Automatic counting of shrimp larvae based on probability density map model generated from front end and back end
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摘要:
虾苗计数是虾类养殖与销售中生物量估算的基本操作，对养殖管理和提高产量至关重要。由于受虾苗体型小、遮挡严重以及密集程度不一等因素影响，现有的自动计数方法难以在一定密度下准确计数。基于此，提出了一种基于贝叶斯概率分布的前后端结合计数网络 (Shrimp counting, SC) 模型，用于解决虾苗计数问题。该模型主要由前端模块、注意力模块和后端模块构成。首先，使用前端模块提取具有判别性的表型特征，并采用注意力模块对特征进行重组，以提升对图像的局部注意力；随后，使用后端模块生成虾苗分布预测概率密度图；最后，通过贝叶斯损失函数对模型进行参数调整，以提升虾苗计数的精确度。为了验证方法的有效性，构建了一个包含2种不同密度的虾苗计数数据集，并在该数据集上进行了多组实验对比。结果显示，总体准确率可达93.325%，平均绝对误差和均方误差分别为96.304和154.567。与现有主流的计数方法 [布莱克-利特曼模型 (Black-Litterman, BL)、人群密度估计网络 (Contextual Scene Recognition Network, CSR-Net)、多维注意力增强人群计数模型 (Boosting Crowd Counting via Multifaceted Attention, BCCMA)] 相比，SC模型准确率最高、误差最小。该模型适用于孵化场、销售和养殖入塘等多场景的虾苗自动计数。
Abstract:Shrimp larval counting is a fundamental operation for biomass estimation in shrimp farming and sales, and it is crucial for aquaculture management and yield enhancement. Due to the factors such as small size of shrimp larvae, significant occlusion, and varying density, the current automated counting methods are difficult to achieve accurate larval counting at certain densities. To address this issue, we propose a shrimp counting (SC) model for shrimp larval counting which combined frontend and backend counting network based on Bayesian probability distribution. This model primarily consists of a frontend module, an attention module and a backend module. The frontend module first extracts discriminative phenotypic features, while the attention module reorganizes these features to enhance local attention to the images. Secondly, the backend module generates a predicted probability density map for shrimp larval distribution. Thirdly, the Bayesian loss function is utilized to adjust the model parameters and improve the accuracy of shrimp larval counting. To validate the effectiveness of the proposed method, we constructed a shrimp larval counting dataset with two different density conditions and conducted multiple experimental comparisons on the dataset. The overall accuracy reached 93.325%, with mean absolute error and mean squared error being 96.304 and 154.567, respectively. Compared with the current mainstream counting methods [Black-Litterman (BL), Contextual Scene Recognition Network CSR-Net), Boosting Crowd Counting via Multifaceted Attention BCCMA], the proposed model exhibits the highest accuracy and the lowest loss. It applies to automated shrimp larval counting in hatcheries, sales and stocking scenarios.
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坛紫菜 (Pyropia haitanensis) 是红藻类海洋植物，是中国特有的暖温带紫菜栽培品种，也是目前国内主要的养殖紫菜品种，年产量约占全国紫菜总产量的75%[1]，主要分布在福建、浙江和广东东部沿海一带[2]。据记载，紫菜不仅有治疗“病瘿瘤香港脚者”及清热利咽等功效[3]，而且是一种富含蛋白质、糖类化合物及人体必需微量元素等味美可口的食材[4-5]，现已成为国内海藻研究的热点之一。
近年来，国内已有对坛紫菜多种营养成分的基础分析[6-10]，及其多糖、藻红蛋白等生理活性物质抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等功能的活性研究[11-16]，但多集中在少数几种营养成分上，尚未见有全国范围内全面、系统的营养分析报道。2017年发生的“塑料紫菜风波”事件[17-18]，更是反映出消费者对坛紫菜缺乏认知，对国内紫菜行业和产业造成巨大冲击。因此，本实验采集了来自广东、福建、浙江三省6个产地的头水坛紫菜，较为全面、系统地分析比较了不同产地坛紫菜的营养差异状况，以期了解国内各地坛紫菜的营养分布优势，为坛紫菜产业发展、产品分级提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
头水坛紫菜干品购自汕头市佳盛副食品有限公司，来源为广东的南澳和莱芜，福建的东山、漳浦和霞浦以及浙江的温州6个养殖海域，干样品常温遮光密封保存。
1.2 仪器与设备
KjeltecTM2300蛋白自动分析仪 (丹麦FOSS公司)；SoxtecTM脂肪自动分析仪 (丹麦FOSS公司)；Agilent 7900电感耦合等离子体质谱仪 (美国Agilent公司)；Waters UPLC超高效液相色谱仪 (美国Waters公司)；S-433D氨基酸自动分析仪 (德国SYKAM公司)；Milli-Q超纯水制备系统 (美国Millipore公司)。
1.3 基本营养成分的测定方法
坛紫菜中水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白含量的测定参照刘欢等[19]，游离氨基酸的测定参照杨贤庆等[20]，色氨酸的测定参照叶蕾等[21]；矿物元素的测定参照李梁等[22]。
1.4 氨基酸营养评价方法
根据FAO/WHO提供的理想蛋白质中必需氨基酸含量的模式及评分标准[23]和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所提出的鸡蛋蛋白质模式[24]，分别计算坛紫菜的氨基酸评分 (amino acid score，AAS)[25]、化学评分 (chemical sore，CS)[25]和必需氨基酸指数 (essential amino acid index，EAAI)[26]。计算公式为：
$$ \mathrm{AAS}=\frac{P}{A} $$ $$ \mathrm{CS}=\frac{P}{S} $$ $$ {\rm{EAAI}}=\sqrt[n]{\frac{P_{\rm T h r} \times P_{\rm V a l} \times \cdots \times P_{\rm M e t}}{S_{\rm T h r} \times S_{\rm V a l} \times \cdots \times S_{\rm M e t}}} \times 100 $$ 式中P为样品中某必需氨基酸(N)质量分数 (mg∙g–1)；A为FAO/WHO标准模式中对应的必需氨基酸(N)质量分数 (mg∙g–1)；S为鸡蛋蛋白质中对应的必需氨基酸(N)质量分数 (mg∙g–1)；n为参与比较的必需氨基酸个数。
1.5 数据处理方法
采用IBM SPSS Statistics 24.0软件进行差异显著性分析 (P<0.05)。
2. 结果与分析
2.1 水分
6个产地的坛紫菜水分质量分数比较显示 (图1-a)，坛紫菜水分质量分数为9.68%~12.31%，由低到高依次为东山<漳浦<温州<霞浦<南澳<莱芜；产地间存在显著差异 (P<0.05)；其中广东南澳和莱芜两地与其他四地之间的差异尤为显著，究其原因，与紫菜干制方法有关。南澳和莱芜惯用传统日晒方式干制坛紫菜，而福建和浙江已普遍使用机械采收和机器干燥。
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图 1 不同产地坛紫菜水分、灰分、蛋白质质量分数柱上不同字母表示差异显著(P<0.05)Figure 1. Moisture, ash and protein contents of P. haitanensis in different breeding areasDifferent letters on the column indicate significant difference (P<0.05).2.2 灰分
6个产地的坛紫菜灰分质量分数 (干基，下同) 为 7.85%~9.55% (图1-b)，含量较高，由低到高依次为东山<漳浦<莱芜<南澳<温州<霞浦，表明坛紫菜中矿物质含量丰富。根据产地间差异显著性分析结果 (P<0.05)，将6个产地分为3组：位于最北部的温州和霞浦为第一组，灰分含量最高；位于最南端的莱芜和南澳为第二组，灰分含量次之；东山和漳浦为第三组，灰分含量最低。
2.3 粗脂肪
6个产地的坛紫菜粗脂肪质量分数均不足0.5%，说明坛紫菜中脂肪含量非常低。
2.4 蛋白质
6个产地的坛紫菜中蛋白质质量分数为33.40%~36.38% (图1-c)，含量较高，由低到高依次为莱芜<南澳<温州<东山<漳浦<霞浦，产地间存在显著差异 (P<0.05)，根据差异显著性可将6个产地分为3组：漳浦和霞浦为第一组，蛋白质含量最高；温州和东山为第二组，含量次之；南澳和莱芜为第三组，含量最低。
2.5 氨基酸
6个产地的坛紫菜中均含有至少17种氨基酸，其氨基酸总量 (total amino acid，TAA) 为 30.15%~32.41%；17种氨基酸中，谷氨酸含量最高，蛋氨酸最低。6个产地中莱芜坛紫菜的TAA最高，而南澳和温州相同且最低 (表1)。
表 1 不同产地坛紫菜的氨基酸质量分数及组分构成 (干基)Table 1. Amino acid composition and content of P. haitanensis in different breeding areas (dry mass)% 氨基酸
amino acid南澳
Nan'ao莱芜
Laiwu东山
Dongshan漳浦
Zhangpu霞浦
Xiapu温州
Wenzhou谷氨酸 Glu 3.54 3.84 3.70 3.56 3.80 3.54 天冬氨酸 Asp 3.35 3.45 3.18 3.17 3.33 3.08 丙氨酸 Ala 3.25 3.47 3.41 3.39 3.45 3.28 亮氨酸* Leu 2.46 2.59 2.59 2.59 2.52 2.49 缬氨酸* Val 2.05 2.21 2.10 2.10 2.09 2.07 甘氨酸 Gly 2.01 2.23 2.03 2.01 2.08 2.02 赖氨酸* Lys 1.97 2.29 2.08 2.05 2.25 2.11 精氨酸# Arg 1.98 2.26 2.14 2.14 2.08 2.05 苏氨酸* Thr 1.76 1.81 1.73 1.70 1.81 1.75 丝氨酸 Ser 1.72 1.78 1.75 1.71 1.73 1.65 脯氨酸 Pro 1.31 1.43 1.37 1.37 1.38 1.30 苯丙氨酸* Phe 1.29 1.37 1.36 1.36 1.36 1.34 异亮氨酸* Ile 1.23 1.32 1.32 1.30 1.26 1.22 酪氨酸 Tyr 1.04 1.20 1.22 1.25 1.03 1.20 组氨酸# His 0.43 0.48 0.47 0.47 0.46 0.46 色氨酸* Trp 0.41 0.40 0.41 0.33 0.33 0.31 蛋氨酸* Met 0.34 0.27 0.39 0.42 0.20 0.30 氨基酸总量 TAA 30.15 32.41 31.23 30.91 31.15 30.15 必需氨基酸总量 EAA 11.52 12.27 11.98 11.85 11.81 11.59 非必须氨基酸 NEAA 18.63 20.14 19.25 19.06 19.34 18.56 EAA/TAA 38.20 37.86 38.36 38.35 37.91 38.43 EAA/NEAA 61.81 60.92 62.22 62.20 61.07 62.42 注：*. 必需氨基酸；#. 条件性必需氨基酸 Note: *. essential amino acid; #. conditionally essential amino acid 6个产地的坛紫菜中均含8种必需氨基酸 (essential amino acid，EAA)，EAA质量分数为11.52%~12.27%，约占TAA的38%，与非必需氨基酸 (nonessential amino acid，NEAA) 含量比值均略高于60%。根据1973年FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式 (蛋白质的氨基酸组成中EAA/TAA在40%以上、EAA/NEAA在60%以上时蛋白质质量较好[27])，各地坛紫菜的EAA/TAA均接近且低于40%，只有EAA/NEAA满足要求，可见坛紫菜的蛋白质质量略有不足。EAA中，含量最高的是亮氨酸，其次是缬氨酸，最低的是蛋氨酸。6个产地中，单论EAA 含量，南澳最低，莱芜最高；单论EAA/TAA或EAA/NEAA，均为莱芜最低，温州最高。
此外，坛紫菜中还含有幼儿生长必需的条件性必需氨基酸 (组氨酸和精氨酸)，且精氨酸质量分数较高 (1.98%~2.26%)。
各地坛紫菜中，鲜味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸约占TAA 的22%，甜味氨基酸甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸等约占TAA的33%，再加上其他呈味氨基酸蛋氨酸[28]，呈味氨基酸总量约占TAA 的60%，因此坛紫菜具有浓厚的海鲜味，尤其是甜味和鲜味较重，是非常优质的天然调味剂。
2.6 氨基酸营养分析
各产地坛紫菜氨基酸评分 (AAS、CS和EAAI) 结果见表2。总体上不同产地坛紫菜的各种EAA营养评分均偏低，其中AAS最高值为0.45，CS最高值为0.39，两者均远小于1；EAAI最高值仅为24.35，远低于100；说明各产地坛紫菜的氨基酸营养价值偏低，同海带 (Laminaria japonica) 氨基酸营养评分较低这一结论相似[29]。
表 2 不同产地坛紫菜的氨基酸评分Table 2. Amino acid nutrition evaluation of P. haitanensis in different breeding areas评分方法
evaluation method氨基酸
amino acid南澳
Nan'ao莱芜
Laiwu东山
Dongshan漳浦
Zhangpu霞浦
Xiapu温州
Wenzhou参考蛋白
reference protein氨基酸评分 AAS 苏氨酸 0.44 0.45 0.43 0.42 0.45 0.44 250 缬氨酸 0.41 0.45 0.42 0.42 0.42 0.42 310 蛋氨酸+胱氨酸 0.10 0.08 0.11 0.12 0.06 0.09 220 异亮氨酸 0.31 0.33 0.33 0.33 0.32 0.31 250 亮氨酸 0.35 0.37 0.37 0.37 0.36 0.35 440 苯丙氨酸+酪氨酸 0.38 0.42 0.42 0.43 0.39 0.42 380 赖氨酸 0.36 0.42 0.38 0.38 0.41 0.39 340 色氨酸 0.43 0.42 0.43 0.35 0.34 0.33 60 化学评分 CS 苏氨酸 0.38 0.39 0.37 0.36 0.39 0.37 292 缬氨酸 0.31 0.34 0.32 0.32 0.32 0.32 410 蛋氨酸+胱氨酸 0.06 0.04 0.06 0.07 0.03 0.05 386 异亮氨酸 0.23 0.25 0.25 0.25 0.24 0.23 331 亮氨酸 0.29 0.30 0.30 0.30 0.30 0.29 534 苯丙氨酸+酪氨酸 0.26 0.29 0.29 0.29 0.27 0.28 565 赖氨酸 0.28 0.33 0.30 0.29 0.32 0.30 441 色氨酸 0.26 0.25 0.26 0.21 0.21 0.20 99 必需氨基酸指数 EAAI 23.15 23.83 24.35 23.90 21.73 22.48 100 根据AAS与CS结果，各地坛紫菜的EAA中均为苏氨酸最高，蛋氨酸+胱氨酸最低，因此，蛋氨酸+胱氨酸为各产地坛紫菜的第一限制性氨基酸，异亮氨酸为第二限制性氨基酸。
以综合评分EAAI进行产地间比较，发现各地间的坛紫菜氨基酸营养存在一定差异，但差异不大，由高到低依次排序为东山>漳浦>莱芜>南澳>温州>霞浦。可见，东山坛紫菜的AAS最高，其次是漳浦，而霞浦最低。
2.7 矿物质
6个产地坛紫菜中均含有丰富的矿物质元素，其中常量元素含量最高的是钾 (K)，其次是镁 (Mg)、钠 (Na)和钙 (Ca)；人体必需的微量元素中铁 (Fe) 含量最高，其次是锰 (Mn)、锌 (Zn)、铜 (Cu)、硒 (Se)、钴 (Co)和钒 (V)。各产地间矿物元素的含量差异显著，其中霞浦坛紫菜中K、Ca、Fe、Zn、Cu、Co和V含量最高，南澳坛紫菜中Na和Se含量最高，东山坛紫菜中Mg含量最高，而温州坛紫菜中Mn含量最高 (表3)。
表 3 不同产地坛紫菜矿物质质量分数与构成 (干基)Table 3. Mineral contents of P. haitanensis in different breeding areas (dry mass)mg·kg−1 元素
element南澳
Nan'ao莱芜
Laiwu东山
Dongshan漳浦
Zhangpu霞浦
Xiapu温州
Wenzhou钾 K 22 836.06 23 371.44 17 768.95 15 648.44 25 056.75 24 347.34 镁 Mg 3 182.88 3 097.42 4 581.31 3 310.81 3 426.49 2 982.32 钠 Na 3 115.14 2 134.81 2 317.44 1 851.27 1 375.03 2 323.08 钙 Ca 125.23 273.33 384.53 313.99 986.30 642.37 铁 Fe 91.57 175.14 220.09 142.03 249.22 183.00 锰 Mn 27.21 35.82 39.21 27.67 61.05 61.60 锌 Zn 8.51 12.77 33.68 47.59 49.62 26.39 铜 Cu 4.88 5.67 6.67 3.26 11.99 9.32 硒 Se 1.64 1.33 0.21 0.22 0.65 0.89 钴 Co 0.17 0.17 0.25 0.18 0.27 0.12 钒 V 0.14 0.22 0.35 0.25 0.54 0.41 矿物质元素在人体中发挥着重要的生理作用。K、Ca、P、Mg等常量元素是构成人体组织的重要成分，也对维持人体体液酸碱平衡具有至关重要的作用。必需微量元素对人体生长、发育和健康具有重要作用，其能构成激素、酶和维生素等组分，能参与营养代谢等重要生理功能，如Fe可参与体内氧的转运，维持机体正常造血功能；Cu可参与体内造血过程，催化血红蛋白合成，也是多种酶的组成成分，缺Cu会导致贫血、运动障碍和神经失常等疾病；Zn可促进儿童生长和智力发育，参与组织再生，调节人体免疫功能，缺Zn会导致免疫力下降、生长停滞、皮肤干燥等[30]。
根据Ruperez[31]的报道，海藻中Na/K低于1.5不易引起高血压。6个产地的坛紫菜Na/K均远低于1，可见，从营养学角度上来看，摄入坛紫菜有助于改善人体的Na、K平衡，预防高血压和心血管疾病。
根据 Hill和Matron提出的“理化性质相似的元素，其生物学功能相互拮抗”的理论[32-33]，Fe、Mn、Cu、Zn均为第四周期元素，元素之间的拮抗作用通常发生在 Zn/Cu>10及 Zn/Fe>1时。6个产地的坛紫菜中，除漳浦的Zn/Cu大于10 (14.58) 外，其余5个产地均小于10；且6个产地坛紫菜的Zn/Fe均小于1。可见，除漳浦坛紫菜Zn/Cu不理想之外，其余坛紫菜的Zn/Cu和Zn/Fe均为理想。
3. 结论
综上所述，6个产地的坛紫菜营养成分差异显著，产地不同，营养各有优势。坛紫菜水分含量的差异主要由干制方法不同造成，晒干紫菜的水分含量显著高于烘干紫菜。福建、浙江的紫菜采收机械化程度较高，因此其紫菜水分含量显著高于采用传统日晒方式的广东地区。霞浦坛紫菜的灰分、蛋白质以及K、Ca、Fe、Zn、Cu、Co、V矿物元素的含量均高于其他5个产地。莱芜坛紫菜的TAA和EAA含量高于其他5个产地；但温州坛紫菜的EAA/TAA高于其他5个产地；而东山坛紫菜的EAAI最高。
总体而言，坛紫菜是一种高蛋白、低脂肪、富含矿物质的海洋食材，经常食用可以补充人体需要的多种矿物质，还可改善人体的Na、K平衡。坛紫菜中EAA含量较高，且含有丰富的婴幼儿生长发育必需的精氨酸，但其氨基酸组分构成不理想，EAA营养评分较低，说明坛紫菜并非优质蛋白源。蛋氨酸+胱氨酸是坛紫菜的第一限制性氨基酸，异亮氨酸为第二限制性氨基酸，因此在饮食中应搭配含蛋氨酸、胱氨酸等含硫氨基酸高的其他食物进行营养均衡。
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图 2 虾苗关键点标注
注：左图为低密度图像及其部分标注；右图为高密度图像及其部分标注；黄色为虾头关键标注点。
Figure 2. Key points of shrimp larval image
Note: The left image shows a low-density image and its partial labels, while the right image shows a high-density image and its partial lables; shrimp head key labelled points are in yellow.
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图 10 主干网络后端深度的误差分析
Figure 10. Analysis of error between cost in backbone and backend depth
表 1 主流计数模型性能对比
Table 1 Comparison of different generic counting methods
模型
Model平均绝对误差
MAE均方误差
MSE准确率
Accuracy/%CPU计算时间
CPU compute time/sGPU计算时间
GPU compute time/s布莱克-利特曼模型Black-Litterman (BL) model 120.094 191.939 91.067 24 1.2 人群密度估计网络 CSR-Net 113.822 180.023 91.020 28 1.3 多维注意力增强人群计数模型BCCMA model 128.863 200.330 92.418 30 1.4 本研究的SC模型 Shrimp counting model in this paper 96.304 154.567 93.325 22 1.2 
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表 2 高密度数据下计数性能对比
Table 2 Comparison of counting performance with different generic methods on high density data
模型
Model平均绝对误差
MAE均方误差
MSE准确率
Accuracy/%布莱克-利特曼模型Black-Litterman (BL) model 221.289 270.547 88.147 人群密度估计网络 CSR-Net 205.189 252.938 88.938 多维注意力增强人群计数模型BCCMA model 252.591 283.246 86.460 本研究的SC模型 Shrimp counting model in this paper 181.352 218.123 90.278
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表 3 低密度数据下计数性能对比
Table 3 Comparison of counting performance with different generic methods on low density data
模型
Model平均绝对误差
MAE均方误差
MSE准确率
Accuracy/%布莱克-利特曼模型Black-Litterman (BL) model 18.899 22.037 93.987 人群密度估计卷积神经网络 CSR-Net 22.454 28.960 93.101 多维注意力增强人群计数模型BCCMA model 5.136 6.013 98.377 本研究的SC模型 Shrimp counting model in this paper 11.256 14.292 96.373
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表 4 注意力模块与损失函数消融实验对比
Table 4 Comparison of CBAM attention module and loss function ablation experiments
模型
Model卷积注意力模块
CBAM损失函数
Loss平均绝对误差
MAE均方误差
MSE准确率
Accuracy/%SC模型 − 均方误差损失函数 195.000 242.589 88.581 SC模型 + 均方误差损失函数 117.958 206.373 91.490 SC模型 − 贝叶斯损失函数 115.240 168.125 90.685 SC模型 + 贝叶斯损失函数 96.304 154.567 93.325 注：“+”表示采用CBAM模块；“−”表示不采用CBAM模块。 Note: "+" represents that the CBAM module is used, while "–" represents that the CBAM module is not used.
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表 5 不同主干网络与后端深度的消融实验对比
Table 5 Comparison of ablation experiments on backbone networks and backend depth
主干网络
Backbone network后端深度
Backend depth平均绝对误差
MAE均方误差
MSE准确率
Accuracy/%VGG-16 5 163.865 199.741 74.826 VGG-16 6 127.403 162.328 89.183 VGG-16 7 130.973 165.662 83.471 VGG-19 5 124.630 188.150 90.942 VGG-19 6 96.304 154.567 93.325 VGG-19 7 119.900 178.442 88.581
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