芮氏刻肋海胆 (Temnopleurus reevesii) 隶属于海胆纲、拱齿目、刻肋海胆科、刻肋海胆属，自然分布于印度-西太平洋沿岸各地。芮氏刻肋海胆壳体呈低半球形，其厚度较薄且易碎，直径一般为3 cm左右，最大可达4.5 cm^[1-2]。

海胆性腺营养丰富，含有多种不饱和脂肪酸，特别是高度不饱和脂肪酸 (Highly unsaturated fatty acid, HUFA)，这些成分对人体健康具有潜在益处^[3]。芮氏刻肋海胆性腺饱满，味道鲜甜，具有一定的食用价值；且其外形美观并对水族缸滋生的藻类有较好的清除效果，已经作为观赏物种出现在水族市场^[4]。近年来，该海胆所面临的采捕压力及可能引发的环境问题已经引起了相关学者的关注^[5]。

芮氏刻肋海胆幼体透明、生长较快，可以作为模式生物用于发育生物学、遗传进化学以及组织胚胎学等领域的研究^[6-10]。前期研究发现，该海胆对底栖藻类具有很好的清除效果，因此对其进行增殖放流可以有效地调控海底环境。然而，目前鲜有对该海胆进行人工繁育和增养殖的报道。本研究系统观察了芮氏刻肋海胆的人工繁育过程，对其胚胎发育及生活史进行了详实记录，以为芮氏刻肋海胆等热带海胆的人工繁育及增养殖提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   海胆亲体采捕及暂养

芮氏刻肋海胆亲本于2022年3月下旬采捕自广东省深圳市大亚湾海域 (114°33'E, 22°33'N)，捕获后用新鲜海水暂养，立即运至中国科学院大亚湾海洋生物综合实验站，暂养于500 L玻璃钢桶内，密度约为每桶80只。实验所用海水经砂滤和5 μm微孔过滤袋过滤后使用。亲胆暂养期间水温为26~27 ℃，盐度为30‰~31‰，pH为7.9~8.1，水表面光照强度<1 000 lx。养殖水体每日更换1次，换水量约为3/4，换水时控制流速以减少对亲胆的刺激。暂养期间水体保持24 h持续充气，并投喂少量马尾藻。

本研究所涉及的动物实验获得了华南农业大学实验动物伦理委员会批准 (编号：2021G023)。在实验过程中，操作人员严格遵守《广东实验动物管理条例》的伦理规范，并根据华南农业大学动物福利委员会制定的规章制度执行。

1.2   催产及孵化

挑选10只外形完整活力良好的亲胆，用5 mL医用注射器从围口腔部注射0.5 mol·L⁻¹氯化钾 (KCl) 溶液2~3 mL进行催产。注射后立即将海胆倒置，放置于盛有适量海水的50 mL烧杯上，使海胆口器向上，而肛门充分浸泡于海水中，等待配子排放。配子排放结束后 (约10 min)，将精卵收集于5 L塑料杯中，加入新鲜海水，用玻璃棒搅拌，静置，去除上清液，此过程重复3次以去除多余精子；之后将受精卵转移至含清洁海水的育苗池中进行培育，密度约为1 只·mL⁻¹，持续充气使受精卵悬浮。精卵混合后持续取样，使用显微镜 (日本尼康Eclipse E200) 观察胚胎发育情况，并进行拍照记录。每次测量的受精卵及胚胎数量不少于15只。

1.3   浮游幼体培育

当幼体发育到二腕幼体能够开口摄食时开始投喂，以腕足数量为准，确定发育阶段并制定换水和投饵规则。其中，换水量为：受精卵至二腕幼体阶段，每日换水1/3；四腕幼体阶段，每日换水1/2；八腕幼体阶段，每日换水量增至2/3。每日投饵2次，每次投饵量为：二腕幼体期间每1000 L水体投入2.5 L牟氏角毛藻 (Chaetoceros muelleri)，四腕幼体期间每1000 L水体投入5 L牟氏角毛藻，八腕幼体期间每1000 L水体投入10 L牟氏角毛藻；间隔12 h，换水后投饵。换水时根据幼体的发育情况选用合适规格的筛绢网进行过滤，以避免幼体逸出为准；每隔3 d利用虹吸法吸底，以除去池底死亡幼体、残饵以及粪便。浮游幼体培育期间水温为 (24.78±1.12) ℃，盐度为 (30.91±0.35)‰，pH为8.10±0.04。

浮游幼体培育期间，持续取样并利用显微镜观察其发育特征，测量并记录各时期幼体的体长数据。每次测量的幼体数量不少于15只。各期幼体发育时间以随机样本中出现50%以上该阶段个体为准。

1.4   稚胆培育

八腕幼体变态阶段，管足开始伸出，幼体由浮游态转变为附着态，食性由浮游藻类转为底栖硅藻。本研究利用水产养殖中常用的PVC波纹板作为附着基^[11-12]。波纹板 (31 cm×39 cm，20片为单位组装成一个整体) 提前2周消毒并接种底栖硅藻 [主要为舟形藻 (Nitzschia sp.) 和菱形藻 (Navicula sp.)]，将10组波纹板垂直放置在1 000 L的育苗池中以供幼体附着。

稚胆培育时期，水体温度为 (27.41±2.20) ℃，盐度为 (32.00±0.49)‰，pH为8.11±0.09，每日换水1次，每次换水量为1/2，水体保持适当光照，以促进底栖硅藻的生长。随着稚胆的生长，投喂海带和石莼等大型海藻以补充饵料的不足。

1.5   数据处理

实验数据以“平均值±标准差 ($ \overline { x}\pm { {s}} $)”表示。采用GraphPad Prism 9.0软件作图。测量标准见图1，以TL (Total length) 表示早期胚胎及幼体长度。

图  1  各发育时期芮氏刻肋海胆长度的测量方法

注：a. 胚胎；b. 幼体。

Figure  1.  Total length measurement of T. reevesii at different developmental stages

Note: a. Embryo; b. Larva.

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2.   结果

2.1   催产及受精效果

注射0.5 mol·L⁻¹ KCl溶液可有效催产芮氏刻肋海胆。实验中10只亲胆均成功排放配子，其中4只排精，6只产卵。催产时海胆管足和棘刺均会产生无规律摆动，肉眼观察下精液呈长条状乳白色，进入水体后，很快弥散为雾态，卵子则呈淡黄色卵圆形，易沉入水体底部。在显微镜下观察，健康成熟的精子具卵圆形的头部和细长的尾部，头部宽约 (4.68±0.39) μm (图2-a)。正常卵子具极体，外形饱满，色泽均匀，直径为 (89.85±2.47) μm (图2-b)，同时也观察到极少的不规则卵 (图2-c)。受精时，卵子周围可被数个精子包围，受精卵具有明显的受精膜，直径增至 (120.30±3.98) μm (图2-d)。在5个视野下共统计了200余枚卵子，受精率介于87.4%~95.7%，平均为 (91.6±2.4)%。

图  2  芮氏刻肋海胆生殖细胞及受精卵

注：a. 精子；b. 卵母细胞；c. 不规则的卵母细胞；d. 受精卵。

Figure  2.  Germ cells and oosperm of T. reevesii

Note: a. Sperm; b. Oocyte; c. Irregular oocyte; d. Fertilized egg.

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2.2   早期胚胎及幼体发育过程

卵裂：受精后约45 min正式进入卵裂期 (表1)。卵裂方式为辐射型，其特征是卵细胞从中部开始凹陷，分裂成2个大小相近的细胞 (图3-a)，第1次卵裂后约15 min开始第2次卵裂 (表1)，受精卵进一步分裂为4个大小相近的子细胞 (图3-b)。此后，胚胎每30 min左右进行1次分裂 (表1)，历经8细胞期 (图3-c)、16细胞期 (图3-d)、32细胞期 (图3-e) 乃至桑葚胚期 (图3-f) 等。卵裂期间，胚胎直径随时间逐步增长。

表  1  芮氏刻肋海胆发育时期表

Table  1.  Embryonic and larval development process of T. reevesii

发育时期 Ontogenetic stage	时间 Time	全长 TL/μm
受精卵 Oosperm	0 min	120.30±3.98
2 细胞期2-cell stage	45 min	118.21±4.50
4细胞期 4-cell stage	1 h	125.80±4.18
8 细胞期8-cell stage	1 h 30 min	126.91±4.05
16 细胞期16-cell stage	2 h	140.73±0.54
32 细胞期32-cell stage	2 h 20 min	160.74±1.77
桑葚胚期Morula	3 h 45 min	163.04±2.50
囊胚期Blastula	6 h	180.02±3.74
原肠期Gastrula	12 h	163.46±2.27
二腕幼体2-arm pluteus	22 h	312.24±1.52
四腕幼体4-arm pluteus	1 d 12 h	480.41±21.92
六腕幼体6-arm pluteus	5 d 16 h	660.28±39.43
八腕幼体8-arm pluteus	9 d	648.98±24.49
	13 d	804.61±24.66
	22 d	941.17±34.97
稚胆Juvenile	32 d	-

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图  3  芮氏刻肋海胆胚胎及幼体发育过程

注：a. 2细胞期；b. 4细胞期；c. 8细胞期；d. 16细胞期；e. 32细胞期；f. 桑葚胚期；g. 囊胚期；h. 原肠期；i. 二腕幼体；j. 四腕幼体；k. 六腕幼体；l—n. 八腕幼体。

Figure  3.  Embryonic and larval development of T. reevesii

Note: a. 2-cell stage; b. 4-cell stage; c. 8-cell stage;, d. 16-cell stage; e. 32-cell stage; f. Morula; g. Blastula; h. Gastrula; i. Two-armed larva; j. Four-armed larva; k. Six-armed larva; l–n. Eight-armed larva.

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囊胚期：受精后约6 h正式进入囊胚期 (表1)。囊胚期胚胎是由少数几层细胞围成的中空球体 (图3-g)，胚胎直径增至 (180.02±3.74) μm，期间胚胎开始自主旋转。

原肠期：受精后约12 h正式进入原肠期 (表1)。原肠作用开始时，囊胚的植物极出现1个扁平的平面，随后植物极的中胚层细胞逐渐脱离为单个细胞并转移到囊胚腔中，在植物极周围聚集形成2个细胞团；在原代间充质细胞进入之前，胚胎在植物极中发育出1个圆形细胞区域。之后，内胚层细胞整体内陷并延伸形成原肠腔 (图3-h)。原肠期胚胎直径为 (163.46±2.27) μm，相比此前有小幅下降。

二腕幼体：受精后约22 h发育至二腕幼体时期 (表1，图3-i)。二腕幼体的形态近似三角锥形，顶部较平顺光滑。此时可见幼体的肠和胃，肠道呈细小管状结构，并在顶部开口处形成肛门。两侧有腕足，腕足并无运动能力，幼体依靠口上方处纤毛簇环的连续摆动摄取食物；同时可以观察到食管的缓慢蠕动以及胃部的节律性收缩。体表出现“斑点”，体长增至 (312.2±1.52) μm。

四腕幼体：受精后约36 h发育至四腕幼体时期 (表1，图3-j)。相较于二腕幼体，四腕幼体的口叶明显凸起，顶端又生出2个前侧腕，幼体前部原有的2个口后腕明显变长，腕与腕的连接处呈圆弧形，反口端的“锥顶”进一步圆润，胃部显著膨大，摄食量也有所增加，胃内可见未消化的饵料，体长增至 (480.41±21.92) μm。

六腕幼体：在受精后约5 d 16 h发育至六腕幼体时期 (表1，图3-k)。相较于四腕幼体，六腕幼体前侧腕和口后腕间的口端面周缘生出2个后背腕，独立的腕部有“薄膜”覆盖，连接带类似于鸭蹼。胃进一步膨大，呈卵圆形。口端面开始隆起，体壁变厚，体表“斑点”颜色加深，体长增至 (660.28±39.43) μm。

八腕幼体：在受精后约9 d发育至八腕幼体时期 (表1，图3-l)，体长为 (648.98±24.49) μm。相较于六腕幼体，八腕幼体前侧腕的内侧新生出1对口前腕。原六腕幼体半球形的反口端顶部凹陷，此处体壁内侧与胃紧密粘连，同时反口端两侧突起2个角状凸起，并随发育进程不断增大。幼体外部有纤毛做快速旋转摆动，腕内部有骨针作为支撑，其主腕足末端点状色素沉积明显，腕与腕的连接处也出现深色的色素沉积，呈环带式分布，其上密布纤毛。受精后第13天，八腕幼体肛门明显凸起 (表1，图3-m)，体长增至 (804.61±24.66) μm，胃的一侧出现前庭复合体并不断增大。受精后第22天，八腕幼体后背腕与前侧腕进一步加粗 (图3-n)，腕足末端点面积增大，颜色加深，体长达到 (941.16±34.97) μm，幼体体宽增加至几乎与体长相等，透过透明体壁可见其内初生管足，并有无规律轻微蠕动，这表明幼体已具备变态发育为稚胆的能力。

2.3   稚胆发育

受精后约32 d，八腕幼体末期幼虫前庭复合体显著发育，其内部的初生触手和初生棘都伸出体壁之外，使复合体内部的口与外界环境相通，幼体结束浮游状态，进而变态成为稚胆，开始营附着生活，其原有的腕及体壁自行分解消融。观察发现，稚胆以管足和棘刺在附着基上爬行，管足可自由伸展，随后管足数目开始增多，棘刺也开始增多并布满外壳。与一般海胆种类的稚胆颜色为黑色不同，芮氏刻肋海胆稚胆颜色与成体相似，其壳体发白，棘刺呈淡白色 (图4)。受精后52 d (附着后20 d)，稚胆壳径可达4~7 mm。

图  4  芮氏刻肋海胆的稚胆

Figure  4.  Juveniles of T. reevesii

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3.   讨论

3.1   芮氏刻肋海胆的繁殖特点

本研究的芮氏刻肋海胆亲本来自广东深圳大亚湾海域，3月下旬即可采捕并进行催产。研究表明，海胆的配子排放受水流、温度、盐度、pH等外部因素的影响^[13-15]。该海胆在水温20 ℃以上时全年均可进行催产^[16]，本研究采捕时海区水温已达24 ℃以上，因此表现出较高的催产率。芮氏刻肋海胆在排卵时极体已经流出，这与哈氏刻肋海胆 (T. hardwickii) 和高腰海胆 (Mespilia globulus) 等种类相似^[17-18]。此外，催产时发现反口面一端浸没在水体中的管足会充分伸展，并进行规律性摆动，而棘刺则呈无规则摆动，该行为或许可以促进聚集在生殖孔附近的配子弥散，增加受精率。

3.2   芮氏刻肋海胆胚胎及浮游幼体发育特征

相关研究表明 (表2)，不同种类海胆的卵裂期开始时间存在较大差异，并可能与水温存在一定的关系，如在24 ℃水温条件下，白棘三列海胆 (Teipneustes gratilla) 进入卵裂期的时间为30 min ^[19]， 23~24 ℃水温条件下哈氏刻肋海胆进入卵裂期的时间为50 min^[17]。本研究中，在水温为24~25 ℃条件下芮氏刻肋海胆仅45 min即进入卵裂期，其发育速度与上述几种海胆类似，但快于25~26 ℃水温条件下的高腰海胆 (1 h)^[18]、(29.7±0.48) ℃水温条件下的紫海胆 (Heliocidanris crassispina) (1 h 30 min) ^[20]和17~21 ℃水温条件下的马粪海胆 (Hemicentfotus pulcherrimus) (1 h 30 min)^[21]。

表  2  芮氏刻肋海胆胚胎及幼体发育过程与其他种类海胆的比较

Table  2.  Comparison of embryonic and larval development of T. reevesii with other sea urchin species

物种 Species	水温 Water temperature/℃	囊胚 Blastule stage	原肠胚 Gastrula	棱柱幼体 Prism	二腕幼体 2-armed pluteus
芮氏刻肋海胆 Temnopleurus reevesii	24~25	6 h	12 h	18 h	22 h
高腰海胆[18] Mespilia globulus	25~26	8 h	15 h	23 h	1 d 14 h
光棘球海胆[22] Mesocentrotus nudus	20~24	5~6 h	17~20 h	1 d	1 d 6 h~1 d 16 h
白棘三列海胆[19] Teipneustes gratilla	24	14 h	24 h	1 d 12 h	1 d 19 h
中间球海胆[23] Strongylocentrotus intermedius	16~18.5			1 d 6 h	1d 12 h
紫海胆[20] Heliocidanris crassispina	29.7±0.48	4 h	10 h	15 h	17 h
马粪海胆[21] Hemicentfotus pulcherrimus	17~21	12 h	18 h	1 d 6 h	1 d 12 h
哈氏刻肋海胆[17] Temnopleurus hardwickii	23~24	5 h	10 h	18 h	23 h
物种 Species	水温 Water temperature/℃	四腕幼体 4-armed pluteus	六腕幼体 6-armed pluteus	八腕幼体 8-armed pluteus	稚胆 Juvenile
芮氏刻肋海胆 Temnopleurus reevesii	24~25	1 d 12 h	5 d1 6 h	9 d	32 d
高腰海胆[18] Mespilia globulus	25~26	2 d 10 h	7 d 13 h	9 d 18 h	11 d
光棘球海胆[22] Mesocentrotus nudus	20~24	2~5 d	5~6 d	7~13 d	30 d
白棘三列海胆[19] Teipneustes gratilla	24	3 d		11 d 6 h
中间球海胆[23] Strongylocentrotus intermedius	16~18.5	2 d 2 h		12~13 d	18~21 d
紫海胆[20] Heliocidanris crassispina	29.7±0.48	1 d 7 h	5 d	8 d	22 d
马粪海胆[21] Hemicentfotus pulcherrimus	17~21	2 d 2 h	7~8 d	12~13 d	18~21 d
哈氏刻肋海胆[17] Temnopleurus hardwickii	23~24	1 d 16 h	7 d 2 h	10 d 16 h	35 d
注：以50%个体出现该发育阶段的特征为标准。 Note: The developmental stage is determined by the developmental characteristics of 50% individuals.

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芮氏刻肋海胆受精后的6 h、12 h分别进入囊胚期、原肠期，其发育速度稍快于光棘球海胆 (Mesocentrotus nudus) (5~6 h、17~20 h)^[22]、高腰海胆 (8 h、15 h)^[18]、马粪海胆 (12 h、18 h) ^[21]和白棘三列海胆 (14 h、24 h)^[19]；但慢于紫海胆 (4 h、10 h) ^[20]和哈氏刻肋海胆 (5 h、10 h)^[17]。

芮氏刻肋海胆进入二腕幼体阶段 (22 h) 的速度快于哈氏刻肋海胆 (23 h)^[17]、中间球海胆 (Strongylocentrotus intermedius) (1 d 6 h)^[23]、光棘球海胆 (1 d 6 h~1 d 16 h)^[22]、马粪海胆 (1 d 12 h)^[21]、高腰海胆 (1 d 14 h)^[18]和白棘三列海胆 (1 d 19 h)^[19]，但慢于紫海胆 (17 h)^[20]。在幼体发育期，芮氏刻肋海胆进入四腕幼体、六腕幼体、八腕幼体阶段的时间分别为1 d 12 h、5 d 16 h、9 d，整体快于哈氏刻肋海胆 (1 d 16 h、7 d 2 h、10 d 16 h)^[17]和马粪海胆 (2 d 2 h、7~8 d、12~13 d)^[21]，慢于紫海胆 (1 d 7 h、5 d、8 d)^[20]，比高腰海胆 (2 d 10 h、7 d 13 h、9 d 18 h)^[18]四腕、六腕幼体阶段的发育速度更快，而发育至八腕幼体阶段两者耗时又接近。

与其他海胆相比，芮氏刻肋海胆受精后发育至稚胆花费时间较长 (32 d)，发育速度快于哈氏刻肋海胆 (35 d)^[17]，但是明显慢于高腰海胆 (11 d)^[18]、中间球海胆 (18~21 d)^{[ 23]}、马粪海胆 (18~21 d)^[21]、紫海胆 (22 d)^[20]。芮氏刻肋海胆较长的浮游期有利于其种群在更大范围内扩散，这可能与其分布的广泛性有一定的关系。从形态上来看，胚胎发育期间芮氏刻肋海胆在细胞期、桑葚期、囊胚期与哈氏刻肋海胆、光棘球海胆、中间球海胆、高腰海胆等并无太大差异。在原肠期间原肠作用开始后芮氏刻肋海胆胚泡皱缩连续凹陷，其他海胆则是一个光滑的胚泡，并且内陷是缓慢且逐步的^[24]；其原肠期反而比囊胚期更小 (表1，表3)。芮氏刻肋海胆浮游幼体发育期间的整体形态与哈氏刻肋海胆高度近似^[17]。

表  3  芮氏刻肋海胆胚胎及幼体体长与其他种类海胆的比较

Table  3.  Comparison of body length of embryonic and larval T. reevesii with other sea urchin species μm

物种 Species	水温 Water temperature/℃	囊胚 Blastule stage	原肠胚 Gastrula	棱柱幼体 Prism	二腕幼体 2-armed pluteus
芮氏刻肋海胆 Temnopleurus reevesii	24~25	180.02±3.74	163.46±2.27		312.24±1.52
高腰海胆[18] Mespilia globulus	25~26	179.2~214.8	189.2~228.9	169.7~192.7	289.0~306.6
光棘球海胆[22] Mesocentrotus nudus	20~24			168~210	300~400
中间球海胆[23] Strongylocentrotus intermedius	16.0~18.5			162~205	210~268
紫海胆[20] Heliocidanris crassispina	28.5~30.0	92.2±0.8	103.27±2.3	116.5±11.3	138.5±9.9
马粪海胆[21] Hemicentfotus pulcherrimus	17~21	150	150	230	315
哈氏刻肋海胆[17] Temnopleurus hardwickii	23~24	116.41~130.03	118.87~152.04	140.25~186.61	170.05~235.37
物种 Species	水温 Water temperature/℃	四腕幼体 4-armed pluteus	六腕幼体 6-armed pluteus	八腕幼体 8-armed pluteus	稚胆 Juvenile
芮氏刻肋海胆 Temnopleurus reevesii	24~25	480.41±21.92	660.28±39.43	648.98~941.17
高腰海胆[18] Mespilia globulus	25~26	421.2~436.7	590.2~697.0	669.5~815.1	402.1~444.2
光棘球海胆[22] Mesocentrotus nudus	20~24	440~560	520~620	600~730	400~800
中间球海胆[23] Strongylocentrotus intermedius	16.0~18.5	270~480	605~1050	320~410
紫海胆[20] Heliocidanris crassispina	28.5~30.0	329.7±39.7	514.8±43.1	761.1±83.2	373.1±12.9
马粪海胆[21] Hemicentfotus pulcherrimus	17~21	375	605	758	355
哈氏刻肋海胆[17] Temnopleurus hardwickii	23~24	302.34~386.53	432.07~563.22	950.94~1288.44	485.75~655.45

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当然，除种类外，海胆胚胎和浮游幼体的发育特征也与光照、水温、营养状况、培育密度以及其他因素相关联^[25-28]。本研究中，芮氏刻肋海胆幼体可以正常发育为稚胆，这表明所采用的培育条件适合该海胆的人工繁育。

4.   结论

本研究对芮氏刻肋海胆进行了人工催产、配子采集、人工授精以及幼体培育，并对其生活史进行了详实记录。研究表明，在水温24~25 ℃、幼体培育密度约为1只·mL⁻¹和以牟氏角毛藻为饵料进行投喂的条件下，可以成功地对芮氏刻肋海胆进行人工育苗。芮氏刻肋海胆在胚胎及早期幼体阶段发育速度较快，从受精卵到八腕幼体仅需9 d，并且该海胆较易催产，胚胎和早期幼体发育较快，幼体近乎透明，使其可以作为无脊椎动物系统发育研究的模式生物^[8-9]。晚期幼体发育缓慢，这使其浮游期较长，可能有利于其种群扩散。本研究结果可为热带海胆的人工繁育及应用提供科学依据。