Effects of flour types on quality for fried tilapia meat coated with batter
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摘要:
面粉类型对裹糊鱼块深度油炸品质的影响至关重要。以不同筋性面粉基为主要原料，分析其制备裹糊的物理性状、裹糊能力，以及油炸裹糊鱼块的感官、质构、色泽和油脂渗透情况。结果表明，高、中筋粉裹糊具备较高的黏度，这赋予裹糊极强的裹糊能力和油炸膨胀率，使裹糊产品感官更饱满，油炸后中、高筋粉裹糊咀嚼性更突出。应力-形变曲线显示中筋粉在受压过程中呈现22处明显断裂峰，且继首个断裂锋后，应力值呈锯齿状上升状态。苏丹红染色实验显示中筋粉裹糊在油炸过程中形成均匀的凝胶层结构。研究表明，中筋粉酥脆特点较突出，有效抑制了水分蒸发和油脂渗透，在一定程度上起到控油作用，而高筋粉则赋予产品明显的硬度特质。
Abstract:Flour types are crucial to the quality of deep fried tilapia meat coated with batter. We used different gluten flour bases as the main raw materials to prepare coated batter so as to analyze the physical properties, coating ability, sensory, texture, color, and oil penetration of the fish meat coated with batter after frying. The results show that flour coating batter with high and medium gluten had higher viscosity, endowing the batter with strong coating ability and high swelling rate, as well as sensory of well-stacked and excellent chewiness. The stress-strain curve proves that there were 22 obvious fracture peaks during the compression process for medium gluten powder group. After the first fracture peak, the stress value showed a zigzag shaped upward. Sudan red dyeing experiment shows that the batter layer had a uniform structure for medium gluten powder group, which effectively inhibited the evaporation of water in meat and the penetration of oil. The results indicate that medium gluten flour's brittleness effectively suppresses the evaporation of water and the penetration of oil, and helps in oil control to a certain extent, while high gluten flour endows the product with obvious hardness characteristics.
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Keywords:
- Frying /
- Fish meat coated with batter /
- Flour type /
- Brittleness
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鰤鱼诺卡氏菌 (Nocardia seriolae) 属于放线菌目、诺卡氏菌属，是一种兼性胞内丝状杆菌，遍布于自然环境中[1-2]。在水产养殖领域，鰤鱼诺卡氏菌易于侵袭免疫力低下的鱼体，是引起鱼类诺卡氏菌病的主要致病菌[3-4]。该菌通过鱼类体表伤口、鳞片脱落处以及鳃等部位感染宿主，其发病过程缓慢，潜伏期较长，不易被及时发现，导致宿主在患病后期因缺乏有效的治疗手段，病死率极高[5-6]；病鱼的主要症状为游动失稳、厌食、反应迟缓和腹部肿胀，鳍下和局部体表皮肤溃烂出血，伴有显著的炎症反应，后期病鱼体表发黑，体内出现肉芽肿斑点病症，主要表现在多器官表面长出大量的白色或淡黄色结节[3,7-8]。近年关于鰤鱼诺卡氏菌感染淡水鱼、海水鱼的报道日益增多[8]，主要有乌鳢 (Channa argus) [9]、大黄鱼 (Pudosciaena crocea) [10]、大口黑鲈 (Micropterus salmoides) [11]、卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) [12] 和日本鳗鲡 (Anguilla japonica) [13] 等。目前，防治鱼类诺卡氏菌病没有商品化疫苗，定期投放抗生素类药物仍是治疗该病的主要手段[5,11]，长期不规范的大量使用抗生素，致使许多鰤鱼诺卡氏菌产生耐药性[11]。这不仅增加了治疗的难度，还可能对人类健康和环境造成潜在威胁[1-4]。因此，开发新型、有效的治疗手段，如疫苗或生物制剂，对于控制和预防鱼类诺卡氏菌病具有重要意义[6-7]。同时，加强对养殖环境的监控和管理，提高养殖鱼类的免疫力，也是减少该病发生的有效措施。
鰤鱼诺卡氏菌的致病机理复杂，其致病性由多种毒力基因共同调控，从而诱发宿主机体产生多种不良病症，但关于鲈鱼源鰤鱼诺卡氏菌的全基因组及主要致病因子的报道较少。本实验室从河南省新乡市某养殖场自然感染严重的大口黑鲈体内分离出一株沙粒状细菌，通过形态学观察、理化性质检测、16S rRNA基因序列比对、药敏性测试以及回归感染试验对其生物学特性进行分析。同时，本研究对分离菌的基因组序列进行归类和基因注释，分析耐药基因功能，挖掘毒力相关基因，并与不同地区鰤鱼诺卡氏菌进行基因组比较分析，以期找出不同地域鰤鱼诺卡氏菌共同的免疫保护抗原功能基因，为后续研发针对鰤鱼诺卡氏菌的基因工程疫苗奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 实验用鱼
健康大口黑鲈体质量 (40±5.5) g，购自河南省新乡市银丰养殖场。在实验室水箱饲喂驯化1周 [温度(25±2) ℃]，试验前随机抽选10尾健康鲈鱼进行取血涂板、解剖和镜检，确保无鰤鱼诺卡氏菌感染及寄生虫携带。
1.2 病原菌分离纯化
在无菌环境下解剖自然患病严重的大口黑鲈，在其病变心脏和脊柱肌肉结节病灶处取样，划线接种于BHI琼脂培养基 (广东环凯微生物科技有限公司) 上，倒置于28 ℃恒温培养箱中7 d后，挑取优势菌群中单菌落重复纯化培养3次。将纯化后的菌种按菌液∶50%无菌甘油1∶1各600 µL在1.5 mL无菌EP管中混匀，贴塑封膜并置于 −80 ℃冰箱中保存。
1.3 病原菌的鉴定
1.3.1 分离菌形态特征观察
在BHI琼脂培养基上划线接种分离纯化后的细菌，于28 ℃恒温倒置培养5 d，观察菌落形态、大小和颜色；并在光学显微镜下观察纯化菌株的革兰氏染色情况。
1.3.2 分离菌的理化性质检测
根据细菌微量生化鉴定指标说明及《伯杰氏细菌鉴定手册》[14] 的方法，并将鰤鱼诺卡氏菌JCM3360作为参考菌株，通过使用细菌生化鉴定管 (青岛海博生物技术有限公司) 检测分离菌的各项生理生化指标。
1.3.3 分离菌16SrRNA序列测定及系统发育树构建
使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒 [宝日医生物技术 (北京) 有限公司] 提取分离菌全基因组DNA用作扩增模板，利用2×Taq MasterMix (康为世纪生物科技股份有限公司) DNA聚合酶和通用16S rRNA引物 (上游引物 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、下游引物5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，进行目的基因片段体外扩增。PCR反应设定：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，29个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃暂存。经琼脂糖凝胶电泳检测目标片段约1 500 bp，随后将胶回收纯化后的PCR产物送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行测序。将测序结果输进NCBI数据库完成同源性比对分析，借助MEGA 11.0软件选择邻接 (Neighbor Joining, NJ) 法构建系统进化树。
1.4 溶血试验
将保藏分离菌接种至5 mL BHI培养基中，在28 ℃，180 r·mim−1的恒温摇床上进行培养，3 d后将菌悬液通过打孔法加在血琼脂平板 (BKMAMLAB) 上。以本实验室具备溶血活性的嗜水气单胞菌XDMG作为阳性对照，而BHI培养基作为阴性对照。每组样品孔中均加入100 µL的样本，将平板正置放在28 ℃恒温培养箱中，分别在24 h和120 h后观察平板上是否出现溶血圈现象。
1.5 回归感染试验
取分离菌活化于BHI培养基中，置于28 ℃，180 r·mim−1恒温培养5 d后离心收集菌体。健康大口黑鲈随机分为6组 (5个感染组，1个对照组)，每组20尾，采用0.65% (w) 无菌生理盐水使菌液浓度调整为1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107和1.5×108 CFU·mL−1 5个浓度梯度，感染组每尾由腹鳍进针注射0.2 mL菌液，对照组注射等体积0.65% (w) 无菌生理盐水。试验期控制各水箱水下温度为 (25±2) ℃，正常曝气、饲喂，每次换取水箱中一半水量，持续观察21 d，并对各组死亡鱼体数及临床症状进行记录，依据改良寇氏法[15] 计算半数致死量 (LD50)。同时，21 d内随机抽取各感染组死亡病鱼进行解剖观察和病变组织筛菌，重新分离纯化致病菌，确定是否为试验菌感染。
1.6 药物敏感性试验
使用PBS将1.4中培养的细菌调整至1.0×108 CFU·mim−1后，取2 mL菌液 (1%) 接种至灭菌后冷却到45~55 ℃的200 mL BHI琼脂培养基中，轻轻振荡混匀，迅速依次倒入无菌培养皿中，待培养基完全凝固后，使用无菌镊子将26种药敏片 (杭州微生物试剂有限公司) 分别放置于相应的培养基平板上，用塑封膜对平板封口，放于28 ℃恒温箱正置培养4 d，测量抑菌圈直径判断结果。每种药敏片做3组平行实验，设置空白对照组。
1.7 分离菌全基因组测序及基因功能注释分析
使用DNA提取试剂盒提取分离菌基因组DNA，送至上海美吉生物科技有限公司进行全基因组测序。通过统计分析和质控，采用unicycler和pilonjin软件进行数据组装和优化，成功获得完整的细菌基因组序列。使用Glimmer预测基因组的开放阅读框 (Open reading frame, ORF)。利用tRNAscan-SE v2.0[16] 和Barrnap软件分别对基因组中包含的tRNA和rRNA进行预测。通过序列比对工具 (basic local alignment search tool, BLAST) 在NCBI非冗余蛋白数据库 (Non-Redundant Protein Database, NR)，综合的抗生素抗性基因数据库[17] (Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD)，毒力因子数据库[18] (Virulence Factor Database, VFDB) 对ORF翻译的氨基酸进行注释。
1.8 比较基因组分析
结合系统发育树将分离菌株基因组与其聚在同一分支菌株的基因组进行BLAST比对，筛选出近缘菌株，对分离菌株与近缘菌株的基因组特征进行比较分析，并通过minimap2 (2.28-r1209) 进行物种间基因组序列比对，选用asm-to-ref mapping模式构建共线性分析图。此外，利用DNAMAN软件对分离菌株和近缘菌株毒力因子的核酸及氨基酸序列进行差异性分析。
2. 结果
2.1 患病大口鲈鱼剖检症状
大口黑鲈患病前期症状不明显，随着病情的发展，鲈鱼腹部开始肿胀，其胸鳍部位及殖泄孔处红肿，体表溃烂出血，腹腔有黄色液体且在心脏表面和脊柱肌肉处有散在白色或淡黄色结节 (图1)。
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图 1 患病大口黑鲈临床症状注：a. 患病鱼胸鳍及殖泄孔红肿、体表溃疡；b. 患病鱼心脏表面结节；c. 患病鱼脊柱肌肉处散在白色或淡黄色结节。Figure 1. Clinical characteristics of diseased M. salmoidesNote: a. The pectoral fins and genital orifice of the infected sea bass are red and swollen, with ulcers on the body surface; b. Nodules are present on the surface of the heart of the infected sea bass; c. White or pale yellow nodules are scattered in the spinal muscle of the infected sea bass.2.2 致病菌形态特征
从自然患病大口黑鲈心脏白色结节处分离纯化的优势菌株，被命名为XXLX2。将XXLX2菌株划线于BHI琼脂培养基上，28 ℃培养5 d后可观察到显著白色或淡黄色沙粒状单菌落，表面干燥、质硬，菌落后期酷似雪花质感，不透明且为不规则形状 (图2-a)。将其活化于BHI液体培养基中4 d，观察到菌液澄清，菌体在试管底部呈絮状沉淀。菌体在100倍显微镜下呈短杆或长杆丝状，革兰氏染色为蓝色阳性菌 (图2-b)。
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图 2 XXLX2生长菌落形态和革兰氏染色结果注: a. BHI培养基上白色或淡黄色菌落; b. XXLX2菌株革兰氏染色为蓝色阳性菌。Figure 2. Morphological and gram staining result of strain XXLX2Note: a. White or pale yellow colonies on BHI medium; b. The XXLX2 strain is Gram-positive, staining blue with Gram staining2.3 XXLX2菌株的理化特征
大口黑鲈源分离菌株XXLX2的理化试验结果 (表1) 显示，其能利用柠檬酸盐和D-葡萄糖作为唯一碳源维持生长，过氧化氢酶试验和七叶苷水解试验呈阳性，明胶液化试验呈阴性，不还原硝酸盐且不水解淀粉。XXLX2菌株的理化特性与鰤鱼诺卡氏菌参考菌株JCM3360基本相符，属于诺卡氏菌属的一般特征。
表 1 XXLX2生理生化特征Table 1. Physiological and biological characteristics of strain XXLX2生化项目
Biochemical itemXXLX2 鰤鱼诺卡氏菌
JCM3360
N. seriolae
JCM3360唯一碳源利用
Utilization of a single carbon source甘露醇Mannitol − − D-葡萄糖D-glucose + + 阿拉伯糖Arabinose − − 柠檬酸盐Citrate + + 山梨醇Sorbitol − − 酶活性Enzymatic activity 过氧化氢酶Catalase + + 硝酸盐还原 Nitrate reduction − − 溶菌酶lysozyme − − 氧化酶Oxidase − − 尿素酶Urease − − 水解活性 Hydrolytic activity 七叶苷Aesculin + + 淀粉Starch − − 明胶液化 Gelatin hydrolysis − − 温度耐受Temperature tolerance 37 ℃ 生长 Grow at 37 ℃ − − 45 ℃ 生长 Grow at 45 ℃ − − 注： “+”表示阳性反应；“–”表示阴性反应。 Note: "+" represents a positive reaction; "–" represents a negative reaction. 2.4 XXLX2菌株16S rRNA基因序列分析
分离菌XXLX2的16S rRNA基因扩增凝胶电泳图谱如图3，在1 000~2 000 bp之间出现单一清晰条带，测序数据表明目标DNA片段长度为1 391 bp，经BLAST在线比对分析，XXLX2菌株与NCBI数据库中的鰤鱼诺卡氏菌 (GenBank登录号分别为CP017839.1、CP063662.1、AP017900.1、EU595589.1) 16S rRNA基因序列的同源性高至99.93%。基于16S rRNA基因序列在种属水平上借助MEGA 11.0软件选择邻接法构建系统进化树 (图4)，发现XXLX2菌株和鰤鱼诺卡氏菌株自然聚为同一分支，综合菌株形态特征和生理生化特性，鉴定其属于鰤鱼诺卡氏菌。
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图 3 XXLX2菌株 的 16S rRNA 扩增结果注：M: DL 2000 DNA Marker；1. 阴性对照；2—3. XXLX2 (1391 bp)。Figure 3. PCR amplification results of strain XXLX2 16S rRNANote: M. DL 2000 DNA Marker; 1. Negative control; 2–3. XXLX2 (1391 bp).2.5 XXLX2菌株溶血试验结果
如图5所示，将阴性对照BHI培养基、已活化好的XXLX2菌株菌悬液和阳性对照嗜水气单胞菌XDMG通过打孔法加在血琼脂平皿中，28 ℃培养24 h后，阳性对照嗜水气单胞菌XDMG出现明显溶血圈，并于120 h后溶血圈变大。XXLX2菌株与阴性对照一致，均无溶血圈现象。
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图 5 XXLX2菌株的溶血试验注：a为24 h溶血实验图， b为120 h溶血实验图；1为阴性对照孔，2为阳性对照孔，3为XXLX2菌株加样孔。Figure 5. Hemolysis test of strain XXLX2Note: Figure a shows the 24-hour hemolysis experiment, and Figure b shows the 120-hour hemolysis experiment; in both figures, 1 represents the negative control well, 2 represents the positive control well, and 3 represents the sample well with XXLX2 strain added.2.6 大口黑鲈回归感染试验
使用XXLX2菌株对大口黑鲈进行人工注射感染 (表2)，在水温 (25±2) ℃环境条件下，对照组大口黑鲈未出现任何症状，21 d内均没有死亡；在攻毒2 d后，除1.5×104 CFU·mim−1感染组试验鱼，其余感染组的大口黑鲈表现出反应迟缓的不良症状；其中，1.5×108 CFU·mim−1感染组大口黑鲈在攻毒第4天出现死亡鱼体，此后该组死亡数量逐渐增加，剩余鲈鱼第10天全部死亡；攻毒第5天，1.5×106和1.5×107 CFU·mim−1两个感染组开始出现死亡，至第15天所有剩余个体均死亡；剩余2个浓度感染组鲈鱼在攻毒第8—第11天相继出现死亡，至攻毒第21天，1.5×105 CFU·mim−1感染组存活8尾鱼，最低浓度感染组存活15尾鱼。通过统计各感染组大口黑鲈死亡数量，按照改良寇氏法计算其半数致死量LD50为1.49×105 CFU·mim−1。回归感染试验中的死亡病鱼体表发黑，胸鳍及腹鳍下皮肤组织红肿，殖泄孔周围溃疡。解剖发现部分鱼体腹腔流出淡黄色液体，心脏、肝脏和脊柱附近肌肉组织出现明显的白色结节，与之前自然患病鲈鱼症状类似。此外，从上述鲈鱼病灶处分离纯化致病菌，通过对其菌落形态及16S rRNA测序结果BLAST比对分析，发现该菌为鰤鱼诺卡氏菌，表明XXLX2菌株是引起回归感染试验中鲈鱼患病的致病菌。
表 2 XXLX2菌株的人工感染实验结果Table 2. Artificial infection experiment results of strain XXLX2菌量
Concentration/
(CFU·mL−1)注射剂量
Injection dose/
mL试验数
Number of
tests观察时间及死亡数量
Observation time and number of deaths死亡总数
Total deaths/
尾累积死亡率
Cumulative
mortality/%3 d 6 d 9 d 12 d 15 d 18 d 21 d 1.5×108 0.2 20 0 5 3 0 0 0 0 20 100 1.5×107 0.2 20 0 2 5 7 3 0 0 20 100 1.5×106 0.2 20 0 0 2 9 5 0 0 20 100 1.5×105 0.2 20 0 0 1 3 4 0 0 12 60 1.5×104 0.2 20 0 0 0 1 0 2 1 5 25 0.65% (w) NaCl 0.2 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2.7 XXLX2菌株药敏试验结果
药敏试验结果显示XXLX2菌株对氯霉素、万古霉素、链霉素等13种抗生素敏感，对β-内酰胺类氨苄西林、四环素类多西环素以及喹诺酮类环丙沙星3种抗生素中度敏感，对阿莫西林、多粘菌素B和红霉素等10种抗菌药物表现出耐受 (表3)。
表 3 XXLX2菌株耐药性检测结果Table 3. Results of drug resistance detection of strain XXLX2抗菌药种类
Types of antibiotic抗菌药
Antibiotics结果
Resultβ－内酰胺类 β-lactams 阿莫西林 Amoxicillin R β－内酰胺类 β-lactams 美罗培南 Meropenem R β－内酰胺类 β-lactams 头孢氨苄 Cephalexin R β－内酰胺类 β-lactams 头孢拉定 Cephradine R β－内酰胺类 β-lactams 头孢哌酮 Cefoperazone R β－内酰胺类 β-lactams 头孢曲松 Ceftriaxone R β－内酰胺类 β-lactams 青霉素 penicillin R β－内酰胺类 β-lactams 氨苄西林 Ampicillin I 多肽类抗生素 Polypeptides 多粘菌素B Polymixin B R 大环内酯类抗生素
Macrolides antibiotics红霉素 Erythromycin R 氯霉素类抗生素
Chloram phenicols氯霉素 Chloramphenicol S 糖肽类抗生素
Glycopeptides万古霉素 Vancomycin S 氨基糖苷类抗生素 Aminoglycosides 链霉素 Streptomycin S 氨基糖苷类抗生素 Aminoglycosides 卡那霉素 Kanamycin S 氨基糖苷类抗生素 Aminoglycosides 阿米卡星 Amikacin S 磺胺类抗菌药物
Sulfonamides复方新诺明
Paediatric Compound
Sulfamethoxazole TabletsS 磺胺类抗菌药物
Sulfonamides磺胺异噁唑 Sulfisoxazole S 四环素类 Tetracyclines 多西环素 Doxycycline I 四环素类 Tetracyclines 米诺环素 Minocycline S 四环素类 Tetracyclines 四环素 Tetracycline S 利福霉素类 Rifamycins 利福平 Rifampicin S 喹诺酮类 Quinolones 恩诺沙星 Enrofloxacin S 喹诺酮类 Quinolones 氧氟沙星 Ofloxacin S 喹诺酮类 Quinolones 环丙沙星 Ciprofloxacin I 喹诺酮类 Quinolones 恩诺沙星 Enrofloxacin S 喹诺酮类 Quinolones 诺氟沙星 Norfloxacin R 注：S. 敏感；I. 中介；R. 耐药。 Note: S. Sensitivity; I. Intermediary; R. Resistant. 2.8 XXLX2菌株基因组的特性
通过第二代Illumina平台与第三代PacBio平台测序技术的联合应用，对XXLX2菌株全基因组开展测序。所得基因组大小为8 122 565 bp (图6)，(G+C) mol%含量为68.14%，基因组中共预测到7 635个编码基因，所有编码基因的总长度为7 186 452 bp，编码区总长度占全基因组的比例为88.48%。包含短散在重复序列SINEs 17个，长散在重复序列LINEs 12个，DNA转座子2个，串联重复 (Tandem Repeat, TR) 序列224个。同时也发现12个rRNA，包括5S rRNA 4个，16S rRNA 4个，23S rRNA 4个；63个tRNA以及37个sRNA。
2.9 耐药基因及毒力基因注释
根据CARD数据库的注释结果 (identity≥60%)，XXLX2菌株中包含28个抗生素耐药基因 (表4)，这些基因涉及多肽类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、梭链孢烷类、阿尔法霉类、吡嗪类、水杨酸类、利福霉素类以及头孢菌素类等抗生素。耐药基因的作用机制主要包括抗生素靶标改变、抗生素外排和抗生素失活。
表 4 XXLX2菌株的耐药基因的分类情况Table 4. Classification of resistance genes in strain XXLX2耐药基因分类
Resistance gene classification相关基因
Related gene肽抗生素
Peptide antibioticalmE 大环内脂类抗生素
Macrolide antibioticmacB 氨基糖苷类抗生素
Aminoglycoside antibioticbaeS 四环素抗生素
Tetracycline antibiotictetA(58) 梭链孢烷抗生素
Fusidane antibioticfusA 吡嗪抗生素
Pyrazine antibioticpncA, tex 水杨酸抗生素
Salicylic acid antibioticfolC, thyA 利福霉素抗生素
Rifamycin antibioticrpoB, rbpA 头孢菌素
CephalosporinpenP XXLX2菌株中鉴定出26个有明确二级分类的毒力基因 (identity≥60%, Coverage≥90%)。其中 (表5)，与营养和代谢相关的毒力基因包括异柠檬酸裂解酶基因icl、MbtH家族蛋白基因mbtH、硝酸还原酶α/β亚基narG/H和天冬氨酸1-脱羧酶基因panD。与黏附相关的毒力基因包括伴侣蛋白基因groEL和延展因子基因tufA。编码调控或免疫调节相关的毒力基因包含双组分转录调节因子devR/S、双功能(P)PPGPP合成酶/水解酶基因relA、RNA聚合酶σ因子sigA、金属依赖性转录调节因子ideR、反应调节转录因子mprA、转录调节蛋白基因phoP、热休克蛋白转录抑制因子hspR、柔红霉素ABC转运体渗透酶基因ddrA。上述基因在菌株对环境压力的调控中发挥作用，并与菌株在宿主体内持续生存的能力紧密相关。预测到的编码菌株抗逆性相关的毒力基因包括超氧化物歧化酶基因sodA、尿素酶亚基ureA、过氧化氢酶基因katG和烷基氢过氧化物还原酶亚基ahpC。这些基因与菌株在抵御氧化应激以及维持细菌细胞内亚硝化物质与去亚硝化防御系统之间的平衡方面具有密切关联。
表 5 XXLG2菌株的毒力基因的分类情况Table 5. Classification of virulence genes in XXLG2 strain毒力因子二级分类
Second-level classification of
virulence factors相关基因
Related gene基因数量
Gene
number营养/代谢因素相关毒力因子Nutritional/Metabolic factor Icl, mbtH, narG/H, panD 7 黏附相关毒力因子 Adherence groEL, tufA 3 调控相关毒力因子 Regulation devR/S, relA, sigA, ideR, mprA, phoP, hspR 11 免疫调节相关毒力因子
Immune modulationddrA 1 抗逆性相关毒力因子
Stress survivalsoda, urea, katG, ahpC 4 2.10 比较基因组分析
2.10.1 XXLX2菌株与近缘菌株基因组概况
基于2.4中系统发育树，将XXLX2菌株与进化树同一分支菌株的基因组进行BLAST在线比对，由NCBI上数据分析发现，XXLX2菌株基因组与鰤鱼诺卡氏菌EM150506、鰤鱼诺卡氏菌NK201610020和鰤鱼诺卡氏菌UTF1的基因组数据相似性比较高 (BLAST比对identity分别为99.93%、99.92%和99.99%)。同时，本试验将XXLX2菌株基因组与3株亲缘关系较近的鰤鱼诺卡氏菌基因组的一般特征进行了比较分析 (表6)。通过对比发现这4株菌基因组大小介于8.12~8.31Mb，GC含量介于68.10%~68.14%；XXLX2菌株编码基因数少于另外3株菌，且其rRNA和tRNA数量与3株鰤鱼诺卡氏菌存在差异。
表 6 4株鰤鱼诺卡氏菌基因组的一般特征Table 6. General characteristics of four N. seriolae genomes菌株
Strain基因组大小
Genome size/MbGC 含量
GC Content/%编码基因
CdsrRNA tRNA 年份
Year来源
Source来源地
Source location鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae EM1505068.30 68.10 7 794 12 65 2015 患病日本鳗鲡
Diseased Anguilla japonica韩国
South Korea鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae NK2016100208.31 68.10 7 812 3 64 2013 乌斑杂交鳢
Hybrid Snakehead中国广东
Guangdong,
China鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae UTF18.12 68.10 7 697 4 63 2014 五条鰤
Seriola quinqueradiata日本
Japan鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae XXLX28.12 68.14 7 635 12 63 2023 大口黑鲈
Micropterus salmoides中国新乡
Xinxiang,
China2.10.2 共线性分析
将XXLX2菌株基因组与不同来源的3株鰤鱼诺卡氏菌 (EM150506、NK201610020、UTF1) 的基因组进行共线性分析，结果见图7，通过基因组间的连线分析，可见XXLX2菌株与韩国鳗鲡源分离株EM150506和国内乌斑杂交鳢源分离株NK201610020在基因组整体上展现出较高的共线性。同时，XXLX2菌株与鰤鱼诺卡氏菌UTF1基因组间的匹配关系非常紧密，表示共线性程度最高，但是以XXLX2菌株的基因组序列作为参考，与另外3株鰤鱼诺卡氏菌基因排列的顺序具有一定的差异。
2.10.3 毒力因子比对分析
为分析4株鰤鱼诺卡氏菌在致病机制方面的差异与共性，以XXLX2菌株作为参考菌株，与3株鰤鱼诺卡氏菌 (EM150506、NK201610020、UTF1) 进行毒力基因核苷酸水平与氨基酸水平的序列对比 (表7)。结果表明XXLX2菌株与3株鰤鱼诺卡氏菌在tufA (gene2326)、narG (gene3969)、narH (gene3970)、sigA (gene5031)、 (gene5123)、ideR (gene5134) 和ahpC (gene5154) 等毒力基因核苷酸水平上高度保守。XXLX2菌株与鰤鱼诺卡氏菌 (NK201610020和UTF1) 相比，在groEL (gene0458)、tufA (gene0757, gene2326)、mbtH (gene0773)、ureA (gene3618)、narG (gene3969, gene6279)、narH (gene3970, gene6280)、devR (gene4531)、sigA (gene5031, gene5123)、ideR (gene5134)和ahpC (gene5154) 等14个毒力基因的核苷酸水平上同源性达到了99%以上，存在碱基缺失、插入或替换现象。经比较sodA (gene0071)、devR (gene2757) 以及panD (gene7262) 3个毒力基因的碱基序列，发现XXLX2菌株与3株鰤鱼诺卡氏菌在这3个基因上的同源性相对较低，存在一些显著的碱基序列差异。
表 7 以XXLX2菌株为参考菌株各菌株毒力基因序列同源性及编码氨基酸序列保守性Table 7. Homology of virulence gene sequences and conservation of encoded amino acid sequences among various strains with XXLX2 strain as reference strain毒力基因
Virulence gene菌株 Strain 鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae EM150506鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae NK201610020鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae UTF1sodA gene0071 38.51/100 38.51/93.64 38.51/93.64 groEL gene0458 43.67/100 100/100 100/100 Icl gene0540 100/100 41.75/100 41.75/100 tufA gene0757 40.87/100 100/100 100/100 mbtH gene0773 35.65/100 100/100 100/100 ddrA gene0950 44.90/100 44.90/100 100/100 devS gene1627 39.75/100 100/− 39.75/− tufA gene2326 100/100 100/100 100/100 devR gene2757 41.92/100 41.92/100 41.92/100 ureA gene3618 43.71/100 100/100 100/— narG gene3969 99.92/99.84 99.95/99.92 100/100 narH gene3970 100/100 100/100 100/100 katG gene4240 100/98.90 43.92/98.08 100/98.90 devR gene4531 42.84/100 100/100 100/100 relA gene4643 43.09/100 100/100 43.09/99.49 sigA gene5031 100/100 100/96.58 99.93/— sigA gene5123 100/100 100/100 100/97.2 ideR gene5134 100/100 100/100 100/100 ahpC gene5154 100/100 100/100 100/100 sigA gene6030 37.08/100 100/96.93 37.08/95.11 narG gene6279 43.54/99.92 100/100 100/100 narH gene6280 42.64/100 100/100 100/100 mprA gene6919 100/100 45.54/100 45.54/100 phoP gene7108 99.86/99.59 42.67/100 42.67/93.88 panD gene7262 39.77/99.28 39.77/100 39.31/100 hspR gene7390 100/100 43.75/100 43.75/100 注：“—”表示未比对到氨基酸序列；“/”前表示基因序列同源性比对结果；“/”后表示编码氨基酸序列保守性比对结果。 Note: "—" represents that no amino acid sequence was aligned; the part before "/" represents the homology comparison result of the gene sequence; and the part after "/" represents the conservation comparison result of the encoded amino acid sequence. 在26个毒力基因编码的氨基酸层面，XXLX2菌株与3株鰤鱼诺卡氏菌之间表现出了高度的保守性 (表7)。经过仔细的比对分析发现，在sodA (gene0071) 基因编码的氨基酸序列上，XXLX2菌株与鰤鱼诺卡氏菌 (NK201610020和UTF1) 相比，在编码的甲硫氨酸和丙氨酸之间，XXLX2菌株多出了13个氨基酸。同样，在phoP (gene7108) 基因编码的氨基酸序列上，XXLX2菌株相较鰤鱼诺卡氏菌UTF1在编码的甲硫氨酸和亮氨酸之间多了14个氨基酸。此外，相较鰤鱼诺卡氏菌 (NK201610020和UTF1)，在sigA (gene5031, gene6030) 基因编码的氨基酸序列上，XXLX2菌株也出现了类似的差异。尽管存在这些差异，XXLX2菌株与这3株鰤鱼诺卡氏菌在其他毒力基因编码的氨基酸序列上依然保持了高度的一致性，仅有个别氨基酸发生了替换。
3. 讨论
3.1 大口黑鲈源病原菌分离与鉴定
鰤鱼诺卡氏菌作为一种细胞壁较为厚实的寄生性微生物，在自然界中分布广泛，包括土壤、湖泊以及腐败的动植物组织等环境[1-2]。该菌种能够穿透宿主细胞并在其内部进行繁殖，导致结节等感染性疾病的产生。特别是对于鲈鱼，鰤鱼诺卡氏菌具有显著的致病性，在室外养殖的条件下，该菌广泛存在于水体中，感染鲈鱼并诱发诺卡氏菌病，给鲈鱼养殖业带来了严重的经济损失[2-4]。本研究从自然感染的大口黑鲈心脏结节部位分离并纯化出一种优势菌株，通过结合菌落形态学、理化特性分析，并依据16S rRNA基因序列构建的系统发育树，确定该菌株为鰤鱼诺卡氏菌，命名为XXLX2。
在实验室环境下，鰤鱼诺卡氏菌的生长速度相对较慢，通常需要较长时间的培养才能累积足够的菌体量，以供后续的研究与实验。本研究在培养鰤鱼诺卡氏菌XXLX2的过程中，观察到其在血琼脂平板上的生长周期 较短 (3~4 d)，而相较于TSA平板 (6~7 d)，XXLX2菌株在BHI琼脂培养基上的生长速度 (4~5 d) 显著加快，这可能与鰤鱼诺卡氏菌易于通过血液循环进行迁移感染的致病机制有关[19]。同时，在25~28 ℃条件下培养，XXLX2菌株生长状态最佳，而在37~45 ℃培养条件下，其生长受到明显抑制，这一现象可能与该菌株的自然生存环境及其宿主的体温存在关联。经溶血试验验证，XXLX2菌株不产生溶血素，无法通过破坏红细胞获取营养，但该菌株能够利用培养基中的蛋白质、碳水化合物及其他有机物质作为其营养来源。此外，当鰤鱼诺卡氏菌感染宿主时，因其不会使红细胞破裂，可以逃避机体早期基于溶血反应的免疫识别，从而有更多机会在血液循环中扩散到其他部位，并在定植部位形成肉芽肿性病变[19-20]。
3.2 XXLX2菌株的动物回归试验结果
本实验采用分离纯化的鰤鱼诺卡氏菌XXLX2对大口黑鲈进行回归感染，观察到被感染鱼体心脏、肝脏和脾脏等内脏器官出现白色肉芽肿结节，与自然患病鲈鱼症状相符。然而，在鲈鱼的鳃部及脊柱肌肉组织中并未发现结节病症，这可能与鰤鱼诺卡氏菌的感染途径和感染时间存在一定的关联性[21]。对上述病灶组织取样筛菌，通过观察菌落形态及进行16S rRNA基因测序结果BLAST比对分析，确定复筛到鰤鱼诺卡氏菌，即XXLX2菌株是大口黑鲈患病的致病菌。同时，本研究进行了为期21 d的持续观察与记录，结果表明，对照组鲈鱼存活率为100%；2个低浓度组鲈鱼累计死亡率分别为60%和25%；在3个高浓度试验组 (1.5×106、1.5×107和1.5×108 CFU·mL−1) 中，鲈鱼在观察期间全部死亡，且高浓度感染组的患病大口黑鲈多数体表发黑，眼球红肿突出，解剖后可见大量黄色腹水，肝脏颜色加深，鱼体内多处出现肉芽肿结节。在自然环境中，鰤鱼诺卡氏菌在宿主体内具有较长的潜伏期，由此引发的诺卡氏菌病表现为一种慢性疾病[1-4]。然而，实验室内的急性攻毒试验显示，随着注入鱼体内的菌株菌体量的增加，宿主的发病期会提前，生理功能受损，导致病情加剧，直至死亡。本研究中XXLX2菌株对大口黑鲈的LD50为1.49×105 CFU·mL−1，与吕丽丽等[22] 报道的加州鲈分离菌NI的LD50不同，这种差异可能是由于不同时期、不同体质量鱼类的免疫能力，以及实验环境或半数致死量算法不一致所引起的。
3.3 基于全基因组序列的鰤鱼诺卡氏菌同源性比对分析
随着生物信息学的快速发展，全基因组测序技术不断精进，现已广泛应用于菌种的鉴定与分析领域。通过基因组的比较分析，能够揭示病原菌在分子层面的遗传进化关系，并为菌种鉴别与分类、致病基因挖掘以及与宿主互作机制的研究提供重要的数据支撑[21,23]。本研究采用Illumina与PacBio测序技术对鰤鱼诺卡氏菌XXLX2进行基因组测序与分析，研究发现，XXLX2菌株的基因组大小、GC含量、编码基因、rRNA及tRNA数量相较3株鰤鱼诺卡氏菌 (EM150506、NK201610020、UTF1) 存在差异，这些差异可能源于菌株的地理分布、宿主特异性、以及进化过程中的遗传变异。
通过将XXLX2菌株的基因组与从NCBI数据库中挑选出的3株鰤鱼诺卡氏菌 (EM150506、NK201610020、UTF1) 的基因组进行共线性比较分析，结果显示，尽管是4株分离自不同时期、不同宿主的鰤鱼诺卡氏菌，但XXLX2菌株与3株菌基因组的共线性程度很高，表明鰤鱼诺卡氏菌在进化层面上的基因组序列较为保守，此结论与张美超[21] 等研究相一致。此外，XXLX2菌株与3株鰤鱼诺卡氏菌基因片段的排列顺序存在一定的差异，这些差异可能与菌株所处的地理环境及对不同宿主内环境的适应性相关。
3.4 XXLX2菌株耐药性基因及药敏试验分析
经由药敏试验，XXLX2菌株对β-内酰胺类抗生素表现出显著的耐药性，进一步分析耐药基因发现，XXLX2菌株携带有penP基因，该基因编码的β-内酰胺酶能够破坏抗生素的β-内酰胺环结构，从而降低其抗菌效力[11,23]。同时，XXLX2菌株对多粘菌素B和红霉素亦显示出耐药性，这可能与菌株内存在的肽类抗生素基因almE和大环内酯类耐药基因macB有关。almE基因编码的多粘菌素抗性操纵子相关蛋白，通过改变菌株细胞壁和表面电荷等机制，增强了对多粘菌素类抗生素的耐药性[11,22-24]。而macB基因编码的ABC转运ATP结合蛋白，通过识别并结合红霉素，形成复合物，并利用ATP水解释放的能量，驱动复合物排出细胞外，导致细菌对红霉素产生耐药性[11,24]。在上述3类抗生素上，XXLX2菌株表现出抗性表型与基因型高度一致。XXLX2菌株还含有baeS、tetA(58)、rpoB、rbpA等耐药基因，但其对氨基糖苷类、四环素类及利福霉素类药物保持敏感性。这种细菌抗性表型与基因型的不一致性，可能是由于耐药基因未表达或表达受到抑制，导致菌株在实际药物环境下未能有效表现出耐药性。
此外，大量研究表明从不同地区、不同宿主中筛选出的鰤鱼诺卡氏菌，在针对特定抗生素的敏感性方面，呈现出一定的差异性[25-26]，这种差异性使得通过常规药物防治诺卡氏菌病变得颇具挑战。因此，研发安全有效的疫苗是解决鱼类诺卡氏菌病的最有效途径。
3.5 XXLX2菌株毒力因子及比较分析
毒力因子作为病原菌致病能力的核心要素，在鰤鱼诺卡氏菌XXLX2中亦发挥着重要作用。本研究通过基因组注释及比较分析，发现XXLX2菌株携带有多种毒力因子编码基因，如tufA、sodA、groEL、icl、narG/H、katG、sigA、ideR及ahpC等，这些毒力基因在不同菌株间的分布及表达水平差异，可能是导致鰤鱼诺卡氏菌致病性差异的重要原因。通过将XXLX2菌株的毒力基因与3株鰤鱼诺卡氏菌 (EM150506、NK201610020、UTF1) 进行比对分析，研究发现，XXLX2菌株与3株鰤鱼诺卡氏菌在sodA (gene0071)、devR (gene2757) 以及panD (gene7262) 3个基因序列上的同源性相对较低，但XXLX2菌株与3株菌在上述基因编码的氨基酸序列上却具有较高的一致性。同时，XXLX2菌株相较3株鰤鱼诺卡氏菌在部分毒力基因编码的氨基酸序列上具有一定差异，如在sodA基因编码的氨基酸序列中，XXLX2菌株多出的13个氨基酸可能提高了超氧化物歧化酶的活性或其稳定性，进而增强菌株的抗氧化能力和生存能力。这可能归因于不同菌株间生存环境的差异，从而导致了XXLX2菌株在遗传演化上的独特性。4株菌在tufA (gene2326)、narG (gene3969)、narH (gene3970)、sigA (gene5031, gene5123)、ideR (gene5134) 和ahpC (gene5154) 等毒力基因的核苷酸及氨基酸水平上均表现出高度的保守性，据此推断，这些基因在鰤鱼诺卡氏菌的遗传演化过程中发生变异的概率相对较小，且对于细菌在宿主内的存活和传播至关重要[27-29]。此外，这些基因在不同鰤鱼诺卡氏菌菌株中可能具有相似的调控机制和功能表达，为鰤鱼诺卡氏菌的致病机理提供了新的视角。
XXLX2菌株存在katG、ahpC、narG、narH和ideR等基因，其中，过氧化氢酶能够削弱吞噬细胞的氧化杀伤机制，且当过氧化氢酶基因 (katG) 活性受抑时，ahpC与ahpD在菌株的抗氧化防御体系中发挥着关键作用[23,31]。同时，narG和narH基因有助于鰤鱼诺卡氏菌在低氧条件下 (如接受刺激信号的巨噬细胞内) 存活，并为其提供潜伏期生存所需的能量[24,32]。IdeR蛋白通过与Fe2+结合形成复合体，以调控多种基因的表达水平，进而参与铁代谢过程[33]。相关研究报道，结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 缺失IdeR蛋白会呈现持续摄入铁元素，进而引发毒性铁过载现象，并导致菌株毒力减弱[34]。另有研究表明[35]，在BHI培养基中连续培养200代后的巴西诺卡氏菌 (N. brasiliensis) HUJEG-1基因组发生缺失，缺失部分涵盖编码细菌毒力因子的基因，如硝酸盐还原酶基因、过氧化氢酶基因、超氧化物歧化酶基因及铁依赖调节蛋白基因，经实验验证，该菌株毒力减弱，推测上述基因的缺失与其毒力降低密切相关。同时，XXLX2菌株与3株鰤鱼诺卡氏菌在katG、ahpC、narG、narH和ideR等基因的核苷酸及氨基酸序列上保持较高一致性，这种高保守性揭示上述基因编码的蛋白可能在鰤鱼诺卡氏菌中具有重要的生物学作用，需要进一步研究以发现其功能和免疫学意义。此外，表明XXLX2菌株具备相对全面的毒力基因和功能蛋白，以XXLX2菌株为疫苗株研发的基因工程疫苗，其应用范围较为广泛。
4. 结论
本研究从患病大口黑鲈心脏白色结节处分离纯化到XXLX2菌株，经菌落形态学、理化特性分析，并依据16S rRNA基因序列比对鉴定为鰤鱼诺卡氏菌。动物回归感染试验表明，XXLX2菌株会诱发大口黑鲈心、肝和脾等内脏器官病变，测定其半数致死量为1.49×105 CFU·mL−1。结合耐药基因及药敏试验结果表明XXLX2菌株对多粘菌素B、红霉素和β-内酰胺类抗生素表现出抗性表型与基因型的高度一致性。XXLX2菌株基因组序列保守，在4株鰤鱼诺卡氏菌基因组的比较分析中，揭示了不同地域的鰤鱼诺卡氏菌在毒力因子方面存在的差异与共性，旨在探索不同地域鰤鱼诺卡氏菌共有的免疫保护抗原功能基因，为后续研发鰤鱼诺卡氏菌XXLX2基因工程疫苗提供分子水平数据支持。
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图 1 不同面粉类型对油炸裹糊鱼块裹糊挂糠率和膨胀率的影响
注：不同小写和大写字母分别表示裹糊挂糠率和膨胀率差异显著 (p<0.05)。
Figure 1. Effects of flour types on coating ratio and swelling rate of fried fish meat coated with batter
Note: Different lowercase and capital letters represent significant differences in coating and swelling rates, respectively (p<0.05).
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图 2 不同面粉类型锯齿状应力-形变曲线图
Figure 2. Zigzag stress-deformation curves for different flour types
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图 3 不同面粉类型的裹糊鱼块油炸脆性和硬度
注：不同大写、小写字母表示硬度、脆性方面差异显著 (p<0.05)。
Figure 3. Brittleness and hardness of fried fish meat coated with batter of different flour types
Note: Different lowercase and capital letters represent significant differences for hardness and brittleness, respectively (p<0.05).
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图 4 不同面粉类型的油炸裹糊鱼块实拍图
Figure 4. Real shot picture of fried fish meat coated with batter of different flour types
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图 5 不同面粉类型的裹糊鱼块油炸后截面苏丹红染色图 (4×)
Figure 5. Sudan red staining diagram of cross sections of fried fish meat coated with batter of different flour types (4×)
表 1 感官评分表
Table 1 Sensory evaluation criteria
色泽
Color形态
Form风味
Flavor滋味
Taste咀嚼感
Chewing sensation颜色金黄、均匀、无焦糊 (2.0分) 裹糊完整，厚薄一致，无
变形 (1.5分)面包鱼香味明显，无焦味 (2.0分) 肉嫩、香鲜可口(2.0分) 硬度适中，酥松质脆，有明显的咔嚓声 (2.5分) 颜色淡黄或黄褐色，基本均匀，略有焦糊 (1.5分) 裹糊基本完整，厚薄基本一致，略变形 (1.0分) 有油炸香味，有稍许焦味 (1.5分) 肉鲜嫩不足，略有香鲜味 (1.5分) 硬度稍大，略有咔嚓声 (2.0分) 颜色淡黄或暗褐，不均匀，
焦糊明显 (0.5分)裹糊不完整，厚薄不一致，变形明显 (0.5分) 油炸香味不明显，有焦味 (1.0分) 肉不鲜嫩，香鲜味差 (1.0分) 无酥脆感，咀嚼无咔嚓声 (1.0分) 
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表 2 不同面粉类型裹糊液的物理性状
Table 2 Physical properties of batter of different flour types
指标
Index高筋粉
High-gluten flour中筋粉
Medium-gluten flour低筋粉
Low-gluten flour无筋粉
Gluten-free flour黏度Viscosit/(m.pa.s) 2 132±45a 2 067±70a 1 256±12b 119±4c 持水率Water retention/% 72.5±0.02a 70.0±0.73b 69.9±0.13b 72.1±1.07a 注：同行不同小写字母表示显著性差异 (p<0.05)。 Note: Different lowercase letters within the same line represent significant differences (p<0.05).
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表 3 不同面粉类型裹糊鱼块油炸感官评价得分
Table 3 Score of sensory evaluation of fried fish meat coated with batter of different flour types
面粉类型
Flour type色泽
Color (2.0分)形态
Form (1.5分)风味
Flavor (2.0分)滋味
Taste (2.0分)咀嚼感
Chewy (2.5分)总分
Score (10.0分)高筋粉 High-gluten flour 1.54±0.06a 1.36±0.05ab 1.51±0.03ab 1.54±0.07ab 2.03±0.08b 7.98±0.29b 中筋粉 Medium-gluten flour 1.60±0.07a 1.41±0.02a 1.67±0.05a 1.61±0.02a 2.23±0.07a 8.52±0.23a 低筋粉 Low-gluten flour 1.35±0.06b 1.30±0.06b 1.42±0.04b 1.47±0.04b 1.87±0.10c 7.41±0.30c 无筋粉 Gluten-free flour 1.37±0.04b 1.17±0.04c 1.24±0.04c 1.34±0.04c 1.71±0.05d 6.83±0.21d 注：同列不同字母表示具有显著性差异(p<0.05)。Note: Different lowercase letters within the same row represent significant differences (p<0.05).
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表 4 不同面粉类型裹糊鱼块油炸色泽
Table 4 Color of fried fish meat coated with batter of different flour types
色度
Color高筋粉
High-gluten flour中筋粉
Medium-gluten flour低筋粉
Low-gluten flour无筋粉
Gluten-free flour亮度 L* 70.58±1.94b 71.6±2.43ab 71.3±1.19ab 74.44±0.10a 红绿度 a* 9.28±2.43a 9.05±0.81a 8.28±0.95a 5.92±0.38b 黄蓝度b* 37.90±2.75a 33.87±1.81b 35.42±0.60b 38.02±1.63a 注：同行不同字母表示差异显著 (p<0.05)。Note: Different letters within the same line represent significant differences (p<0.05).
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