Establishment and application of qPCR and RAA-LFD based on recA gene for detection of Pseudomonas anguilliseptica
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摘要:
为实现鳗败血假单胞菌 (Pseudomonas anguilliseptica, PA) 早期感染的快速诊断，基于recA基因建立了2种检测方法：SYBR Green I实时荧光定量PCR (SYBR Green I real-time quantitative PCR) 和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条 (Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick, RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标，设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针，并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA，以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 组织样本检测，并测定PA载量。结果表明，建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×102 拷贝·μL−1，模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系 (r2=0.999 2)，且具有较强的特异性和较高的稳定性；RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×104 拷贝·μL−1，检测时间最快可达15 min，显色较为稳定且特异性强。应用结果显示，qPCR和RAA-LFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%，较普通PCR方法明显提高；其中，qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量，肾中的载量最高，达3.533×107 拷贝·ng−1。建立的2种方法特异性均较好，其中qPCR方法灵敏性更高，RAA-LFD方法则时效性更强，均可用于PA早期感染的检测，且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。
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关键词:
- 鳗败血假单胞菌 /
- 大口黑鲈 /
- SYBR Green I real-time quantitative PCR /
- RAA-LFD /
- 菌体载量
Abstract:For rapid diagnosis of early infection with Pseudomonas anguilliseptica (PA), we established SYBR Green I real-time quantitative PCR and recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick (RAA-LFD) based on recA gene for rapid and specific detection. A pair of qPCR specific primers, a pair of RAA specific primers and a RAA probe were designed and screened based on the recA gene of PA. The standard quality plasmid pUC18-recA was constructed by homologous recombination to establish the two detection methods. The established methods were applied to detect PA-infected largemouth bass (Micropterus salmoides) tissue samples and PA load was determined. The minimum DNA detection concentration of the qPCR method was 2.816×102 copies·μL−1. There was a good linear relationship between the template amount and Ct value in the standard curve (r2=0.999 2), and the method had strong specificity and stability. The minimum DNA detection concentration of the RAA-LFD method was 2.816×104 copies·μL−1. The detection time of the RAA-LFD method was 15 min, and the color development was relatively stable and the specificity was strong. The application results show that the positive detection rates of qPCR and RAA-LFD were 87.50% and 85.00%, respectively, which were significantly higher than that of the common PCR method. The established qPCR method could accurately measure the bacterial load in the tissues of PA infected hosts. The highest bacterial load was found in the kidney (3.533×107 copies·ng−1). Both methods can be used for rapid detection of early PA infection. The established qPCR can also be used to quantitatively analyze the bacterial load in infected hosts.
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骨骼的形态和结构特征是研究鱼类进化和分类的重要依据，其构造和功能可为鱼类环境学研究提供理论基础。在鱼类胚后发育过程中，其行为、形态及代谢等均不断发生变化，其中以骨骼发育最为复杂。骨骼系统作为鱼类支撑身体、协调运动和保护内脏的重要组织，其形态、构造及发育时序在长期进化过程中均发生着改变[1]。特别是在鱼类早期发育阶段，骨骼发育与其摄食习性、游泳模式、外部形态及生长发育紧密相关，甚至骨骼是否正常发育直接影响鱼类苗种的成活率及畸形率。目前，国内外相关学者已对大泷六线鱼 (Hexagrammos otakii)[2]、金钱鱼 (Scatophagus argus)[3]、卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus)[4]和鞍带石斑鱼 (Epinephelus lanceolatus)[5]等多种海水鱼类的骨骼发育开展了系统研究，表明鱼类因种属差异，其骨骼发育方面存在显著差异。
尖翅燕鱼 (Platax teira) 又称长鳍蝙蝠鱼，属鲈形目、刺尾鱼亚目、白鲳科，原产于印度-太平洋，广泛分布于亚热带和热带沿海地区；其性情温顺，游动缓慢，属于杂食性鱼类，主要食物来源为藻类和小型底栖无脊椎动物[6]。幼鱼体色黑白相间，背鳍、臀鳍和腹鳍较长，形态优美，有较高的观赏价值；而成鱼肌肉蛋白含量高、肉质鲜美、生长较快，具有较高的经济价值[7]。随着人工繁育技术的发展，尖翅燕鱼在中国和东南亚等国成功实现人工养殖，成为深海网箱养殖最具发展潜力的鱼类之一。目前关于尖翅燕鱼的研究相对较少，仅见于消化器官发育[8]、肌肉成分[9]和幼鱼异速生长[7]等方面，而对其发育生物学相关研究尚未深入。本研究采用阿利新蓝-茜素红染色法对尖翅燕鱼仔稚鱼的骨骼进行染色，研究了不同发育阶段鱼体的脊柱及附肢骨骼的系统发生，旨在为硬骨鱼类进化与分类等相关研究提供理论资料。
1. 材料与方法
1.1 亲鱼培育
实验亲鱼选自海南省陵水培育的3龄以上健康无伤、体表完整、活力好的尖翅燕鱼亲鱼。亲鱼经45 d营养强化后，挑选性腺发育成熟的雌鱼和雄鱼各10尾，利用丁香酚 (30~50 mg·L−1) 麻醉后，注射催产针进行人工催产。收集受精卵放入500 L锥形底孵化桶，充分曝气，筛选出漂浮的优质受精卵，放入4 m×4 m 孵化袋中孵化。仔鱼孵化出膜后，解开孵化袋转入室外高位池培育。苗种培育条件：温度 (28±2) ℃、溶解氧质量浓度>6.5 mg·L−1、盐度和pH分别为34‰~36‰和7.8±0.5。饵料投喂策略见图1。
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图 1 尖翅燕鱼培养过程中的饲养方案和日龄与全长回归方程Figure 1. Feeding scheme and regression equation of age and full length during P. teira culture1.2 样品的采集和处理
每天早上在投喂前从高位池随机取仔稚鱼50尾，观察并记录仔稚鱼形态变化和器官发育情况；同时利用丁香酚对仔稚鱼进行麻醉处理，待鱼体完全麻醉后 (仔稚鱼完全沉入烧杯底部) 转入取样瓶，并加入体积分数为10%的中性甲醛溶液4 ℃保存备用。样品采集持续至30日龄 (dah)。
1.3 骨骼染色方法
骨骼染色采用阿尔新蓝-茜素红染色法，在郑攀龙[10]的实验基础上稍做改进，具体染色过程及方法见表1。骨骼染色后的仔稚幼鱼样品根据鱼体大小选用光学显微镜 (Nikon Eclipse E100) 和体视显微镜 (Olympus SZ40) 进行拍照观察。
表 1 阿尔新蓝-茜素红S染色法Table 1. Alcian blue and alizarin red S staining technique染色步骤
Staining step实验过程
Experimental process样本处理
Sample treatment将仔稚鱼麻醉，测量体长和全长，注意不要采集外形畸形的样品，用10%的甲醛溶液浸泡样本，4 ℃条件下浸泡超过24 h，完成样品的固定。 脱水
Dehydration取出固定样品后，用纱布包裹样品，蒸馏水浸泡至少24 h (中间多换几次蒸馏水)，或用自来水流水冲洗过夜，以清除固定剂。再用不同浓度的乙醇梯度脱水，乙醇溶液浓度依次为：50%、75%、90%和100%，脱水时间均为6 h。 软骨染色
Cartilage staining从脱水液中取出的样品，直接浸入软骨染色液 (将无水乙醇和冰醋酸1∶1混合，加入 0.3 g阿利新蓝粉末，配置成1 000 mL溶液) 中，染色24 h，期间可以更换染液。 漂洗
Rinsing在光线较强的环境下进行操作，观察到样品染色好后，从软骨染色液中取出样品放入漂洗液 [将30%的过氧化氢 (H2O2) 和蒸馏水按照1∶5混合配制成1 000 mL溶液，并加入8 g氢氧化钾 (KOH)] 中，不间断用玻璃棒搅拌，直到样品表面颜色变淡。 中和
Neutralize将漂洗好的样品放入染色中和液 [蒸馏水中加入过量硼砂 (Na2B4O7)，得饱和硼砂溶液即可] 中进行中和，时间为20~24 h。 硬骨染色
Bone staining将样品放入硬骨染色液 (1 000 mL蒸馏水中加入8 g 氢氧化钾 (KOH) 完全溶解后，再加入0.3~0.5 g茜素红粉末) 中，每隔12 h取出样品观察染色情况，直至染色完成。 酶解
Zymolysis将样本浸泡在酶溶液 (将1.25 g重金属螯合剂EDTA-Na2和4.5 g胰蛋白酶溶解于1 000 mL饱和硼砂溶液) 中，根据酶解程度调整消化时间，直至稍见骨骼即可，中间最好更换酶解液。 保存
Preservation用蒸馏水清洗样本，然后依次移入体积比为3∶1、1∶1、1∶3的1% KOH-甘油合剂中，最后保存于纯甘油中，并加入3~4 粒麝香草酚保存。 1.4 数据处理与分析
采用Photoshop 2020软件对尖翅燕鱼仔稚鱼发育照片进行处理，使用Image View软件对其形态学指标进行测量；利用SPSS 20.0 软件对数据进行单因素方差分析，以“平均值±标准差 (
$\overline { X}\pm { \rm {SD}} $ )”表示；利用Excel 2020软件对测量数据进行分析，推算出尖翅燕鱼仔稚鱼全长与日龄的关系回归方程 (图1)：y=2.232 6e0.095 4x，R2=0.968 7，式中x为生长天数 (d)，y为全长 (mm) 。2. 结果
2.1 尖翅燕鱼生长阶段划分
尖翅燕鱼受精卵 [(1.29±0.09) mm] 在温度为 (26±0.3) ℃、盐度和pH分别为34‰~36‰和7.8±0.5的条件下孵化，历时27 h 45 min后仔鱼孵化出膜。根据其胚后发育卵黄囊、体色、鳍条、骨骼发育以及其他形态结构的变化，划分为仔鱼期 (0~17 dah)、稚鱼期 (18~29 dah) 和幼鱼期3个时期。仔鱼期和稚鱼期的划分以各鳍条是否形成为依据。尖翅燕鱼30 dah后进入幼鱼期，其鳍棘和鳍条发育完成，骨骼数目稳定，形态与成鱼无异，典型特征为头部、躯干部和尾部各有3条黑色条带，受到外界刺激时体色瞬间变为黑色 (图2)。
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图 2 尖翅燕鱼不同阶段发育的过程注：a. 5 日龄仔鱼；b. 21 日龄稚鱼；c. 30 日龄幼鱼；d. 30 日龄幼鱼-应激后。Figure 2. Different developmental stages of P. teiraNote: a. 5 dah larva; b. 21 dah larva; c. 30 dah larva; d. 30 dah larva-after stress.2.2 脊柱骨骼的发育
2 dah仔鱼的脊柱骨骼处于未分化状态，仅有1条呈管状的脊索 (Nc)，此时身体呈现细长状态 (图3-a)。该阶段，仔鱼仅依靠脊索来支撑身体结构。随着仔鱼的生长，脊索开始发生自然弯曲，头部与躯干部呈一定角度的弯曲。孵化后7 dah左右 (图3-b)，髓弓 (Na)、脉弓 (Ha) 开始出现于表面，临近头部的髓弓和靠近泄殖腔的脉弓优先发育，此时尾下骨的出现也标志着脊柱发育的开始。髓弓最初以突起的形式出现，随着仔鱼的生长，突起逐渐愈合，最后形成椎体背侧方的弓状结构。仔鱼10 dah (图3-c) 时尾杆骨已形成，位于尾部脊索上的脉弓、髓弓开始以软骨组织出现，且髓弓比脉弓出现的时间点早一些。随着鱼类的生长，脉弓和髓弓也随之延伸，仔鱼发育至15 dah时尾杆骨末端开始上翘，此时髓棘 (Ns)、背肋 (Dr) 、腹肋 (Pr) 也开始以软骨组织的形式出现 (图3-d)。稚鱼在23 dah左右时，脊柱前后端开始出现硬骨环，此阶段的稚鱼开始骨化，且髓棘、背肋、腹肋、髓弓、脉弓都以基部向末梢方向开始硬骨化 (图3-e)。30 dah尖翅燕鱼进入幼鱼期，胸鳍、背鳍、腹鳍、臀鳍及各附肢鳍条发育完整，骨骼的发育过程基本完成 (图3-f)。此阶段的幼鱼外表形态与成鱼无异。
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图 3 尖翅燕鱼部分脊柱发育的过程注：a. 2 日龄仔鱼；b. 7 日龄仔鱼；c. 10 日龄仔鱼；d. 15 日龄仔鱼；e. 23 日龄仔鱼；f. 30 日龄稚鱼。Figure 3. Development of partial vertebral column in P. teiraNote: a. 2 dah larvae; b. 7 dah larvae; c. 10 dah larvae; d.15 dah larvae; e. 23 dah larvae; f. 30 dah juvenile.2.3 尾部骨骼的发育
尖翅燕鱼初孵仔鱼 (图4-a) 到6 dah 仔鱼尾部骨骼均未开始发育，此期间尾板未出现且尾杆骨 (Us) 也未上翘。7 dah仔鱼尾杆骨逐渐上翘且第一批尾下骨 (Hy1) 开始出现 (图4-b)。9 dah仔鱼的第二批尾下骨 (Hy2) 开始出现，同时尾下骨也开始分化 (图4-c)。13 dah仔鱼尾杆骨上翘明显，出现未骨化的脊髓；尾下骨 (Hy) 数量开始增多，尾下骨及尾旁骨也明显增大且边界逐渐模糊，尾下骨之间呈现愈合趋势；尾部骨骼被尾索分成上下两部分，由2枚尾上骨 (Ep)、5枚尾下骨和 1 枚尾杆骨组成；尾索上部的鳍皱演变成鳍条软骨，尾鳍 (Cf) 鳍条数量逐渐增加至18条；尾部脊索的矿化还未开始 (图4-d)。尖翅燕鱼发育到18 dah 时，尾部继续增大，出现原始的叉尾，尾杆骨继续上翘；鳍条数量由18增加至22条，鳍条附着于尾旁骨、尾上骨和尾下骨的末端 (图4-e)。25 dah稚鱼尾部骨骼发育基本完全，且尾鳍鳍条数量基本稳定在22条。此阶段稚鱼的尾骨骨骼除未骨化外，与成鱼基本无异 (图4-f)。
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图 4 尖翅燕鱼尾鳍的发育过程注：a. 2 日龄仔鱼；b. 7 日龄仔鱼；c. 9 日龄仔鱼；d. 13 日龄仔鱼；e. 18 日龄仔鱼；f. 25 日龄稚鱼。Figure 4. Development of caudal fin in P. teiraNote: a. 2 dah larva; b. 7 dah larva; c. 9 dah larva; d. 13 dah larva; e. 18 dah larva; f. 25 dah juvenile.2.4 背鳍和臀鳍的发育
尖翅燕鱼发育至8 dah时 (图5-c)，背鳍出现14枚近端桡骨 (Rx)，这标志着背鳍开始发育。仔鱼发育至9 dah时 (图5-d)，远端桡骨 (Rd) 清晰可见，此时近端桡骨达到29枚并且往背下增长，远端桡骨往上伸长。13 dah时 (图5-e)，背鳍的担鳍骨 (Pte) 开始出现，远端桡骨达到36枚，已初步形成背部鳍条 (Dfr)，鳍棘数目基本稳定。发育到26 dah时 (图5-f)，背鳍呈扇形继续伸长，此时近端桡骨从基部向末梢骨化，远端桡骨仍为软骨。
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图 5 尖翅燕鱼背鳍、臀鳍、胸鳍和腹鳍的发育过程注：a. 2 日龄仔鱼；b. 4 日龄仔鱼；c. 8 日龄仔鱼；d. 9 日龄仔鱼；e. 13 日龄仔鱼；f. 26 日龄稚鱼。Figure 5. Development of the dorsal, anal, pectoral and pelvic fins of P. teiraNote: a. 2 dah larva; b. 4 dah larva; c. 8 dah larva; d. 9 dah larva; e. 13 dah larva; f. 26 dah juvenile.尖翅燕鱼在8 dah时 (图5-c)，靠近泄殖孔处出现10枚近端桡骨，这标志着臀鳍开始发育。仔鱼到9 dah时 (图5-d)，近端桡骨达到21枚，从泄殖孔向尾部伸长，此时远端桡骨开始出现，数量为16枚左右。同样在13 dah时 (图5-e)，仔鱼臀部出现担鳍骨，臀鳍近端桡骨维持在26枚左右，远端桡骨往外伸展形成臀鳍 (Afr)。发育到26 dah时 (图5-f)，臀鳍近端桡骨从基部向末梢骨化，此阶段臀鳍远端桡骨仍为软骨。
2.5 胸鳍和腹鳍的发育
胸鳍为尖翅燕鱼最早发育的附肢骨骼，初孵仔鱼可观察到胸鳍支鳍骨原基 (Fp)，主要为乌喙骨-肩胛软骨 (图5-a)。仔鱼在4 dah时，可清晰看到上匙骨 (Suc)、后匙骨 (Poc) 以及匙骨 (Cl)，支鳍骨原基中间出现一条明显的裂缝 (图5-b)。随着匙骨和支鳍骨原基继续发育，直至13 dah支鳍骨原基出现数条裂缝，成为最初的胸鳍 (Fr) (图5-e)。稚鱼发育至26 dah时，其胸鳍骨骼呈扇形，鳍条形态和数量与幼鱼相比基本没有差异 (图5-f)，胸鳍发育直至实验结束尚未完全骨化。
尖翅燕鱼腹鳍支鳍骨原基 (Pt) 在4 dah时开始出现 (图5-b)。8 dah仔鱼的腹鳍支鳍骨已经开始着生腹鳍条 (Pfr)，此时鳍条数目为4枚，并随着仔鱼的生长鳍条逐渐增长 (图5-c)。发育至26 dah时，腹鳍变得细长，形态与幼鱼相比无异，但仍未完成骨化 (图5-f)。
3. 讨论
鱼类的骨骼根据生长部位可划分为两大类：附肢骨骼和主轴骨骼，其中附肢骨骼根据奇偶鳍数分为奇鳍骨骼和偶鳍骨骼，主轴骨骼分为脊柱和头骨[2]。鱼类早期骨骼发育会经历一系列的变化，不同类型的骨骼发育时序也存在显著差异。不同种属间的鱼类骨骼发育差异明显，大泷六线鱼从27 dah起脊柱骨骼开始骨化，50 dah时骨化完成[11]。卵形鲳鲹脊柱骨骼从9 dah时开始矿化，直至18 dah时矿化完成[12]。本研究中尖翅燕鱼在23 dah时开始骨化，直至发育至幼鱼骨骼矿化还未完成。不同种属鱼类脊椎骨骼的椎骨数量也不大相同，王永梅等[13]对157种鲤形目鱼类的脊椎骨研究发现，鲤形目鱼类总脊椎骨数为30~52 。本研究中尖翅燕鱼的脊椎骨数量与王秋荣等[14]报道的青石斑鱼 (E. awoara) 相一致，均为24枚。此外，同科不同属鱼类的脊椎骨骼也存在明显差异，李仲辉和杨太有[15]发现尖吻鲈 (Lates calcarifer) 和大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 脊椎骨数目存在较大差异，导致两者的生物学特征有很大区别，这说明鱼类早期的脊椎骨数目与其生物学特性相关。
研究表明，大多数鱼类的尾部骨骼结构和数量基本相同，极少数鱼类的尾部骨骼存在差异[16]。大多数海水鱼类尾部骨骼由5 枚尾下骨和 2枚或以上的尾上骨构成[17-18]。如卵形鲳鲹[10]和大泷六线鱼[19]尾部骨骼均有5枚尾下骨，金钱鱼[5]尾部骨骼由3枚尾上骨和6枚尾下骨构成，而塞内加尔鳎 (Solea senegalensis)[20]尾部骨骼仅有1枚尾上骨，且缺少尾神经骨。尖翅燕鱼和大部分海水鱼类一样，尾部骨骼由5枚尾下骨和2枚尾上骨构成。
不同种类鱼的骨骼发育时序有所不同[21]。尖翅燕鱼与褐点石斑鱼 (E. fuscoguttatus)[22]、尖吻鲈[23]和黄姑鱼 (Nibea albiflora)[24]等其他海水鱼相比，脊柱和胸鳍在出膜前已开始发育，这与其受精卵卵径和油球较大、孵化时间较长有关。鱼类受精卵储存的营养物质和孵化时间为胚内骨骼发育提供物质基础。鱼类早期骨骼发育时序性也与生活习性和环境相关。例如，鲹科鱼类游速较快、爆发性游泳能力强，其脊柱和尾部骨骼发育相对较早，能较快地适应环境[25]。大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 在孵化后12~13 dah 脊柱和尾部骨骼开始发育，此时底栖生活习性形成[26]。邓平平等[27]在对褐菖鲉 (Sebastiscus marmoratus) 的研究中也得到相似的结果。
尖翅燕鱼初孵仔鱼已具备间歇性游泳能力，孵化后卵黄囊勉强能支撑仔鱼存活5~6 d，所以在内源性营养消耗完之前，必须具备游泳和捕食能力。胸鳍和尾鳍作为游泳器官，可为鱼类摄食提供动力，一般优先发育。刀鲚 (Coilia ectenes) 在油球完全消耗完之前具备自主摄食能力，其胸鳍早在卵黄囊阶段便开始发育[28]。青鳉 (Oryzias latipes) 的胸鳍发育也发生在孵化成仔鱼之前[29]。尖翅燕鱼初孵仔鱼直接存在支鳍骨原基，在4 dah时已具备在静水中平衡和左右摆动的能力；7 dah仔鱼尾部开始发育，游泳能力明显增强，摄食饵料和逃避天敌的能力也有所提高，生存能力和生长速度增加；仔鱼发育至13 dah时，其骨骼数目基本稳定，之后开始不同程度的骨化。此外，仔鱼骨骼发育直接影响鱼类饵料的转换过程，早期骨骼发育有利于增强鱼体的游泳和摄食能力，可显著提高饵料转换期间仔鱼的成活率。由此可见，鱼类的骨骼发育除与其生活习性息息相关之外，同时也受养殖环境的影响，是其生理功能与环境适应的产物。本研究系统地开展了尖翅燕鱼仔稚鱼的骨骼发育研究，掌握了鱼体早期发育过程中骨骼的系统发生，为尖翅燕鱼苗种繁育、环境适应和分类鉴定等研究提供了理论基础。
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图 1 基于鳗败血假单胞菌recA基因的引物特异性与标准品质粒鉴定结果
注：a. qPCR引物特异性结果；b. RAA引物及探针特异性结果；c. 标准品质粒鉴定结果。
Figure 1. Results based on primers specificity and standard plasmid identification of recA gene of P. anguilliseptica
Note: a. Primer specificity results for qPCR; b. Primer and probe specificity results for RAA; c. Results of standard plasmid identification.
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图 2 鳗败血假单胞菌qPCR及RAA扩增序列同源性对比
Figure 2. Comparison of homology between qPCR and RAA amplified sequences of P. anguilliseptica
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图 3 鳗败血假单胞菌RAA扩增条件的优化
注：a. 不同引物浓度的RAA-LFD显色结果；b. 灰度分析结果 (对应3-a)；c. 不同反应温度的RAA-LFD显色结果；d. 灰度分析结果 (对应3-c)；不同字母表示差异显著 (p<0.05)。
Figure 3. Optimization of RAA amplification conditions for P. anguilliseptica
Note: a. Results of RAA-LFD color development with different primer concentrations; b. Grayscale analysis results (Corresponding to 3-a); c. Results of RAA-LFD color development at different reaction temperatures; d. Grayscale analysis results (Corresponding to 3-c); different letters represent significant differences (p<0.05).
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图 4 鳗败血假单胞菌qPCR方法建立结果
注：a. qPCR标准曲线；b. qPCR熔解曲线，1—6. 质粒标准品浓度为2.816×107~2.816×102 拷贝·μL−1。
Figure 4. Results established by qPCR for P. anguilliseptica
Note: a. Standard curve for qPCR; b. Melting curves for qPCR, 1−6. Concentration of standard plasmid was 2.816×107−2.816×102 copies·μL−1.
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图 5 鳗败血假单胞菌RAA-LFD反应结果
注：a. 不同反应时间的RAA-LFD显色；b. 灰度分析 (对应5-a)，不同字母表示差异显著 (p<0.05)。
Figure 5. Results of RAA-LFD reaction of P. anguilliseptica
Note: a. Results of RAA-LFD color development at different reaction time; b. Grayscale analysis results (Corresponding to 5-a), different letters represent significant differences (p<0.05).
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图 6 鳗败血假单胞菌灵敏性试验结果
注：a. 普通PCR灵敏性电泳图，M. 标准分子量DL 2000，NC. 阴性对照，1. 2.816×108 拷贝·μL−1，2. 2.816×107 拷贝·μL−1，3. 2.816×106拷贝·μL−1，4. 2.816×105 拷贝·μL−1，5. 2.816×104 拷贝·μL−1；b. qPCR标准质粒扩增曲线，1—6. 质粒标准品浓度为2.816×107~2.816×102 拷贝·μL−1；c. 不同浓度标准质粒的RAA-LFD显色；d. 灰度分析 (对应6-c)，不同字母表示差异显著 (p<0.05)。
Figure 6. Results of sensitivity test for P. anguilliseptica
Note: a. Sensitive electrophoresis pattern of PCR, M. Standard molecular weight is DL 2000, NC. Negative control, 1. 2.816×108 copies·μL−1, 2. 2.816×107 copies·μL−1, 3. 2.816×106copies·μL−1, 4. 2.816×105 copies·μL−1, 5. 2.816×104 copies·μL−1; b. Amplification curves of qPCR standard plasmids, 1−6. Concentration of standard plasmid was 2.816×107−2.816×102 copies·μL−1; c. Results of RAA-LFD color development with different concentrations of standard plasmids; d. Grayscale analysis results (Corresponding to 6-c), different letters represent significant differences (p<0.05).
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图 7 鳗败血假单胞菌特异性试验结果
注：a. qPCR特异性扩增曲线；b. 不同菌株的RAA-LFD显色结果；c. 灰度分析结果 (对应7-b)，不同字母表示差异显著 (p<0.05)；d. 普通PCR特异性电泳图。
Figure 7. Results of specificity test for P. anguilliseptica
Note: a. Specific amplification curves of qPCR; b. RAA-LFD chromogenic results of different strains; c. Grayscale analysis results (Corresponding to 7-b), different letters represent significant differences (p<0.05); d. Specific electrophoresis pattern of PCR.
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图 8 受感染大口黑鲈各部位的鳗败血假单胞菌载量结果
注：组1、组2、组3表示3个平行的PA感染组，感染量为1×107 CFU·尾−1。
Figure 8. Results of P. anguilliseptica load in each part of infected M. salmoides
Note: Group 1, 2 and 3 represent three parallel PA infected groups at 1×107 CFU·ind−1.
表 1 研究所用的细菌菌株
Table 1 Bacterial strains used in this study
菌株名称
Bacterial strain菌株编号
Strain No.鳗败血假单胞菌 Pseudomonas anguilliseptica SICAU PA001 无乳链球菌 Streptococcus agalactiae GY104 拟态弧菌 Vibrio mimicus SCCF01 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila YYL 鮰爱德华菌 Edwardsiella ictaluri CNHYC01 鰤诺卡菌 Nocardia seriolae DY01 荧光假单胞菌 P. fluorescens ATCC® 13525 柱状黄杆菌 Flavobacterium cloumnare ATCC® 23463 维氏气单胞菌 A. veronii ATCC® 35624 
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表 2 研究所用引物及探针
Table 2 Primers used in this study
检测方法
Detection method引物名称
Primer name序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')产物大小
Length of product/bpPCR recA-PCR-F/R F: CTCGCTTGGTCTGGACATCG
R: CCTTGCCTTGGCCGATCTT740 qPCR recA-qPCR-F/R F: GGCAGCTCTTACACCCAAAG
R: GGCTCCCAAACATAACACCTAT179 RAA-LFD recA-RAA-F/R F: CATGCACTTGACCCAATCTACGCAGCAAAG
R: Biotin CCCGTAATCTTACGCATTGCCTGACTCATC251 recA-RAA-Probe FAM AAGCTGAAATCGAAGGTGAAATTGGGGATA/idSp/
GCACGTTGGGTTGGC C3 Spacer
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表 3 鳗败血假单胞菌qPCR扩增条件的优化
Table 3 Optimization of qPCR amplification conditions for P. anguilliseptica
退火温度
Annealing temperature/℃引物浓度
Primer concentration/(μmol·L−1)Ct值
Ct value平均Ct值
Mean Ct value标准差
Standard deviation58 0.2 14.583 15.418 14.845 14.949 0.349 0.4 13.876 14.356 14.230 14.154 0.203 0.6 13.336 13.576 13.429 13.447 0.099 0.8 13.745 13.401 13.313 13.486 0.187 1.0 13.756 13.444 13.895 13.698 0.189 60 0.2 14.419 15.074 14.355 14.616 0.325 0.4 14.079 13.832 13.786 13.899 0.129 0.6 13.204 13.259 13.314 13.259 0.045 0.8 13.349 13.608 13.573 13.510 0.115 1.0 13.749 14.023 13.988 13.920 0.122 62 0.2 16.812 16.033 16.267 16.370 0.326 0.4 15.305 15.466 15.077 15.283 0.160 0.6 14.275 14.119 14.439 14.277 0.131 0.8 14.206 14.401 15.046 14.551 0.359 1.0 14.748 14.207 14.805 14.587 0.269 64 0.2 15.745 16.784 15.695 16.075 0.502 0.4 14.139 14.916 14.878 14.644 0.358 0.6 15.061 15.328 15.457 15.282 0.165 0.8 15.740 15.112 15.557 15.470 0.264 1.0 15.963 15.369 15.844 15.725 0.257
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表 4 鳗败血假单胞菌qPCR方法重复性试验结果
Table 4 Results of qPCR reproducibility test for P. anguilliseptica
标准品质粒浓度
Standard quality plasmid
concentration/
(拷贝·μL−1)组内重复性试验
Repeatability test within group组间重复性试验
Repeatability test between group平均Ct值±标准差
Mean Ct value±standard deviation变异系数
Variable coefficient/%平均Ct值±标准差
Mean Ct value±standard deviation变异系数
Variable coefficient/%2.816×107 10.300±0.032 0.311 10.328±0.149 1.443 2.816×106 13.213±0.042 0.318 13.257±0.122 0.920 2.816×105 16.710±0.122 0.730 16.606±0.212 1.277 2.816×104 19.511±0.102 0.523 19.523±0.111 0.569 2.816×103 22.609±0.081 0.358 22.618±0.168 0.743 2.816×102 26.083±0.130 0.498 26.120±0.210 0.804
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表 5 鳗败血假单胞菌3种检测方法的应用结果对比
Table 5 Comparison of application results of three detection methods for P. anguilliseptica
检测方法
Detection method样本总数
Total sample number阳性样本检出率
Detection rate of positive samples共同阳性/阴性样本数
Number of common positive/negative samplesKappa值
Kappa valueqPCR/RAA-LFD 40/40 87.50%/85.00% 34/5 0.895 qPCR/PCR 40/40 87.50%/62.50% 25/5 0.385 RAA-LFD/PCR 40/40 85.00%/62.50% 25/6 0.455 注：Kappa值的取值范围为0~1.00，其中1.00表示完全一致，0表示完全不一致。常见标准为：Kappa值在0~0.20表示一致性极低，0.21~0.40表示一致性较低，0.41~0.60表示一致性中等，0.61~0.80表示一致性较高，0.81~1.00表示一致性极高。 Note: The Kappa values ranged from 0 to 1.00, with 1.00 indicating complete agreement and 0 indicating complete disagreement. Common criteria are as follows: Kappa of 0−0.20 represents very low consistency; 0.21−0.40 represents low consistency; 0.41−0.60 represents medium consistency; 0.61−0.80 represents high consistency; 0.81−1.00 represents extremely high consistency.
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