Effects of acute hypoxia stress on respiratory metabolism and related gene expression of juvenile Babylonia areolate
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摘要:
方斑东风螺 (Babylonia areolate) 在养殖环境和运输过程中易遭遇低氧胁迫。为评估低氧胁迫对方斑东风螺代谢和免疫功能的影响，将溶解氧 (DO) 质量浓度分别降至6、4、2、1和0.5 mg·L−1后，测定方斑东风螺稚贝的耗氧率和排氨率，并分析了乳酸脱氢酶 (LDH)、丙酮酸激酶 (PK)、超氧化物歧化酶 (SOD)、酸性磷酸酶 (ACP) 和碱性磷酸酶 (AKP) 的活性和基因表达水平。结果显示，与对照组相比，随着DO水平下降，方斑东风螺的耗氧率显著降低 (p<0.05)，排氨率先显著升高后显著降低 (p<0.05)；LDH活性显著低于对照组 (p<0.05)，但在DO质量浓度为1 mg·L−1时显著升高 (p<0.05)；PK活性显著低于对照组 (p<0.05)，但在DO质量浓度为0.5 mg·L−1时显著升高 (p<0.05)；SOD活性显著低于对照组 (p<0.05)；ACP和AKP活性先显著降低后升高，分别在DO质量浓度为1和0.5 mg·L−1时显著高于对照组 (p<0.05)；LDH基因表达水平在DO降至4 mg·L−1后显著降低 (p<0.05)，PK基因表达水平在DO降至1 mg·L−1后显著升高 (p<0.05)；SOD基因表达水平在DO降至0.5 mg·L−1后显著降低 (p<0.05)，ACP和AKP的基因表达水平显著下调 (p<0.05)。研究表明，方斑东风螺可通过降低代谢率、调控代谢、免疫酶活性和基因的表达来应对低氧胁迫。
Abstract:Babylonia areolate is vulnerable to hypoxic stress during aquaculture and transportation. To evaluate the effects of hypoxia stress on its metabolism and immune function, we measured the oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of juveniles, and analyzed the gene expression levels of lactate dehydrogenase (LDH), pyruvate kinase (PK), superoxide dismutase (SOD), acid phosphatase (ACP) and alkaline phosphatase (AKP) after the dissolved oxygen (DO) concentration decreased to 6, 4, 2, 1and 0.5 mg·L−1, respectively. The results show that with the decline of DO level, the oxygen consumption rate of B. areolate decreased significantly (p<0.05), and the ammonia excretion rate first significantly increased and then significantly decreased (p<0.05). LDH activity was significantly lower than that of the control group (p<0.05), but significantly higher at 1 mg·L−1 (p<0.05); PK activity was significantly lower than that of the control group (p<0.05), but significantly higher at 0.5 mg·L−1 (p<0.05); SOD activity was significantly lower than that of the control group (p<0.05); the activities of ACP and AKP were significantly lower and then increased, and significantly higher than the control at 1 and 0.5 mg·L−1, respectively (p<0.05). Compared with the control group, the expression level of LDH gene decreased significantly (p<0.05) after the DO level decreased to 4 mg·L−1, and that of PK gene increased significantly (p<0.05) after the DO level decreased to 1 mg·L−1; the SOD gene expression was significantly down-regulated (p<0.05) after the DO level decreased to 0.5 mg·L−1; the ACP and AKP gene expression was significantly down-regulated (p<0.05). The results indicate that B. areolate can respond to hypoxic stress by decreasing metabolic rate and regulating metabolism, immune enzyme activity and gene expression.
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溶解氧 (DO) 是重要的环境因子之一，适宜的DO浓度对维持水生生物的生长、存活、行为、生理等功能至关重要[1]。海水贝类主要栖息于河口和近岸海域，在其生命周期中，既要面对自然因素导致的周期性DO浓度波动，也会遭遇全球气候变化和人类活动导致的低氧环境胁迫[2]。很多海水贝类是重要的养殖对象，在养殖和运输过程中，受养殖密度过高、底质环境恶化、无水运输等影响，经常会面对不同时间的低氧环境。研究海水贝类应对低氧环境的响应过程和机制，有助于阐明其对环境变动的适应机制，为养殖生产提供参考。
为了提高在低氧环境下生存的几率，海洋生物会采取多层次的应对策略，其中对新陈代谢的调节是海洋生物适应低氧环境变化的重要机制之一[3]。作为海水贝类获取氧气的重要生理活动，呼吸代谢在低氧环境下的响应模式在一定程度上反映了贝类对低氧环境的耐受力，是研究贝类低氧生理适应的重要指标。关于低氧胁迫对海水贝类呼吸代谢的影响，已在欧洲扇贝 (Pecten maximus)、贻贝 (Mytilus edulis)、美洲牡蛎 (Crassostrea virginica)、厚壳贻贝 (M. coruscus)、香螺 (Busycon contrarium ) 等贝类中开展了较多研究[4-7]。研究表明，通过调整代谢方式和降低代谢率，贝类可以延长体内储存的能量物质的消耗时间，从而帮助贝类度过缺氧期，维持生存的时间[8]。能量代谢需要细胞代谢酶的参与。研究发现，贝类可通过激活或抑制与糖酵解和无氧代谢相关的酶来应对低氧胁迫，如乳酸脱氢酶 (LDH)、丙酮酸激酶 (PK) 等[9-11]。低氧环境下，海洋生物通常会将有限的能量优先用于维持基本生命活动[3]，这会影响贝类的免疫功能，包括贝类血细胞功能以及溶酶体酶、抗氧化酶的活性和表达量[12]。
方斑东风螺 (Babylonia areolate) 属软体动物门、腹足纲、新腹足目、蛾螺科、东风螺属，在我国东南沿海广泛分布。其生长速度快，富含不饱和脂肪酸，具有很高的经济价值，已成为中国南方沿海地区主要贝类养殖品种之一[13]。方斑东风螺养殖要维持较高的DO质量浓度 (6 mg·L−1) [14]。在高密度养殖条件下，水体易出现DO不足情况，造成低氧胁迫。当遭到高温等环境变化时，水体中的DO可减少90%以上，严重时会造成螺死亡[15]。在方斑东风螺的运输过程中，若运输箱内长时间保持高密度装载，也极易因DO不足而引发低氧胁迫。目前关于低氧胁迫对方斑东风螺呼吸代谢及免疫功能影响的研究较少。开展方斑东风螺对环境低氧的响应研究，不仅具有重要的实践价值，还能为养殖经济物种应对全球气候变化提供研究模型。本研究通过测定不同低氧水平下，方斑东风螺稚贝的代谢率以及相关基因的表达水平，探究了其在急性低氧胁迫下的代谢与免疫响应机制。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
实验螺购于海南省某方斑东风螺养殖场，采用低温空运，6 h内运至中国水产科学研究院东海水产研究所浙江宁海研究中心，暂养于400 L水槽内。水槽底部铺约7 cm的细沙，暂养期间，每日按体质量的30%投喂冰鲜杂鱼，为防止水质败坏，进食后1 h内捞出食物残渣并换水50%。海水盐度28‰，温度 (28±1) ℃，pH 8.1，24 h增氧，保持水体DO质量浓度在7.5 mg·L−1以上。养殖30 d后，挑选大小一致、活力好的稚贝 [壳长 (12.01±1.19) mm、壳高 (19.89±1.36) mm、湿质量 (1.58±0.37) g] 用于实验。
1.2 低氧胁迫方法
实验容器选用直径39 cm、高55 cm的塑料圆桶，实验用水为经砂滤池过滤的自然海水。实验稚贝共120只，平均分为6组，每组20只。参照江天棋等[7] 和井浩[9] 的研究结果，设置DO质量浓度梯度为6、4、2、1和0.5 mg·L−1，以7.5 mg·L−1为对照组，通过向实验桶水体连续充氮气和空气，将实验桶水体中DO水平在30 min内分别降至设定梯度，DO质量浓度浮动范围控制在 ±0.1 mg·L−1，各组维持目标溶氧水平4 h后进行代谢率测定和取样。DO质量浓度采用雷磁JPBJ-609L溶氧仪持续测定。
1.3 代谢率测定
每个低氧处理组取12只方斑东风螺，采用静水法测定耗氧率。设 3个平行组和1个空白对照组。玻璃呼吸瓶体积为0.56 L，注入不同DO浓度的实验海水后，每瓶放入4只方斑东风螺，空白组不放螺，在不影响幼螺活动的情况下用网袋将其放置在呼吸瓶中央，加入磁力转子充分混匀海水，连接溶氧仪后使用橡皮塞将呼吸瓶密封，持续测定呼吸瓶内DO浓度，实验持续1 h，每隔 5 min 读数 1 次，共测定12次。实验结束后，将稚贝取出，取呼吸瓶内水样用于排氨率的测定，取出的稚贝用吸水纸吸干壳体表面水分后，称量湿质量。
耗氧率 (R, mg·g−1·min−1) 的计算公式为：
$$ \mathit{R} {\mathrm{=}} \mathit{K} \mathrm{\times } \mathit{V} \div\mathit{m} $$ (1) 式中：K为DO浓度对时间线性回归的斜率绝对值；V为呼吸瓶体积 (L)；m为呼吸瓶内螺湿质量 (g)。
排氨率 (E, mg·g−1·h−1) 的计算公式为：
$$ \mathit{E} \mathrm{=(} \mathit{N} _{ \mathit{t} } \mathrm{−} \mathit{N} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)\times } \mathit{V} \div \mathrm{(} \mathit{m} \mathrm{\times } \mathit{t} \mathrm{)} $$ (2) 式中：Nt和N0分别为实验结束时实验组和对照组水中的氨氮 (${\mathrm{NH}}_4^+{\text{-}} {\mathrm{N}}$)质量浓度 (mg·L−1)；V为呼吸瓶体积 (L)；m为呼吸瓶内螺湿质量 (g)；t为实验持续时间 (min)。
1.4 酶活性测定
准确称取方斑东风螺全组织样品0.1 g，加入1 mL提取液，进行冰浴匀浆，4 ℃下12 000 r·min−1离心10 min，取上清液，冰上放置用于酶活性测定。采用苏州格锐思生物科技有限公司试剂盒测定LDH、PK、超氧化物歧化酶 (SOD)、酸性磷酸酶 (ACP) 和碱性磷酸酶 (AKP) 活性，具体测定方法参照说明书进行。
1.5 基因表达分析
各低氧水平处理4 h后每组取3只螺进行全组织取样，加入RNA保存液。使用总RNA提取试剂盒 (Biospin) 提取组织样本RNA。采用NanoDrop ND-2000C分光光度计 (Thermo)测定RNA浓度和纯度。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，使用Prime ScriptTM RT Master Mix试剂盒 (TaKaRa) 将RNA反转录为cDNA。使用荧光定量PCR试剂盒 (Foregene EasyTM Mix-SYBR Green I) 在Quant Studio实时荧光定量PCR系统上检测各基因相对表达量，反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行35个循环。测定LDH、PK、SOD、ACP和AKP的基因表达水平。以β-actin为内参基因，各引物序列如表1所示。采用2−△△Ct方法计算目的基因的相对表达量。
表 1 实验中所用的引物序列Table 1. Sequence of primers used in this study引物
Primer序列
SequenceLDH-F GAGGTCGAGTCTTGGTCGTT LDH-R ACCGCTCTGCCAGTCTTCA PK-F GCATTTGTGCCATCTTGTA PK-R GCCATACCGTGTCCTCTAC SOD-F TGCCAAGGTCACATCAATC SOD-R ATGCCTACCGCACTCGTTT ACP-F AGCGTAGACACTGCTCGTA ACP-R GATGCTGGGAAACTGGGAC AKP-F GTTGTTGCTGGTAAAGATGA AKP-R CAAGTTTGGGCTGATGAAG β-actin-F GGTTCACCATCCCTCAAGTACCC β-actin-R GGGTCATCTTTTCACGGTTGG 1.6 数据分析
实验数据使用Excel 2016软件进行处理与作图，以“平均值±标准差 ($\overline { x}\pm s $)”表示。使用SPSS 25.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析 (ANOVA) 和Duncan's多重比较对各指标数据进行差异分析，显著性水平设为p<0.05。
2. 结果
2.1 不同溶解氧水平下方斑东风螺的耗氧率和排氨率
急性低氧胁迫处理过程中，方斑东风螺稚贝未出现死亡。如图1所示，急性低氧胁迫下方斑东风螺的耗氧率与DO水平呈负相关关系。与7.5 mg·L−1的对照组相比，随DO水平下降，方斑东风螺的耗氧率显著降低 (p<0.05)，在0.5 mg·L−1时降至最低。6、4和2 mg·L−1时的耗氧率无显著性差异 (p>0.05)。
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图 1 急性低氧胁迫下方斑东风螺耗氧率和排氨率注：不同小写字母表示处理间差异显著 (p<0.05)。Figure 1. Oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of B. areolata under acute hypoxia stressNote: Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (p<0.05).急性低氧胁迫下方斑东风螺排氨率变化如图1所示。与对照组相比，随DO水平下降， 6、4 mg·L−1时方斑东风螺的排氨率显著升高 (p<0.05)，2 mg·L−1时排氨率显著降低 (p<0.05)，1 mg·L−1时排氨率升至对照组水平，0.5 mg·L−1时的排氨率显著降低 (p<0.0)，达到最低。
2.2 不同溶解氧水平下方斑东风螺代谢和免疫酶活性
如图2所示，与对照组相比，随DO水平下降，方斑东风螺LDH活性显著降低 (p<0.05)，在2 mg·L−1时LDH活性达到最低，但在1 mg·L−1时活性显著升高，0.5 mg·L−1时又显著降低 (p<0.05)。随DO水平下降，方斑东风螺PK活性逐渐降低，在4、2和1 mg·L−1时显著低于对照组 (p<0.05)，在1 mg·L−1时达到最低，但在0.5 mg·L−1时又显著升高 (p<0.05)(图2)。
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图 2 急性低氧胁迫下方斑东风螺代谢和免疫酶活性变化注：不同小写字母表示处理间差异显著 (p<0.05)。Figure 2. Metabolic and immune activities of B. areolata under acute hypoxia stressNote: Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (p<0.05).急性低氧胁迫下，随DO水平下降，方斑东风螺SOD活性逐渐降低，在1 mg·L−1时达到最低 (图2)。与对照组相比，各处理浓度的SOD活性均显著降低 (p<0.05)。随DO水平下降，6 mg·L−1时ACP活性与对照组相比无显著性差异 (p>0.05)，其后逐渐降低，至4 mg·L−1时ACP活性显著低于对照组 (p<0.05)，至2 mg·L−1时达到最低值，其后逐渐升高，1 mg·L−1时的ACP活性显著低于对照组 (p<0.05)，0.5 mg·L−1时显著高于对照组 (p<0.05)。随DO水平下降，AKP活性先降低后升高。6、4和2 mg·L−1时的AKP活性显著低于对照组 (p<0.05)，但在1和0.5 mg·L−1时显著高于对照组 (p<0.05)。
2.3 不同溶解氧水平下方斑东风螺代谢和免疫酶基因表达
如图3所示，随DO水平下降，6 mg·L−1时LDH基因表达水平与对照组相比无显著性差异 (p>0.05)，其后逐渐降低，至4 mg·L−1时LDH基因表达水平显著低于对照组 (p<0.05)，至2 mg·L−1时达到最低，其后逐渐升高，但1和0.5 mg·L−1时的LDH基因表达水平仍显著低于对照组 (p<0.05)。与对照组相比，6、4和2 mg·L−1时的PK基因表达水平无显著性差异 (p>0.05)。随DO水平下降，PK基因表达水平逐渐升高，至1 mg·L−1时，PK基因表达水平显著高于对照组 (p<0.05)，并在0.5 mg·L−1时达到最高 (图3)。
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图 3 急性低氧胁迫下方斑东风螺代谢和免疫酶基因表达水平变化注：不同小写字母表示处理间差异显著 (p<0.05)。Figure 3. Metabolic and immune enzyme gene expression of B. areolata under acute hypoxia stressNote: Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (p<0.05).随DO水平下降，SOD基因表达水平先升高后降低 (图3)。与对照组相比，在DO质量浓度为1~6 mg·L−1范围内SOD基因表达水平无显著性差异 (p>0.05)，但在0.5 mg·L−1时显著低于对照组 (p<0.05)。急性低氧胁迫下方斑东风螺ACP基因表达如图3所示。与对照组相比，DO质量浓度降至6 mg·L−1时ACP基因表达水平即出现显著下调 (p<0.05)，其后逐渐降低，至0.5 mg·L−1时达到最低 (图3)。降至6 mg·L−1时AKP基因表达水平与对照组相比即出现显著下调 (p<0.05)，其后随DO水平下降，AKP基因表达水平略有升高，但各处理组的AKP基因表达水平仍显著低于对照组 (p<0.05)。
3. 讨论
3.1 急性低氧胁迫对方斑东风螺代谢率的影响
氧是线粒体内氧化磷酸化过程的最终电子受体。在低氧状态下，葡萄糖分子不能被完全氧化，仅通过糖酵解等途径产生2个ATP，远低于完全氧化所产生的32个ATP，从而限制了生物体需氧活动的进行[16]。本研究发现，随DO水平下降，方斑东风螺的耗氧率显著降低，表明低氧环境对其能量代谢产生了影响。这与虾夷扇贝 (Mizuhopecten yessoensis) 和厚壳贻贝的研究结果相似[7,26]。降低代谢率是贝类应对低氧胁迫的重要生理策略之一，该机制可以降低组织对ATP的需求，延长体内能量物质的消耗时间[8]。本研究中，急性低氧胁迫下虽然方斑东风螺耗氧率显著下降，但没有出现死亡，进一步证实了降低代谢率是方斑东风螺适应低氧环境的关键生理机制。
本研究中，DO质量浓度降至6 mg·L−1时方斑东风螺稚贝的耗氧率即出现了显著下降，表明方斑东风螺对DO浓度的变化较为敏感。这与扇贝、贻贝等物种的反应不同，厚壳贻贝和紫贻贝的耗氧率在DO质量浓度为2~8 mg·L−1范围内保持相对稳定，1 mg·L−1后耗氧率出现显著下降[6-7]；海水氧饱和度降至20%以后，欧洲扇贝的耗氧率才快速下降[3]。有学者根据动物耗氧率对DO浓度变化响应方式的不同，称耗氧率随环境氧气浓度下降而降低的动物为氧气随变生物 (Oxyconformers)，称耗氧率独立于环境氧气浓度变化的动物为氧气调变生物 (Oxyregulators) [4,17]。本研究结果表明方斑东风螺属于氧气随变生物，这可能是长期进化的结果，因为扇贝、贻贝等是附着生物，移动速度较慢，所以进化形成对低氧环境的耐受能力；而方斑东风螺移动较快，可以主动寻找更适宜的栖息环境，因而对DO较为敏感。
氨氮主要来自蛋白质和氨基酸代谢，排氨率可以反映机体的蛋白质代谢水平[18]。本研究中，6和4 mg·L−1下的排氨率显著高于对照组，表明轻微低氧胁迫下方斑东风螺可能通过加快氨基酸和蛋白质代谢为机体提供能量。随DO水平的继续下降，排氨率显著降低，说明方斑东风螺减少了蛋白质和氨基酸的分解代谢。排氨率的变化表明方斑东风通过调整代谢方式适应较低的溶氧环境。在近江牡蛎 (C. rivularis) 和香港牡蛎 (C. hongkongensis) 中也得到了类似的结果[19-20]。
3.2 急性低氧胁迫对方斑东风螺代谢、免疫酶活性和基因表达的影响
能量代谢是通过一系列酶促反应实现的，受相关酶活性和表达水平的影响。LDH是无氧代谢途径的关键酶，其可以催化丙酮酸生成乳酸并产生ATP[21]。本研究中，方斑东风螺LDH活性在低氧胁迫后显著降低，基因表达水平也在4 mg·L−1后显著降低，表明LDH参与了方斑东风螺低氧应答过程。对团头鲂 (Megalobrama amblycephala) 的研究发现，血液和肌肉中LDH-A基因的表达水平随DO水平的降低而下降[22]。对魁蚶 (Scapharca broughtonii) 和菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 的研究发现，低氧胁迫下LDH活性升高[9,23]，鳜 (Siniperca chuatsi) 各组织中LDH-A基因的表达水平随DO水平降低而升高[10]，与本研究结果不同，这可能与物种差异有关。PK是糖酵解过程中的主要限速酶之一，在机体代谢过程中发挥着重要作用和调节功能。本研究中，随DO水平的降低，方斑东风螺PK活性先降低后显著升高，PK基因表达水平逐渐升高，表明低氧胁迫下方斑东风螺通过调节糖酵解能力应对机体的能量需求。在其他水生动物中也有类似发现，在2和0.5 mg·L−1低氧胁迫下，菲律宾蛤仔鳃和肝胰腺中PK基因表达水平显著升高[9]；在3 mg·L−1的低氧胁迫下，虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 心脏中PK基因的表达水平显著升高[24]。如图4所示，本研究表明，调节能量代谢相关酶的活性和基因表达水平是方斑东风螺适应低氧环境的途径之一。
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图 4 低氧胁迫下方斑东风螺能量代谢和免疫响应示意图Figure 4. Illustration of energy metabolism and immune responses induced by hypoxia in B. areolata葡萄糖作为生物体主要能量的来源，其在无氧条件下可以通过多种方式分解，例如葡萄糖-琥珀酸途径、丙酮酸-乳酸途径、脯氨酸等途径[8]。为降低长期缺氧时体内酸积累对细胞平衡的影响，海水贝类会产生挥发性或酸性较低的乳酸替代性终产物[8]。本研究中，可能在轻度低氧胁迫环境下，方斑东风螺为了避免酸性代谢物的堆积选择了琥珀酸途径；当DO质量浓度降至1 mg·L−1时，为了提高代谢利用率，选择了丙酮酸-乳酸途径作为呼吸代谢的主要途径；当DO质量浓度继续降至0.5 mg·L−1时，LDH活性显著降低，这种现象可能与贝类代谢途径多样化有关。研究发现，贝类的代谢途径除琥珀酸、乳酸途径之外，还存在着Opine途径，该途径由Opine脱氢酶 (OpDHs) 代替LDH在缺氧环境下发挥作用[21,25]。
SOD是生物体内抗氧化反应机制的重要酶，可清除和平衡细胞内活性氧自由基 (ROS)，是检测贝类免疫防御能力的重要指标。本研究中，低氧胁迫下方斑东风螺SOD活性和基因表达水平显著降低，表明低氧胁迫影响了方斑东风螺免疫功能。对虾夷扇贝和栉孔扇贝 (Chlamys farreri) 的研究发现，低氧胁迫下组织SOD活性先升高后降低[26-27]。紫贻贝 (M. galloprovincialis) 在2 mg·L−1的低氧环境中胁迫24 h后SOD基因表达水平显著降低[28]。低氧胁迫会造成氧化应激，使得生物体内抗氧化体系紊乱[29]，方斑东风螺SOD基因表达水平的变化可能与此有关。
ACP和AKP是溶酶体的组成成分，在磷酸基团的转移过程中发挥重要作用，同时参与免疫反应，可以用作评估水生动物免疫状态的指标[30]。本研究中，DO质量浓度下降至1 mg·L−1后ACP的活性和基因表达水平均显著降低，AKP的活性和基因表达水平也在6~1 mg·L−1时显著降低，表明低氧胁迫抑制了方斑东风螺细胞参与免疫的水解酶活性，降低了方斑东风螺的免疫防御能力。在刺参 (Stichopus japonicus) 中也发现了类似结果，低氧胁迫下刺参体壁ACP和AKP活性均显著低于对照组[31]。研究发现，低氧胁迫下，福建牡蛎 (C. angulata) 闭壳肌中AKP活性显著低于对照组[32]。本研究中，DO质量浓度在0.5 mg·L−1时ACP、AKP活性显著高于对照组 (p<0.05)，可能是由于溶酶体膜稳定性降低导致ACP、AKP活性升高[29]。
本研究中，部分低氧胁迫下的酶活性与基因表达的结果不一致。已有研究发现，基因的表达与表型性状的表达之间一般是相关的，但并不是直接的一一对应关系。最终的表型并不完全由基因表达水平决定。蛋白质的翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化和糖基化等，通过修饰关键酶或蛋白质，在调节蛋白质、葡萄糖和脂质代谢方面发挥着至关重要的作用[33-34]。
4. 小结
本研究表明，急性低氧胁迫显著影响了方斑东风螺稚贝的耗氧率和排氨率。低氧胁迫下，LDH的活性和基因表达水平显著降低；PK活性先降低后升高，基因表达水平显著升高；SOD活性和基因表达水平显著下调；ACP和AKP的活性先降低后升高，基因表达水平显著降低；表明方斑东风螺可能通过降低代谢率和调控代谢相关基因的表达应对低氧胁迫。低氧胁迫显著影响方斑东风螺稚贝的抗氧化能力和免疫功能，LDH和SOD可以作为方斑东风螺低氧胁迫的生物标志物。
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图 1 急性低氧胁迫下方斑东风螺耗氧率和排氨率
注：不同小写字母表示处理间差异显著 (p<0.05)。
Figure 1. Oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of B. areolata under acute hypoxia stress
Note: Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (p<0.05).
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图 2 急性低氧胁迫下方斑东风螺代谢和免疫酶活性变化
注：不同小写字母表示处理间差异显著 (p<0.05)。
Figure 2. Metabolic and immune activities of B. areolata under acute hypoxia stress
Note: Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (p<0.05).
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图 3 急性低氧胁迫下方斑东风螺代谢和免疫酶基因表达水平变化
注：不同小写字母表示处理间差异显著 (p<0.05)。
Figure 3. Metabolic and immune enzyme gene expression of B. areolata under acute hypoxia stress
Note: Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (p<0.05).
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图 4 低氧胁迫下方斑东风螺能量代谢和免疫响应示意图
Figure 4. Illustration of energy metabolism and immune responses induced by hypoxia in B. areolata
表 1 实验中所用的引物序列
Table 1 Sequence of primers used in this study
引物
Primer序列
SequenceLDH-F GAGGTCGAGTCTTGGTCGTT LDH-R ACCGCTCTGCCAGTCTTCA PK-F GCATTTGTGCCATCTTGTA PK-R GCCATACCGTGTCCTCTAC SOD-F TGCCAAGGTCACATCAATC SOD-R ATGCCTACCGCACTCGTTT ACP-F AGCGTAGACACTGCTCGTA ACP-R GATGCTGGGAAACTGGGAC AKP-F GTTGTTGCTGGTAAAGATGA AKP-R CAAGTTTGGGCTGATGAAG β-actin-F GGTTCACCATCCCTCAAGTACCC β-actin-R GGGTCATCTTTTCACGGTTGG 
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