Study on artificial propagation and embryonic development regularity of Discogobio multilineatus
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摘要:
多线盘鮈 (Discogobio multilineatus) 为红水河特有鱼类，分布区域狭窄，野生资源匮乏。为实现多线盘鮈苗种的规模化生产，为其人工增殖放流提供技术支撑，对人工驯养的多线盘鮈亲鱼进行强化培育和催产，通过干法授精获得受精卵，并观察其胚胎发育过程。研究显示，多线盘鮈绝对繁殖力为 (415.53±133.27) 粒、相对繁殖力为 (24.24±5.64) 粒·g−1。共进行3次人工繁殖，平均催产率为 (93.12±1.73)%、受精率为 (67.03±3.62)%、孵化率为 (61.34±2.13)%。多线盘鮈受精卵为沉性卵，无黏性，呈淡青色或浅黄色，成熟卵子直径为 (2.11±0.04) mm，吸水膨胀后呈白色，卵膜径达 (3.37±0.09) mm。水温22~24 ℃下，经67~91 h孵化出膜，孵化积温为1 728.17 h·℃，历经胚盘期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和孵化期共7个发育阶段、26个时期。初孵仔鱼全长为 (6.25±0.17) mm，肌节26对。
Abstract:Discogobio multilineatus is a species endemic to the Hongshui River, with a narrow distribution range and scarce wild resources. In order to achieve the mass production of its larvae and provide technical support for its enhancement and release, the artificially bred D. multilineatus was intensively cultured and artificially induced to spawn. The fertilized eggs were obtained through dry fertilization, and the embryonic development process was observed. The results show that the absolute fecundity of D. multilineatus was (415.53±133.27) grains, and the relative fecundity was (18.70±4.67) grains·g−1. A total of three times of artificial breeding were conducted, with average spawning rate of (93.12±1.73)%, fertilization rate of (67.03±3.62)%, and hatching rate of (61.34±2.13)%. The fertilized eggs of D. multilineatus were demersal, non-adhesive, in light blue or pale yellow color, with an eggshell diameter of (2.11±0.04) mm. After absorbing water and swelling, they turned white, with an egg membrane diameter of (3.37±0.09) mm. At water temperatures of 22−24 ℃, the eggs hatched and eclosed after 67−91 h, with a total hatching and eclosion energy of 1 728.17 ℃·h. The embryonic development went through seven stages and 26 periods, including the blastula stage, cleavage stage, blastocyst stage, gastrula stage, neural plate stage, organogenesis stage, and hatching stage. The newly hatched larvae had a total length of (6.25±0.17) mm and 26 myotomes.
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华贵栉孔扇贝(Chalmys nobilis)具有生长快、产量高、养殖周期短等特点，是中国华南沿海地区主要的海水养殖贝种之一，具有重要的经济价值。闭壳肌是华贵栉孔扇贝主要的食用部分。目前对扇贝闭壳肌的研究较少，主要有闭壳肌与其他性状的相关性研究，如墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)体质量和壳长与闭壳肌质量紧密相关[1]；华贵栉孔扇贝软体部质量对闭壳肌质量的直接影响最大，其次是壳宽[2]；影响虾夷扇贝(C. farreri)闭壳肌质量的主要因素是壳宽[3]；另外闭壳肌颜色和蛋白分布也有涉及[4-5]。但很少见到闭壳肌生长和发育的相关研究。
肌肉生长抑制素myostatin (MSTN)是转化生长因子-β (transforming growth factor-beta)超家族的成员，在动物肌肉生长和发育过程中起负调控作用[6]。Myostatin蛋白包括1个分泌信号序列、蛋白水解处理位点、含有9个半胱氨酸残基的保守型羧基末端区[7-8]。Myostatin的前体蛋白由信号序列、N-末端前肽区域和1个活性配基的C-末端区域组成[7-8]。前体蛋白经过2次蛋白质水解切割后，Myostatin即可活化[8-9]。成熟的Myostatin蛋白是一个C-末端由二硫键连接的二聚体，与MSTN基因受体结合，从而发挥其生物活性[8-9]。
目前在海湾扇贝(A. irradians)、栉孔扇贝 (C. farreri)、华贵栉孔扇贝、贻贝(Mytilus chilensis)、小狮爪海扇蛤(Nodipecten subnodosus)和竹蛏(Sinonovacula constricta)等贝类中有myostatin基因的研究报道[10-16]。Morelos等[14]研究1龄小狮爪海扇蛤一年中myostatin在闭壳肌中的表达情况、闭壳肌质量和肌纤维数量和大小，证实myostatin表达和闭壳肌性状有关联。在一些贝类中发现MSTN有与生长性状相关联的SNP位点[15,17-18]。Hu等[11]预测了栉孔扇贝MSTN启动子中有MEF2、COMP、MTBF、E-box等调控元件。
笔者已获得了华贵栉孔扇贝MSTN启动子序列[16]。本研究拟对启动子序列进行生物信息学分析。通过构建不同缺失长度的报告基因系统，检测启动子的转录活性，为今后进一步研究MSTN基因的调控机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
华贵栉孔扇贝采购于广东深圳南澳，剪取其闭壳肌组织，液氮冷冻后放置于– 80 ℃冰箱保存。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA提取
用海洋动物DNA提取试剂盒(天根)提取DNA，终质量浓度为50 ng·mL–1，– 20 ℃保存备用。
1.2.2 myostatin启动子的生物信息学分析
笔者已获得myostatin基因启动子序列[16]。用在线软件BDGP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测核心启动子区域和转录起始位点(transcription start site，TSS)。用MatInspector软件预测潜在的转录因子结合位点。用MethPrimer软件(http://www.urogene.org/methprimer2/)预测CpG岛。
1.2.3 不同长度片段表达载体构建
根据潜在的转录因子结合位点分析结果，设计6个正向引物和1个反向引物。上、下游引物分别添加KpnⅠ和HindⅢ酶切位点和保护碱基(表1)。以PGL-22为正向引物，P1322A为反向引物，扩增出最长的启动子片段，胶回收后，连接到pMD18-T载体，转化到DH5α大肠杆菌中，挑单克隆菌送上海生工生物工程有限公司测序。测序正确后，用质粒提取试剂盒(生工)提取质粒，以质粒DNA为模板，分别以PGL-102、PGL-274、PGL-534、PGL-995和PGL-1143为正向引物，P1322A为反向引物，通过PCR扩增不同片段长度的MSTN基因启动子片段，随后连接转化，测序验证序列正确后提取质粒。
表 1 实验所用引物Table 1. Primers used in this experiment引物
primer序列 (5'−3')
sequencePGL-22 CGGggtaccACACGGCGAAAAAATGGAGC PGL-102 CGGggtaccGGATGCCATAAATCAAAACCACAAC PGL-274 CGGggtaccAAAACGCCGCCAAACG PGL-534 CGGggtaccACTTCAGGCTGTATCGCAAAT PGL-995 CGGggtaccACCCGTTGGCAGCGTTCA PGL-1143 CGGggtaccTCTAAATGCTAACCCTTGTGCTG P1322A CTAaagcttTATAGCGGTTACGTTACAGATGGTT 注：小写字体为酶切位点 Note: Lowercase letters represent restriction enzyme loci. 用KpnⅠ和HindⅢ2种内切酶同时在37 ℃水浴酶切含有不同长度片段的pMD18-T重组质粒和pGL3-basic质粒，分别纯化后，用Solution I连接酶(TaKaRa) 16 ℃连接过夜，转化到DH5α大肠杆菌中，用去内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA)提取重组质粒，测序以验证序列是否正确。
1.2.4 细胞培养
在24孔培养板中接种HEK293T细胞，使转染时细胞密度在70%~80%。所用培养基为DMEM高糖培养基(Hyclone)，加入10% FBS (Gibco)。细胞放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养约20 h。
1.2.5 瞬时转染
内参质粒为pRL-TK (Promega)，分别将各pGL3-basic重组质粒和内参质粒以20∶1的比例共转染到细胞。转染对照组为pGL3-basic载体和pRL-TK载体。每组做5个平行。瞬时转染采用转染试剂盒Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen)，根据试剂盒的说明进行实验。
1.2.6 双荧光素酶活性检测
用萤光素酶检测试剂盒Dual-Luciferase®Reporter Assay System(Promega)分析报告基因Luciferase活性。转染24 h后，吸去旧的培养基，加入1×PBS清洗1~2次，吸出PBS后，每孔中加入细胞裂解液PLB (passive lysis buffer，Promega) 200 μL，室温孵育10 min；将裂解液10 000 r·min–1离心5 min，取上清作为待测液；取100 μL裂解液上清加入96孔发光板中，加入100 μL萤火虫荧光素酶检测工作液(碧云天)，吹吸混匀；上机测发光值，积分时间5 s；加入海肾荧光素酶检测工作液(碧云天) 100 μL，吹吸混匀，用化学发光分析仪BK-L96C (中生北控)监测发光值。用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析检测各样品间差异的显著性。
2. 结果
2.1 华贵栉孔扇贝MSTN基因启动子的生物信息学分析
华贵栉孔扇贝MSTN基因5'调控区序列长1 358 bp (GenBank登录号：KY888888)。BDGP预测有4个TSS，分别为位于ATG上游第70个碱基“A”，第233个碱基“G”，第1 059个碱基“A”和第1 299个碱基“T”(图1)。核心启动子区在–100~–51 bp。MatInspector在线软件分析潜在的转录因子结合位点包括MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD等，存在1个TATA-box (位于–92~–86bp)和2个E-box顺式作用元件 (图1)。MethPrimer软件预测无CpG岛。
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图 1 MSTN启动子序列分析下划直线表示转录因子结合位点，下划波浪线为顺式作用元件，斜体表示核心启动子区域，阴影部分表示转录起始位点Figure 1. Analysis of MSTN gene promoter sequenceThe potential transcription factor binding sites are straightly underlined. The cis-regulatory elements are wavily underlined. Core promoter region is in italic. Nucletide of each transcription start sites are in shadow.2.2 MSTN基因启动子不同长度片段的扩增和表达载体构建
6个正向引物(PGL-22、PGL-102、PGL-274、PGL-534、PGL-995和PGL-1143)和1个下游引物(P1322A)分别扩增出6个长度不同的启动子片段，长度依次为1 301 bp、1 221 bp、1 049 bp、789 bp、328 bp和180 bp (图2)。构建的pGL3-basic重组质粒名字与正向引物名字一一对应，即PGL-22、PGL-102、PGL-274、PGL-534、PGL-995和PGL-1143，经测序确定序列正确。
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图 2 MSTN基因启动子不同长度片段的扩增电泳图电泳顺序：PGL-22、PGL-102、PGL-274、PGL-534、PGL-995、PGL-1143、DL2 000Figure 2. Electrophoretograms of MSTN gene promoter with different lengthsElectrophoresis order: PGL-22, PGL-102, PGL-274, PGL-534, PGL-995, PGL-1143, DL2 0002.3 MSTN启动子活性分析
将构建的6个不同长度缺失片段pGL3-basic重组质粒分别与pRL-TK质粒共转染到HEK293T细胞。pGL3-basic空载体作为阴性对照。荧光素酶活性检测结果见图3，6个启动子片段的pGL3-basic重组载体与阴性对照pGL-basic空载体相比，荧光强度均有显著性差异(P<0.05)。除PGL-22和PGL-274外，其他启动子片段的荧光强度彼此间均有显著性差异(P<0.05)。PGL-534的转录活性最高，其次为PGL-274、PGL-22和PGL-102，最低为PGL-995。
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图 3 MSTN启动子不同长度片段的相对活性相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P<0.05)Figure 3. Relative luciferase activity of MSTN gene with different lengthsThe same letters indicate no significant difference, while different letters indicate significant difference (P<0.05).3. 讨论
启动子是基因的“开关”，决定着基因的活动。通过生物信息学预测启动子上的顺式作用元件和反式作用因子，是研究启动子结构和功能的基础。
本研究对华贵栉孔扇贝MSTN启动子序列进行生物信息学分析，结果显示核心启动子区为–100~–51 bp。华贵栉孔扇贝MSTN启动子包含4个TSS，分别位于起始密码ATG上游的第70、第233、第1 059和第1 299个碱基。栉孔扇贝和人的MSTN启动子有3个TSS[11,19]，但在牛中只有1个[20]。TATA-box是真核生物启动子中重要组成部分，在猪[21]、大黄鱼 (Larimichthys crocea)[22]、栉孔扇贝[11]和华贵栉孔扇贝MSTN启动子中均发现有1个TATA-box，金头鲷 (Sparus aurata) MSTN启动子有2个TATA-box[23]。在大黄鱼和金头鲷MSTN启动子中，还检测到CAAT-box，但在扇贝中均未发现。E-box (核心序列为5'-CANNTG-3')在以上物种MSTN启动子中均检测到，说明E-box在不同物种MSTN启动子区域具有保守性。E-box突变会降低启动子活性[24]。E-box能被生肌调控家族因子(myogenic regular factor，MRFs)中的碱基螺旋-环-螺旋(bHLH)结构特异性识别，从而调控MSTN的转录[25]。
华贵栉孔扇贝MSTN启动子中存在的转录因子结合位点有MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD。在其他物种中也发现有一样的转录因子结合位点，如在栉孔扇贝中发现MEF2和MTBF[11]，在金头鲷中发现MEF2[23]，在猪中发现MEF2和MyoD[21]，在牛中发现MEF2、MyoD和FoxO1[26]。均为肌肉特异性相关的转录因子结合位点，参与MSTN基因的转录和表达[27-28]。MEF2广泛存在于肌肉细胞中，可与许多肌肉特异性基因的启动子结合[29]。MEF2有MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D等4种亚型。
CpG岛主要存在于启动子或第一外显子中，在基因表达调控中起负调控作用。本研究未发现华贵栉孔扇贝MSTN启动子存在CpG岛，这与栉孔扇贝MSTN启动子的分析结果相同。
报告基因是检测启动子活性的常用方法。本研究构建了6个不同缺失片段的启动子报告基因，发现它们都有转录活性。这些报告基因均包含核心启动子区域，说明预测的核心启动子区域结果可靠。6个不同缺失片段启动子的转录活性与启动子长度无关。如PGL-534的活性最高，但该序列并不是最长。这说明MSTN启动子序列中有的序列是促进该基因表达的调控元件，有的则是抑制该基因表达的调控元件。这些表达元件在一起产生作用，产生不同的转录活性。如PGL-1143转录活性比PGL-995的强，说明–216~–364 bp区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点；PGL-995的转录活性远低于PGL-534，说明–364~–825 bp区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点。这些推论还需要进一步研究证实。
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图 1 多线盘鮈胚胎发育
注：a. 受精卵；b. 胚盘期；c. 2细胞期；d. 4细胞期；e. 8细胞期；f. 16细胞期；g. 32细胞期；h. 多细胞期；i. 囊胚早期； j. 囊胚中期；k. 囊胚晚期；l. 原肠早期；m. 原肠中期；n. 原肠晚期；o. 神经胚期；p. 胚孔封闭期；q. 肌节出现期；r. 眼囊期；s. 尾芽期；t. 眼晶体形成期；u. 耳石出现期；v. 尾鳍出现；w. 肌肉效应期；x. 心脏搏动期；y. 出膜前期；z. 破膜期；aa. 初孵仔鱼。标尺=1 mm。
Figure 1. Embryonic development of D. multilineatus
Note: a. Fertilized egg; b. Blastodem stage; c. 2-cell stage; d. 4-cell stage; e. 8-cell stage; f. 16-cell stage; g. 32-cell stage; h. Multicellular stage; i. Early-blastula stage; j. Mid-blastula stage; k. Late-blastula stage; l. Early-gastrula stage; m. Mid-gastrula stage; n. Late-gastrula stage; o. Neural stage; p. Closure of blastopore stage; q. Appearance of myomere; r. Eye vesicle formation period; s. Tail bud stage; t. Crystal stage of eyes; u. Appearance of statolith; v. Rudiment of tail fin; w. Muscular contraction period; x. Heart beating period; y. Pro-hatching stage; z. Embryo hatching; aa. Newly hatched larvae. Bar=1 mm.
表 1 多线盘鮈人工繁殖情况
Table 1 Artificial propagation of D. multilineatus
繁殖参数
Reproductive parameter时间 Time 2024-04-15 2024-04-22 2024-04-25 雌雄亲鱼数量比
Male-to-female parental ratio15∶13 19∶18 23∶20 催产率
Oxytocic rate/%93.33 94.74 91.30 产卵量
Spawning capacity/104粒0.57 0.82 1.07 受精率
Fertilization rate/%67.50 63.20 70.40 孵化率
Hatchability/%59.04 63.25 61.73 出苗量
Seedling output/104尾0.23 0.33 0.46 绝对繁殖力
Absolute fecundity/粒415.53±133.27 相对繁殖力
Relative fertility/(粒·g−1)24.24±5.64 
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表 2 多线盘鮈胚胎发育时序
Table 2 Time sequence of embryonic development of D. multilineatus
发育时期
Developmental period受精后时间
Time after fertilization持续时间
Duration积温
Accumulative temperature/(h·℃)图序
Plate受精卵Fertilized egg 0 1 h 13 min 28.96 1-a 胚盘形成期Blastodem stage 1 h 13 min 37 min 14.68 1-b 2细胞期2-cell stage 1 h 50 min 35 min 13.88 1-c 4细胞期4-cell stage 2 h 25 min 23 min 9.12 1-d 8细胞期8-cell stage 2 h 48 min 18 min 7.14 1-e 16细胞期16-cell stage 3 h 6 min 17 min 6.69 1-f 32细胞期32-cell stage 3 h 23 min 1 h 14 min 29.11 1-g 多细胞期Multicellular stage 4 h 37 min 2 h 28 min 57.97 1-h 囊胚早期Early-blastula stage 7 h 5 min 1 h 1 min 23.79 1-i 囊胚中期Mid-blastula stage 8 h 6 min 1 h 5 min 25.13 1-j 囊胚晚期Late-blastula stage 9 h 11 min 4 h 4 min 95.53 1-k 原肠早期Early-gastrula stage 13 h 15 min 3 h 53 min 88.54 1-l 原肠中期Mid-gastrula stage 17 h 8 min 2 h 56 min 67.47 1-m 原肠晚期Late-gastrula stage 20 h 4 min 1 h 25 min 32.87 1-n 神经胚期Neural stage 21 h 29 min 57 min 22.42 1-o 胚孔封闭期Closure of blastopore stage 22 h 26 min 1 h 40 min 39.67 1-p 肌节出现期Appearance of myomere 24 h 6 min 2 h 21 min 55.93 1-q 眼囊期Eye vesicle formation period 26 h 27 min 2 h 53 min 68.62 1-r 尾芽期Tail bud stage 29 h 20 min 3 h 12 min 75.52 1-s 眼晶体形成期Crystal stage of eyes 32 h 32 min 2 h 24 min 56.16 1-t 耳石形成期Appearance of statolith 34 h 56 min 1 h 49 min 42.15 1-u 尾鳍出现Rudiment of tail fin 36 h 45 min 7 h 33 min 172.14 1-v 肌肉效应期Muscular contraction period 44 h 18 min 3 h 40 min 83.33 1-w 心跳期Heart beating period 47 h 58 min 17 h 20 min 405.60 1-x 出膜前期Pro-hatching stage 65 h 18 min 8 h 8 min 188.69 1-y 破膜期Embryo hatching 73 h 26 min 43 min 17.06 1-z 初孵仔鱼Newly hatched larvae 74 h 9 min 1-aa
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1. 赵德风，陈然，肖国强，滕爽爽. 泥蚶转录因子c-Myc与下游ATP结合盒转运蛋白基因ABCA3启动子的结合鉴定. 浙江农业科学. 2023(06): 1317-1322 . 
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