LI G Y , ZHU S F, et al. The effects of kelp powder and fucoidan on the intestinal digestive capacity, immune response, and bacterial community structure composition of large yellow croakers (Larimichthys crocea)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2024, 153: 109810.
[3] ALIMA A, MOHANNAD KAS, SHOEBUL I, et al. Seaweed polysaccharides: sources, structure and biomedical applications with special emphasis on antiviral potentials[J]. Future Foods, 2024, 10: 100440. doi: 10.1016/j.fufo.2024.100440
[4] 刘洪超. 羊栖菜多糖的提取分离、生物活性及结构鉴定[D]. 上海: 上海海洋大学, 2017: 14-15. [5] 余泳薏. 介质阻挡放电等离子体降解羊栖菜多糖及其免疫调节活性研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2023: 20-23. [6] EL-FAR Y M, KHODIR A E, EMARAH Z A, et al. Fucoidan ameliorates hepatocellular carcinoma induced in rats: effect on miR 143 and inflamnation[J]. Nutr Cancer, 2020, 73(8): 1-13.
[7] 马婷, 曲航, 杨海龙. 提取方法对羊栖菜多糖理化性质及体外生物活性的影响[J]. 食品安全质量检测学报, 2023, 14(15): 259-268. [8] ZHENG Q W, JIA R B, QU Z R, et al. Comparative study on the structural characterization and α-glucosidase inhibitory activity of polysaccharide fractions extracted from Sargassum fusiforme at different pH conditions. [J]. Int J Biol Macromol, 2021, 194: 602-610.
[9] MAO W J, LI B F, GU Q Q, et al. Preliminary studies on the chemical characterization and antihyperlipidemic activity of polysaccharide from the brown alga Sargassum fusiforme[J]. Hydrobiologia, 2004, 512(1/2/3): 263-266.
[10] PASKALEVA E E, LIN X, DUUS K, et al. Sargassum fusiforme fraction is a potent and specific inhibitor of HIV-1 fusion and reverse transcriptase[J]. Virol J, 2008, 5(1): 8. doi: 10.1186/1743-422X-5-8
[11] TANG M T, JIANG H, WAN C, et al. Hypolipidemic activity and mechanism of action of Sargassum fusiforme polysaccharides[J]. Chem Biodivers, 2023, 20(8): e202300264.
[12] HU P, LI Z X, CHEN M C, et al. Structural elucidation and protective role of a polysaccharide from Sargassum fusiforme on ameliorating learning and memory deficiencies in mice[J]. Carbohydr Polym, 2016, 139: 150-158.
[13] CHEN P, YANG S, HU C, et al. Sargassum fusiforme polysaccharide rejuvenates the small intestine in mice through altering its physiology and gut microbiota composition[J]. Curr Mol Med, 2017, 17(5): 350-358.
[14] 黄小流, 罗辉, 黄玉珊, 等. 马齿苋多糖对断奶大鼠肠道菌群影响的研究[J]. 动物营养学报, 2021, 33(8): 4694-4707. doi: 10.3969/j.issn.1006-267x.2021.08.048 [15] ZHANG Y B, QIN S, SONG Y P, et al. Alginate oligosaccharide alleviated cisplatin-induced kidney oxidative stress via Lactobacillus genus-fahfas-nrf2 axis in mice[J]. Front Immunol, 2022, 13: 857242. doi: 10.3389/fimmu.2022.857242
[16] 张玉姣, 孙晓娜, 田伟功, 等. 岩藻多糖及其降解物在小鼠肠道中的代谢及对肠道代谢产物的影响[J]. 现代食品科技, 2022, 38(12): 26-33. [17] IKEDA-OHTSUBO W, LOPEZ NADAL A, ZACCARIA E, et al. Intestinal microbiota and immune modulation in zebrafish by fucoidan from okinawa mozuku (Cladosiphon okamuranus)[J]. Front Nutr, 2020, 7: 67. doi: 10.3389/fnut.2020.00067
[18] 胡顺强, 郑恩萍, 赵婷雪, 等. 羊栖菜多酚微胶囊的制备及稳定性评价[J]. 现代食品, 2022, 28(15): 156-160. [19] 何丹. 利用羊栖菜开发生物有机肥及其应用研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2018: 13-15. [20] 季德胜. 羊栖菜多糖分离纯化、结构鉴定及拮抗UVB辐射造成的皮肤光老化损伤研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2017: 30. [21] DU R Y, GUO W W, YU S, et al. In situ assay of the reducing sugars in hydrophilic natural deep eutectic solvents by a modified DNS method[J]. J Mol Liq, 2023, 385: 122286.
[22] 葛东振. 酶法制备褐藻胶寡糖及其在方斑东风螺养殖上的应用评价[D]. 保定: 河北农业大学, 2022: 23-24. [23] 詹梦涛, 娄水珠, 刘仙花, 等. 3, 5-二硝基水杨酸法测定液体糖中总糖含量[J]. 云南民族大学学报 (自然科学版), 2020, 29(4): 317-321. [24] 汪梓旭. 孤囊马尾藻多糖与寡糖制备工艺优化[D]. 海口: 海南大学, 2020: 34-36. [25] 梁美娜, 张立宁, 林振, 等. 不同海区养殖羊栖菜组成分析及多糖的抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技, 2023, 44(22): 275-284. [26] 杨斯淇. 羊栖菜多糖酶解产物及其分离纯化组分的生物活性研究[D]. 杭州: 浙江工商大学, 2018: 30-32. [27] 褚晨亮, 欧阳东菊, 陈润柯, 等. 三桠苦提取物抑菌活性研究[J]. 山东化工, 2024, 53(4): 30-32, 36. doi: 10.3969/j.issn.1008-021X.2024.04.009 [28] 张占霞, 闫路娜, 崔媛婕. 响应面优化酶法提取地皮菜粗多糖工艺的研究[J]. 中国食品添加剂, 2024, 35(10): 118-124. [29] WU Q, QIN D D, CAO H X, et al. Enzymatic hydrolysis of polysaccharide from Auricularia auricula and characterization of the degradation product[J]. Int J Biol Macromol, 2020, 162: 127-135. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.06.098
[30] 王闪闪, 黄秀芳, 何华汉, 等. 山桐子饼粕多糖的提取优化及抗氧化活性研究[J/OL]. 中国粮油学报, https://doi.org/10.20048/j.cnki.issn.1003-0174.000977. [31] YIN D F, SUN X J, LI N, et al. Structural properties and antioxidant activity of polysaccharides extracted from Laminaria japonica using various methods[J]. Protoc Bioinformatics, 2021, 111(P2): 201-209.
[32] 许波杰, 闫培生. 褐藻多糖的提取及生物活性研究进展[J]. 现代食品科技, 2024, 40(7): 369-378. [33] 崔永燕, 杨敏, 刘楠, 等. 褐藻胶寡糖的酶法定向制备及其结构-功能关系的研究进展[J]. 食品科学, 2024, 45(10): 320-329. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20230512-109 [34] 邓雄, 熊燕飞, 伍树松, 等. 褐藻寡糖对低初生重断奶仔猪抗氧化能力、免疫功能和肠道上皮屏障的影响[J]. 动物营养学报, 2024, 36(7): 4271-4280. doi: 10.12418/CJAN2024.368 [35] 马斌, 苏航, 徐永江, 等. 褐藻寡糖对花鲈幼鱼生长和生理指标及肠道组织形态的影响[J]. 南方水产科学, 2024, 20(3): 76-84. doi: 10.12131/20240022 [36] 史文军, 王学江, 李峰, 等. 饲料中添加褐藻寡糖对脊尾白虾免疫能力的影响[J]. 江苏农业学报, 2024, 40(4): 698-710. doi: 10.3969/j.issn.1000-4440.2024.04.014 [37] 乔艳艳, 蒋洪洲, 李冬男, 等. 蓝莓多糖的结构解析、抗氧化及抗菌活性[J]. 食品科学, 2024, 45(21): 94-103. [38] 王转莉, 徐玲玲, 杨盼. 影响蒲公英多糖抑菌效果因素的研究[J]. 西安文理学院学报 (自然科学版), 2024, 27(4): 74-77. [39] 马巧丽, 胡玉龙, 李杰明, 等. 雪莲多糖的结构分析及其生物活性研究进展[J]. 中南药学, 2024, 22(8): 2138-2143. -
期刊类型引用(6)
1. 罗兰，王甫，黄承鹏，秦威振，任燕，林启辉. 深圳市市售动物源性食品中氯霉素残留量暴露评估. 中国食品卫生杂志. 2023(04): 581-586 . 
百度学术
2. 孙蕾. 市售水产品氯霉素残留污染状况及健康风险评估. 现代食品. 2022(22): 171-173 . 百度学术
3. 田甜，巫剑，文金华，曾祥林. 广西北部湾鲜活水产品中氯霉素残留的膳食暴露风险评估. 现代食品科技. 2021(05): 310-318+286 . 百度学术
4. 王胜，孙言凤，肖永华，黄常刚. 2011—2020年W市市售水产品中4种违禁渔药污染状况及暴露风险评估. 食品安全质量检测学报. 2021(24): 9612-9618 . 百度学术
5. 翟毓秀，郭萌萌，江艳华，姚琳，赵艳芳，吴海燕，李风铃，谭志军. 贝类产品质量安全风险分析. 中国渔业质量与标准. 2020(04): 1-25 . 百度学术
6. 黄思聪，龙敏仪. QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物. 肉类研究. 2019(06): 39-43 . 百度学术
其他类型引用(1)
计量
- 文章访问数: 439
- HTML全文浏览量: 4
- PDF下载量: 15
- 被引次数: 7
粤公网安备 44010502001741号
