Study on preparation of Sargassum fusiforme oligosaccharides by enzyme and its antioxidant and antibacterial properties
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摘要:
羊栖菜多糖 (Sargassum fusiforme polysaccharides) 是羊栖菜中含量最丰富且极具特色的有效成分。海洋寡糖是由海洋多糖降解而来的产物。为从羊栖菜中提取活性较高的寡糖，并探究其抗氧化性及抑菌活性，以水提法所得的羊栖菜多糖为原料，利用褐藻胶裂解酶对其进行酶解，制备羊栖菜寡糖。通过单因素和正交试验，对酶解工艺进行优化，考察底物质量分数、加酶量和酶解时间3个因素对羊栖菜寡糖还原糖含量及平均聚合度的影响，确定酶解羊栖菜寡糖的最佳工艺参数为：酶解时间48 h、底物质量分数1.5%、加酶量20 U·mL−1，测得还原糖的质量浓度为 (26.53±0.92) mg·mL−1。经薄层层析法分析所制备寡糖的主要成分为单糖、双糖和三糖。抗氧化性和抑菌活性的测定结果表明：当质量浓度为3.0 mg·mL−1时，寡糖对DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS [2,2'-联氮-双 (3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐]、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到63.1%、80.7%、71.3%和57.2%，当质量浓度为3.5 mg·mL−1时，寡糖的还原力为0.923。抑菌活性结果表明，当羊栖菜寡糖质量浓度在10和100 mg·mL−1时，对白色念珠菌 (Candida albicans)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌 (Escherichia coli)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)均具有较好的抑菌作用。相对于羊栖菜多糖，羊栖菜寡糖在抗氧化性和抑菌活性上均有更好的效果。
Abstract:Sargassum fusiforme polysaccharides are the most abundant and extremely distinctive ingredients in S. fusiforme. Marine oligosaccharides are products derived from the degradation of marine polysaccharides. To extract more active oligosaccharides from S. fusiforme, we investigated the effects of oligosaccharides on antioxidant and antibacterial properties. We took S. fusiforme polysaccharide through water extraction as the raw material and prepared it by using enzymatic hydrolysis with fucoidan lyase. Then, we conducted single factor and orthogonal trials to optimize the enzymatic hydrolysis process. We examined the average degree of polymerization and reduced sugar content of S. fusiforme oligosaccharides in relation to substrate concentration, enzyme dosage, and enzymatic hydrolysis time. The optimal process parameters for enzymatic hydrolysis of S. fusiforme oligosaccharides were as follows: enzymatic hydrolysis time of 48 h, substrate concentration of 1.5%, enzyme dosage of 20 U·mL−1, and a measured reducing sugar content of (26.53±0.92) mg·mL−1. Thin layer chromatography was used to produce the monosaccharides, disaccharides and trisaccharides. The antioxidant and antibacterial properties of oligosaccharides were determined: when the mass volume concentration was 3.0 mg·mL−1, the scavenging rates of DPPH, ABTS, hydroxyl radical and superoxide anion radical were 63.1%, 80.7%, 71.3% and 57.2%, respectively. When the mass volume concentration was 3.5 mg·mL−1, the reducing power of oligosaccharides was 0.923. The bacteriostatic results show that S. fusiforme oligosaccharides have good bacteriostatic impact on Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Compared with S. fusiforme polysaccharide, it shows enhanced antioxidant and antibacterial effects.
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羊栖菜 (Sargassum fusiforme) 是一种马尾藻属的大型经济褐藻，最早见于福建《漳浦县志》：“羊栖菜生海石上，长四五寸，色微黑。”此后在《闽书》及《漳州府志》上亦有记载。在浙江一带因形状酷似大麦被称为海大麦，中国 1958 年出版的《孢子 植物名称》中采用羊栖菜作为它的统一名称。作为暖温带-亚热带海藻，羊栖菜分布在中国东部与南部的各个海域、韩国和日本的沿海海域，并作为健康海洋蔬菜和长寿保健食品在日本、韩国广泛流行[1]。
羊栖菜多糖 (Sargassum fusiforme polysaccharides) 是羊栖菜中含量最丰富且极具特色的有效成分。相关研究表明，羊栖菜多糖主要包含褐藻多糖硫酸脂、褐藻淀粉以及褐藻胶等成分[2]，具有抗肿瘤[3-4]、调节人体免疫[5-6]、降血糖[7-8]、降血脂[9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]、改善记忆力[12]、预防衰老[13]、调节机体代谢[14-16]、调节鱼类微生物结构[17]等多种生理功能，应用范围广泛，还可被加工制成胶囊、口服液等多种保健品[18]。
相比多糖，寡糖的分子量更小，溶解性更佳，生物活性也得到一定程度的提升，且比多糖以及部分天然活性物质更加安全，更易被机体吸收利用[19]。目前，对于羊栖菜中多糖的研究已颇为丰富，对其提取方式、生理活性也有较为全面的了解，然而对羊栖菜寡糖的制备及其功能的研究却鲜有报道。海洋寡糖是由海洋多糖降解而来的产物。本研究以羊栖菜多糖为原料，采用褐藻胶酶进行酶解，制备羊栖菜寡糖，探究了羊栖菜寡糖的最佳制备工艺，并对其抗氧化性和抑菌活性进行了测定，旨在为羊栖菜寡糖的研究和开发利用提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊栖菜干清洗晾晒，烘干粉碎，过100目筛，得到羊栖菜粉末，用自封袋收集，干燥保存。羊栖菜干购自温州佳海食品有限公司；盐酸、氢氧化钠、无水葡萄糖、无水乙醇、石油醚60~90 ℃、苯酚、硫酸、硫酸铵、铁氰化钾、碳酸钾、L-抗坏血酸均购自国药集团化学试剂有限公司；褐藻胶裂解酶 (200 000 U·g−1) 购自上海华上翔洋生物技术有限公司；DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS [2,2’-联氮-双 (3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐] 购自阿拉丁生化科技股份有限公司；羟基自由基试剂盒、抗超氧阴离子试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-IF型单人双面无菌超净工作台 (苏州净化设备有限公司)，MJ-176NR型多功能粉碎机 (日本松下电器产业株式会社)，DZKW-4型电热恒温水浴锅 (北京中兴伟业仪器)，RE-5286A型旋转蒸发仪 (东南仪器有限公司)，SYQ-DSX-280B型高压灭菌锅 (上海申安医疗器械厂)，CF-16RN高速冷冻离心机 (株式会社日立制作所)，FE28-Stan台式pH计 [梅特勒仪器 (上海) 有限公司]，UV-5900型紫外分光光度计 (青岛一卓光电科技有限公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 羊栖菜多糖的提取工艺
1) 脱脂处理。取适量羊栖菜粉末于干净玻璃烧杯中，以1∶5 (g·mL−1) 的料液比加入石油醚，在20 W超声条件下，振荡脱脂30 min，4 500 r·min−1离心5 min，弃上清液，保留沉淀，沉淀物45 ℃干燥后得到羊栖菜脱脂粉末。
2) 水提法。参考季德胜[20] 的方法。羊栖菜粉末→脱脂→1 g粉末加50 mL去离子水浸泡→水浴提取 (100 ℃, 4 h)→高速离心 (15 min, 9 000 r·min−1)→取上清液旋蒸 (旋蒸至原体积的25%)→醇沉 (4 ℃, 12 h)→高速离心 (10 min, 4 500 r·min−1)→收集沉淀干燥 (自然风干)→得到羊栖菜多糖→4 ℃保存备用。
1.3.2 羊栖菜寡糖的制备
1) 脱蛋白处理。提取的羊栖菜多糖，经过 Sevage法脱蛋白，多糖溶液加入1/5体积的Sevage试剂 [V(氯仿)∶V(正丁醇)=1∶4]，振荡后离心吸取上清，重复操作直至无蛋白层出现。然后加入5倍体积的无水乙醇，冷藏过夜沉淀，8 000 r·min−1离心5 min收集沉淀。用水溶解通过3.5 kD透析袋流水透析24 h，真空冻干燥后得脱蛋白后羊栖菜多糖。
2) 酶解寡糖制备工艺。将脱蛋白后羊栖菜多糖加纯水溶解后置于水浴锅预热，在45 ℃中性条件下加入褐藻胶裂解酶反应，反应结束后沸水浴5 min灭酶，离心 (11 000 r·min−1，10 min) 取上清，加入4倍体积乙醇溶液后冰箱冷藏过夜，再离心 (11 000 r·min−1，10 min) 取上清，真空旋蒸至干得到羊栖菜寡糖。
1.3.3 羊栖菜寡糖含量的测定
1) 葡萄糖标准曲线制作。以0.2 mL为梯度往比色管中分别加入0~1.2 mL的1.0 mg·mL−1葡萄糖标准溶液，加入纯水至3 mL，再和1.5 mL DNS试剂混匀，100 ℃水浴10 min后冷却，纯水定容至25 mL。在540 nm波长下，以DNS-纯水做对照，制得葡萄糖标准曲线。
2) 糖含量、还原糖含量测定。参考Ruoyu D[21]、葛东振[22] 方法，采用DNS法检测。
3) 平均聚合度。平均聚合度=总糖的质量分数 (%)/还原糖质量分数 (%)[23]。
1.3.4 单因素试验
1) 酶解时间影响。取脱蛋白后羊栖菜多糖0.15 g，溶于10 mL纯水中，加入2 mL酶活20 U·mL−1的褐藻胶裂解酶，在45 ℃、中性条件下分别酶解12、24、36、48、60 h，反应后沸水浴5 min灭酶，比较不同酶解时间对还原糖含量和平均聚合度的影响。
2) 底物浓度的影响。用纯水和脱蛋白后羊栖菜多糖分别配置0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5% (w)的多糖溶液，溶于10 mL纯水中，加入2 mL酶活40 U·mL−1的褐藻胶裂解酶，在45 ℃、中性条件下酶解48 h，反应后沸水浴5 min灭酶，比较不同底物浓度对还原糖含量和平均聚合度的影响。
3) 加酶量的影响。取脱蛋白后羊栖菜多糖0.1 g，溶于10 mL纯水中，加入2 mL酶活为10、20、30、40、50 U·mL−1的褐藻胶裂解酶，在45 ℃、中性条件下分别酶解48 h，反应后沸水浴5 min灭酶，比较不同酶解时间对还原糖含量和平均聚合度的影响。
1.3.5 正交试验设计
在单因素实验的基础上进行正交试验，试验条件如表1，以还原糖含量为指标，确定最优酶解工艺，实验重复3次，取平均值。
表 1 正交试验因素水平编码表Table 1. Coding table of orthogonal experimental factor level水平
Level因素 Factor A：酶解时间
Enzymatic
hydrolysis
time/hB：底物质量分数
Substrate mass
concentration/
%C：加酶量
Enzyme
amount/
(U·mL−1)1 36 0.5 10 2 48 1.0 20 3 60 1.5 30 1.3.6 薄层层析法分析寡糖溶液
参考汪梓旭[24] 的方法，羊栖菜寡糖采用薄层层析法 (TLC) 检测。
1.3.7 抗氧化测定
1) DPPH自由基清除实验。参考梁美娜等[25] 的方法进行适当修改，将羊栖菜多糖和寡糖分别用蒸馏水稀释为0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL−1，L-抗坏血酸溶液作为阳性对照。取干净的玻璃试管，分别记为A0、A1、A2，其中A0加入2 mL 0.2 mmol·L−1 DPPH溶液和2 mL 70% (φ)乙醇，A1加入2 mL 0.2 mmol·L−1 DPPH溶液和2 mL羊栖菜多糖溶液，A2加入2 mL 70% (φ) 乙醇和2 mL羊栖菜多糖溶液。充分混合均匀后避光静置反应30 min，在517 nm处测定吸光度，DPPH自由基清除率的计算公式为：
$$清除率{\mathrm{=}}[{\mathrm{A}}0{\text{−}}({\mathrm{A}}1{\text{−}}{\mathrm{A}}2)]/{\mathrm{A}}0\times 100{\text{%}} 。 $$ 2) ABTS自由基清除试验。将过硫酸钾66.4 mg和ABTS 385 mg，分别配置成2.45 mmol·L−1的过硫酸钾溶液与7 mmol·L−1的ABTS溶液，按1∶1混合后置于阴影处12 h。最后用无水乙醇稀释，在波长734 nm处测定其吸光度，将其调为0.7±0.02，此时稀释完成的溶液为ABTS测试液。分别取羊栖菜多糖溶液和寡糖溶液各0.8 mL加于试管中，再各加入ABTS测试液3.2 mL，摇匀后避光反应6 min，使用蒸馏水作为空白对照，在734 nm处测定吸光值，重复测定3次，以L-抗坏血酸溶液做对照，ABTS自由基清除率的计算公式为：
$$ {清除率{\mathrm{=}}[A0{\text{−}}(A1{\text{−}}A2)]/A0\times 100{\text{%}} 。} $$ 式中：A0为0.8 mL蒸馏水与3.2 mL ABTS测试液混合后的吸光度；A1为0.8 mL羊栖菜多糖溶液或寡糖溶液与3.2 mL ABTS测试液混合后的吸光度；A2为0.8 mL羊栖菜多糖溶液或寡糖溶液与3.2 mL蒸馏水混合后的吸光度。
3) 羟自由基清除试验。采用羟自由基测定试剂盒进行检测。分别测定0.5~3 mg·mL−1的多糖溶液、0.5~3 mg·mL−1的寡糖溶液的清除能力，将L-抗坏血酸溶液作为对照。
4) 超氧阴离子清除试验。采用超氧阴离子自由基测定试剂盒进行检测。分别测定0.5~3 mg·mL−1的多糖溶液、0.5~3 mg·mL−1的寡糖溶液的清除能力，将L-抗坏血酸溶液作为对照。
5) 还原力测定。参考杨斯淇[26] 的方法，分别测定0.5~3.5 mg·mL−1的多糖和寡糖溶液的还原能力。
1.3.8 抑菌活性分析
参考褚晨亮[27] 的方法，采用滤纸片扩散法，分别测定 1、10、100 mg·mL−1的多糖和寡糖溶液的抑菌效果。
1.3.9 数据统计及分析
使用Origin 2024软件绘图，所得数据用SPSS 24.0软件进行显著性分析，大于2组以上则通过独立样本t检验分析组间差异，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01表示有极显著性差异。
2. 结果
2.1 葡萄糖标准曲线
葡萄糖标准曲线为y=0.489 29x−0.034 71，r²=0.998 74，在0.2~1.4 mg·mL−1间线性关系较好。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 酶解时间、底物质量分数、加酶量对羊栖菜多糖酶解效果的影响
图1-a显示，随着酶解时间增加，还原糖的浓度逐渐增大，在第48小时达最大值。在第12小时，还原糖的浓度最低，此时酶解时间短，酶的作用较低，仅发挥不到一半的作用。第48小时后还原糖浓度略有下降，因此时酶与底物已完全反应，延长酶解时间对多糖降解效果无显著性影响[28]。随着酶解时间增加，平均聚合度逐渐减小，36、48、60 h之间无显著性差异，趋于稳定。综合来看，第48小时还原糖浓度最高且平均聚合度较低，故选48 h为最适酶解时间。
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图 1 酶解时间、底物质量分数、加酶量对酶解效果的影响注：相同颜色方柱上的不同字母表示具有显著性差异 (p<0.05)。Figure 1. Effect of enzymatic hydrolysis time and substrate concentration and enzyme amount on enzymatic hydrolysisNote: Different letters on the bars of the same color represent significant differences (p<0.05).图1-b显示，底物质量分数为0.5%时，多糖的酶解效果与其他几组之间均存在极显著性差异 (p<0.01)，这是由于底物水平太低，酶只在极为有限的空间中发挥作用。底物浓度增加，还原糖生成量随之增加，当底物质量分数为1%时，反应趋向饱和。随着反应进行，底物质量分数逐渐降低，酶的活力逐渐下降[29]，还原糖浓度趋于稳定。而平均聚合度则相反，底物质量分数为 1.5%时，平均聚合度最低，当底物质量分数大于1.5%时，平均聚合度小幅上升，这与底物降解不完全有关。
图1-c显示，整体间存在显著性差异 (p<0.05)。当加酶量为10 U·mL−1时，其还原糖质量浓度和平均聚合度均与其他4组存在显著性差异 (p<0.05)，且还原糖质量浓度的差异更为明显。从图中可以看出，随着酶量的增加，反应速度加快，还原糖浓度上升，平均聚合度降低。当加酶量为20 U·mL−1时，还原糖质量浓度为26.51 mg·mL−1，平均聚合度趋于稳定。原因在于，酶量较少时，仅有部分底物参与反应；而酶量增加后，更多底物与酶接触并参与反应，促使羊栖菜细胞壁降解，使更多物质溶出，还原糖浓度快速增加。这与王闪闪等[30] 在研究山桐子 (Idesia polycarpa) 饼粕的多糖提取优化时得出的结论相似，即当酶量充足，底物完全被结合时，反应达到最大速度。
2.3 正交试验结果分析
由表2可知，影响还原糖浓度的主次因素为底物质量分数>加酶量>酶解时间，酶解制备羊栖菜寡糖的最佳组合为A2B3C2，即酶解时间为48 h，底物质量分数为1.5%，加酶量为20 U·mL−1。
表 2 正交试验结果Table 2. Results of orthogonal test试验号
Test No.因素 Factor 还原糖质量浓度
Reducing sugar/(mg·mL−1)A：酶解时间
Enzymatic hydrolysis time/hB：底物质量分数
Substrate mass fraction/%C：加酶量
Enzyme amount/(U·mL−1)1 1(36) 1(0.5) 1 (10) 4.55 2 1 2 (1.0) 2 (20) 22.36 3 1 3 (1.5) 3 (30) 24.11 4 2 (48) 1 3 11.92 5 2 2 1 17.34 6 2 3 2 26.53 7 3(60) 1 2 12.13 8 3 2 3 24.97 9 3 3 1 17.80 K1 51.02 28.60 39.69 K2 55.79 64.67 61.02 K3 54.90 68.44 61.00 k1 17.007 9.533 13.23 k2 18.597 21.557 20.34 k3 18.30 22.813 20.333 R 1.59 13.28 7.103 主次顺序
Order of importanceB>C>A 最优组合
Optimal combinationA2B3C2 2.4 薄层层析法分析寡糖溶液
TLC操作简单，可用于样品的快速分离。采用TLC分析羊栖菜寡糖溶液，结果如图2所示。测试品中主要含有单糖、二糖、三糖和四糖。其中四糖的斑点颜色很浅，说明其含量很少；单糖、二糖和三糖斑点相对明显，含量较高。
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图 2 羊栖菜寡糖的薄层层析图 (左为羊栖菜寡糖，右为褐藻寡糖标准品)Figure 2. TLC diagram of S. fusiforme oligosaccharide (Left is S. fusiforme oligosaccharide and right is brown algae oligosaccharide)2.5 抗氧化性测定结果分析
2.5.1 DPPH自由基清除能力
DPPH溶液能在醇溶液中稳定存在并显示为紫色，其在517 nm波长下的吸光值最大。当有其他物质与DPPH· 单电子进行配对时，溶液的颜色变浅，其在517 nm处的吸收值也会下降，下降程度与其抗氧化效果呈正相关。
由表3可知，羊栖菜多糖对DPPH自由基清除率的IC50为0.435 mmol·L−1，而寡糖仅为0.102 mmol·L−1，说明寡糖对DPPH自由基的清除能力远强于多糖。
表 3 自由基清除率Table 3. Free radical scavenging ratemmol·L−1 样品
Sample自由基清除率 IC50 DPPH
自由基
DPPH free
radicalABTS
自由基
ABTS free
radical羟基
自由基
Hydroxyl
radical超氧阴离子
自由基
Super anion
radical多糖
Polysaccharide0.435 0.646 0.121 0.788 L-抗坏血酸
L-ascorbic acid\ \ 0.005 0.003 寡糖
Oligosaccharide0.102 0.085 0.013 0.170 由图3-a所示，羊栖菜多糖和寡糖对DPPH的清除率随着质量浓度的增加而增强，且寡糖的清除能力高于多糖 (p<0.05)。当质量浓度为3.0 mg·mL−1时，羊栖菜寡糖对DPPH自由基清除率达63.1%，而羊栖菜多糖只有46.2%。羊栖菜多糖和寡糖的DPPH自由基清除能力虽低于L-抗坏血酸阳性对照组，但仍具有较好的清除活性，且寡糖清除能力更强。
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图 3 羊栖菜多糖、L-抗坏血酸、羊栖菜寡糖对DPPH、ABTS、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除率(p<0.05)Figure 3. Scavenging rate of DPPH, ABTS free radical, hydroxyl radical, superoxide anion radical by S. fusiforme polysaccharide, oligosaccharide and L-ascorbic acid (p<0.05)2.5.2 ABTS自由基清除能力
由表3可知，羊栖菜多糖对ABTS自由基清除率的IC50为0.646 mmol·L−1，而寡糖仅为0.085 mmol·L−1，说明羊栖菜寡糖具有更强的ABTS清除能力。
如图3-b所示，羊栖菜多糖和寡糖对ABTS自由基的清除率均与其浓度呈正相关，且随着浓度的增加，寡糖的清除能力提升更为显著。当质量浓度为3.0 mg·mL−1时，羊栖菜多糖对ABTS自由基的清除率仅为36.5%，但羊栖菜寡糖的清除率高达80.7%。虽然羊栖菜多糖和寡糖的清除能力都低于L-抗坏血酸 (阳性对照组)，但它们仍表现出较好的ABTS自由基清除活性，尤其是寡糖，在3 mg·mL−1时，其清除率与L-抗坏血酸的清除率仅相差约10%。
2.5.3 羟自由基清除能力
表3显示，L-抗坏血酸的羟自由基IC50值低于羊栖菜寡糖，而羊栖菜寡糖又低于羊栖菜多糖，这表明L-抗坏血酸和羊栖菜寡糖对羟自由基的清除能力均强于羊栖菜多糖，且L-抗坏血酸与羊栖菜多糖的IC50值仅相差0.008 mmol·L−1。
如图3-c所示，当质量浓度为0.5 mg·mL−1时，L-抗坏血酸对羟自由基的清除率为80.5%，而羊栖菜多糖和寡糖的清除率分别为19.2%和20.54%。随着质量浓度的增加，羊栖菜多糖和寡糖对羟自由基的清除率均不断提升。当质量浓度达到3.0 mg·mL−1时，羊栖菜多糖的清除率提升至67.6%，羊栖菜寡糖的清除率则增至71.3%，超过了羊栖菜多糖。尽管羊栖菜多糖和寡糖的清除效果不及L-抗坏血酸，但它们对羟自由基仍具有较好的清除效果。
2.5.4 超氧阴离子自由基清除能力
由表3可知，3种样品对超氧阴离子自由基的抑制能力存在显著差异。其中，L-抗坏血酸的IC50值最低 (0.003 mmol·L−1)，其次为羊栖菜寡糖 (0.170 mmol·L−1)，羊栖菜多糖的最高 (0.788 mmol·L−1)。表明羊栖菜寡糖和L-抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除能力显著强于羊栖菜多糖。
由图3-d所示，当质量浓度为3.0 mg·mL−1时，羊栖菜多糖对超氧阴离子的清除率达41.9%，而羊栖菜寡糖的清除率更高，达到57.2%。进一步分析发现，羊栖菜多糖和寡糖的超氧阴离子清除率随着质量浓度的增加而增强，寡糖的清除能力显著高于多糖 (p<0.05)，且在质量浓度0.5~2.0 mg·mL−1区间内，寡糖对超氧阴离子的清除能力增强趋势更加明显。结果表明，与L-抗坏血酸阳性对照组相比，羊栖菜多糖和寡糖的清除能力仍较低，但它们仍表现出较好的超氧阴离子自由基清除活性。
2.5.5 还原力
还原力是衡量抗氧化能力的重要指标。还原力越强，清除自由基的能力越强，抗氧化活性也越强。如图4所示，羊栖菜多糖和寡糖的还原力均随浓度的增加而显著增强。当质量浓度为3.5 mg·mL−1时，羊栖菜寡糖的还原力 (以700 nm处的吸光值表示) 为0.923，显著高于羊栖菜多糖的还原力 (0.344) (p<0.05)。这一结果表明，羊栖菜寡糖具有较强的还原能力，并且这种能力对浓度具有明显的依赖性。
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图 4 羊栖菜多糖、寡糖的还原力 (p<0.01)Figure 4. Reducing power of S. fusiforme polysaccharide and oligosaccharide (p<0.01)2.6 抑菌性分析
由图5可知，不同浓度的多糖溶液对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌 (Escherichia coli)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 均无抑制作用。而羊栖菜寡糖在质量浓度在10和100 mg·mL−1时，对上述3种细菌和白色念珠菌 (Candida albicans) 都有显著的抑制效果。但当羊栖菜寡糖在质量浓度降低至1 mg·mL−1时，其仅对白色念珠菌表现出较强的抑制作用。在图5-b中可以明显观察到，10和100 mg·mL−1的羊栖菜多糖溶液对白色念珠菌具有较好的抑制效果，而羊栖菜寡糖溶液仅在1 mg·mL−1时就能对白色念珠菌产生抑制作用。综合来看，羊栖菜寡糖的抑菌种类更为广泛，且在抑制相同菌种 (白色念珠菌) 时，羊栖菜寡糖所需的质量浓度明显低于多糖。
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图 5 羊栖菜寡糖和羊栖菜多糖的抑菌效果注：a、b、c、d分别为铜绿假单胞菌、白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌；1、2、3号点分别为100、10、1 mg·mL−1的羊栖菜寡糖溶液；4、5、6号点分别为100、10、1 mg·mL−1的羊栖菜多糖溶液；中心点为1 mg·mL−1青霉素-链霉素溶液。Figure 5. Antibacterial effect of S. fusiforme oligosaccharide and polysaccharideNote: a. Pseudomonas aeruginosa; b. Candida albicans; c. Escherichia coli; d. Staphylococcus aureus; S. fusiforme oligosaccharide solution of 100 mg·mL−1 at Point 1, 10 mg·mL−1 at Point 2, 1 mg·mL−1 at Point 3; S. fusiforme polysaccharide solution of 100 mg·mL−1 at Point 4, 10 mg·mL−1 at Point 5, 1 mg·mL−1 at Point 6; 1 mg·mL−1 of penicillin-streptomycin solution at center point.3. 讨论
3.1 羊栖菜多糖的酶解效果
研究显示，羊栖菜多糖的提取方式对其结构、分子量、生理活性等均会产生一定影响[31]。水提法因其操作简便、对多糖的负面影响小且安全环保[32]，被本研究选为羊栖菜多糖的提取方法。在羊栖菜寡糖的制备中，通常有化学法、物理法和酶法3种方法。其中，酶法因具有高特异性、高效率以及条件温和等优点[33]，被广泛采用。本研究利用褐藻裂解酶对多糖进行酶解以制备寡糖。
所有的多糖均无还原性，因此在酶解后，溶液中还原糖的含量可作为衡量羊栖菜多糖酶解程度的指标。聚合度是衡量聚合物分子大小的指标，每种聚合物均由不同聚合度的同系聚合物分子组成，其聚合度为该聚合物的平均值。多糖在酶解过程中，聚合物分子会变小，聚合度降低，从而可反应酶解程度。本实验结果表明，酶解时间、底物质量分数和加酶量对酶解过程的影响趋势相似：即随着酶解的进行，还原糖含量呈上升趋势，而平均聚合度则呈下降趋势，这符合多糖向寡糖转变的物理变化规律。当还原糖含量和平均聚合度均不再显著变化时，其酶解过程达到完全状态，此时得到的寡糖具有较高的还原糖含量和较低的平均聚合度，可用于后续的抗氧化和抑菌活性研究。
3.2 羊栖菜寡糖的抗氧化活性
海洋寡糖的诸多生理活性已被大量研究证实。邓雄等[34] 研究发现，褐藻寡糖可显著提升低初生重断奶仔猪(Sus scrofa) 血清中过氧化氢酶的活性，从而增强其抗氧化能力。马斌等[35] 对花鲈 (Lateolabrax japonicus) 幼鱼生长过程中的生理生化指标进行观察，结果显示褐藻寡糖能促进其机体生长发育。史文军等[36] 在饲料中添加褐藻寡糖，发现脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 的免疫能力明显提升。尽管目前关于海洋多糖和寡糖生理活性的研究众多，但二者在抗氧化活性方面的对比研究却较为少见。
本研究以羊栖菜提取的多糖及其酶解后的寡糖为研究对象，对比了二者对DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力以及还原能力，并以L-抗坏血酸作为阳性对照。结果表明，羊栖菜寡糖的抗氧化能力显著优于其多糖。这主要是因为多糖在酶解过程中产生了大量游离的活性羟基，这些羟基能够与自由基结合，从而增强抗氧化活性。自由基的存在会对细胞成分造成损伤，加速细胞衰老，导致胶原蛋白变性，进而对人体产生不利影响。本研究结果表明，羊栖菜多糖酶解后的寡糖具有良好的抗氧化性能，为羊栖菜寡糖在抗氧化领域的开发应用提供了理论依据。
3.3 羊栖菜寡糖的抑菌活性
铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠埃希菌均为常见的致病菌。本研究采用滤纸扩散法，观察不同浓度梯度的羊栖菜多糖和寡糖溶液对这些细菌的抑制效果。滤纸扩散法具有操作简便、结果直观清晰等优点，通过观察抑菌圈的大小来评估抑制效果，抑菌圈越大，表明抑制效果越好。
目前，众多研究致力于探索具有抑菌活性的天然产物。乔艳艳等[37] 研究发现，从蓝莓 (Vaccinium uliginosum) 中提取的多糖对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌具有显著的抑制效果。王转莉等[38] 通过分光光度计法研究了蒲公英多糖的抑菌活性，证实其对大肠杆菌具有一定的抑制作用。马巧丽等[39] 发现雪莲多糖对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌 (Bacillus subtilis) 均具有良好的抑菌效果，其中对大肠埃希菌的抑制作用最强，对枯草杆菌次之。尽管已有大量研究证实天然多糖的抑菌活性，但在寡糖的抑菌活性方面的研究仍不够全面，对寡糖抑菌机制的理解也较为有限。
本研究对羊栖菜多糖酶解后的寡糖进行了抑菌活性研究。结果显示，羊栖菜寡糖对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，且抑菌效果与寡糖浓度呈正相关。相比之下，羊栖菜多糖对这2种细菌均无抑制作用，这可能是由于多糖分子较大，难以进入细菌内部发挥作用。此外，羊栖菜寡糖对铜绿假单胞菌的抑制作用较弱，仅在较高浓度下才表现出明显的抑制效果，其实用性相对有限。总体而言，羊栖菜寡糖的抑菌范围比多糖更广，且抑菌效果良好，与本研究的目标一致。
4. 结论
本研究以羊栖菜为原料，采用水提法提取羊栖菜多糖，并利用褐藻胶裂解酶对其进行酶解，制备羊栖菜寡糖。通过实验优化，确定了最佳的酶解工艺条件为：酶解时间48 h、底物质量分数1.5%、加酶量20 U·mL−1。在抗氧化性能方面，以L-抗坏血酸作为阳性对照，对比发现羊栖菜寡糖的抗氧化能力显著优于多糖。此外，抑菌实验结果表明，羊栖菜寡糖可抑制的细菌种类比多糖更广泛，且抑菌效果更强。
尽管目前市场上已有较多羊栖菜多糖相关产品，但羊栖菜寡糖的应用仍相对较少。因此，羊栖菜寡糖在应用领域具有较大的开发潜力。未来应进一步加强对羊栖菜寡糖的研究与开发，以拓展其应用范围，开发出更具价值的产品。
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图 1 酶解时间、底物质量分数、加酶量对酶解效果的影响
注：相同颜色方柱上的不同字母表示具有显著性差异 (p<0.05)。
Figure 1. Effect of enzymatic hydrolysis time and substrate concentration and enzyme amount on enzymatic hydrolysis
Note: Different letters on the bars of the same color represent significant differences (p<0.05).
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图 2 羊栖菜寡糖的薄层层析图 (左为羊栖菜寡糖，右为褐藻寡糖标准品)
Figure 2. TLC diagram of S. fusiforme oligosaccharide (Left is S. fusiforme oligosaccharide and right is brown algae oligosaccharide)
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图 3 羊栖菜多糖、L-抗坏血酸、羊栖菜寡糖对DPPH、ABTS、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除率(p<0.05)
Figure 3. Scavenging rate of DPPH, ABTS free radical, hydroxyl radical, superoxide anion radical by S. fusiforme polysaccharide, oligosaccharide and L-ascorbic acid (p<0.05)
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图 4 羊栖菜多糖、寡糖的还原力 (p<0.01)
Figure 4. Reducing power of S. fusiforme polysaccharide and oligosaccharide (p<0.01)
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图 5 羊栖菜寡糖和羊栖菜多糖的抑菌效果
注：a、b、c、d分别为铜绿假单胞菌、白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌；1、2、3号点分别为100、10、1 mg·mL−1的羊栖菜寡糖溶液；4、5、6号点分别为100、10、1 mg·mL−1的羊栖菜多糖溶液；中心点为1 mg·mL−1青霉素-链霉素溶液。
Figure 5. Antibacterial effect of S. fusiforme oligosaccharide and polysaccharide
Note: a. Pseudomonas aeruginosa; b. Candida albicans; c. Escherichia coli; d. Staphylococcus aureus; S. fusiforme oligosaccharide solution of 100 mg·mL−1 at Point 1, 10 mg·mL−1 at Point 2, 1 mg·mL−1 at Point 3; S. fusiforme polysaccharide solution of 100 mg·mL−1 at Point 4, 10 mg·mL−1 at Point 5, 1 mg·mL−1 at Point 6; 1 mg·mL−1 of penicillin-streptomycin solution at center point.
表 1 正交试验因素水平编码表
Table 1 Coding table of orthogonal experimental factor level
水平
Level因素 Factor A：酶解时间
Enzymatic
hydrolysis
time/hB：底物质量分数
Substrate mass
concentration/
%C：加酶量
Enzyme
amount/
(U·mL−1)1 36 0.5 10 2 48 1.0 20 3 60 1.5 30 
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表 2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal test
试验号
Test No.因素 Factor 还原糖质量浓度
Reducing sugar/(mg·mL−1)A：酶解时间
Enzymatic hydrolysis time/hB：底物质量分数
Substrate mass fraction/%C：加酶量
Enzyme amount/(U·mL−1)1 1(36) 1(0.5) 1 (10) 4.55 2 1 2 (1.0) 2 (20) 22.36 3 1 3 (1.5) 3 (30) 24.11 4 2 (48) 1 3 11.92 5 2 2 1 17.34 6 2 3 2 26.53 7 3(60) 1 2 12.13 8 3 2 3 24.97 9 3 3 1 17.80 K1 51.02 28.60 39.69 K2 55.79 64.67 61.02 K3 54.90 68.44 61.00 k1 17.007 9.533 13.23 k2 18.597 21.557 20.34 k3 18.30 22.813 20.333 R 1.59 13.28 7.103 主次顺序
Order of importanceB>C>A 最优组合
Optimal combinationA2B3C2
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表 3 自由基清除率
Table 3 Free radical scavenging rate
mmol·L−1 样品
Sample自由基清除率 IC50 DPPH
自由基
DPPH free
radicalABTS
自由基
ABTS free
radical羟基
自由基
Hydroxyl
radical超氧阴离子
自由基
Super anion
radical多糖
Polysaccharide0.435 0.646 0.121 0.788 L-抗坏血酸
L-ascorbic acid\ \ 0.005 0.003 寡糖
Oligosaccharide0.102 0.085 0.013 0.170
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