解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)能够产生丰富的具有潜在生物防治和其他工业应用价值的抗菌物质，包括脂肽类、磷脂类、氨基酸类和核酸类等低分子量的抗生素及抗菌蛋白和多肽等活性物质，可以抑制多种病原^[1-3]，这为寻找抗生素的替代物开辟了新途径，并在生物防治中发挥重要作用^[4-6]。除解淀粉芽孢杆菌外，枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. lichemformis)、环状芽孢杆菌(B. circulan)、蜡样芽胞杆菌(B. cereus)和短小芽孢杆菌(B. pumilus)等^[7-8]都能产生抗菌物质。近年来，不断有新的抗菌物质被发现。

芽孢杆菌能产生抗菌物质，其中最著名的就是脂肽，又称为非核糖体肽^[9]，其具有线性或环状结构，不同排列组合的氨基酸链(7~10个氨基酸)与不同链长和异构体的疏水性脂肪酸相连，通常由非核糖体肽合成酶结合聚酮合酶或脂肪酸合成酶系统合成^[10]。其主要包括表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和丰原素(Fengycin)。Surfactin族的脂肽由β-羟基脂肪酸(十二碳到十六碳)与七肽的氨基酸N端相连，形成环状内酯结构。Surfactin由于两性特征可以与细胞膜结合从而具有溶血、抗病毒、抗支原体和抗菌活性^[11-13]；Iturin族是β-氨基酸链(十四碳到十七碳)与七肽相结合，是一类环脂肽小分子物质，具有溶血性和较强的体外抗真菌作用^[14]，对部分细菌表现出抗菌活性与Surfactin族存在差异^[15]。Fengycin是在肽部分具有内酯环和β-羟基脂肪酸链(十四碳到十八碳)的十肽，分为Fengycin A和B，具有较强的抗真菌活性和较弱的抗细菌活性^[16]。脂肽还对高温、酸碱和蛋白酶具有很好的稳定性^[17]，此外，还发现它们能够有效地去除污染土壤中的石油碳氢化合物^[18]。由于这些优点使得其在医学、食品和生物技术方面得到广泛的开发和应用，也受到了极大关注。与此同时抗生素应用带来的诸多弊端^[19-20]也催生出新的且更有效脂肽的研发。

本实验室前期分离到一株对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)具有良好抑制作用的解淀粉芽孢杆菌HE^[21]，其共培养实验表明该菌的发酵液对嗜水气单胞菌有明显的抗菌活性。为了探究解淀粉芽孢杆菌HE代谢产生的抗菌活性物质组成及其抗菌特性，本研究利用代谢产物稳定性、分子生物学手段和质谱技术，对抗菌活性物质成分进行分析鉴定并研究其抗菌特性，以期为解淀粉芽孢杆菌活性代谢产物的分离、纯化和结构鉴定以及安全性评价奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   菌株与培养基

解淀粉芽孢杆菌(本实验室在池塘底泥中分离得到)、嗜水气单胞菌 (本实验室分离鉴定)、脑心浸出液肉汤(BHI)、琼脂粉。

1.1.2   实验试剂

甲醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、乙醇，以上均为分析纯；电镜固定液(武汉市皮诺飞生物)、PBS (hyclone)、锇酸(Ted Pella Inc)、细菌基因组DNA提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)、各种限制性内切酶、rTaq酶、LATaq酶、T4 DNA连接酶及其他工具酶(TaKaRa)。

1.1.3   仪器与设备

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(AB 5600+)、扫描电子显微镜(hitachi SU8010)、旋转蒸发仪YRE200E (巩义市予华仪器有限责任公司)、数显恒温水浴锅HH-6 (国华电器有限公司)、立式压力蒸汽灭菌锅BL-50A (上海博讯实业有限公司)、无菌操作台Type A2 (LABONCO)、紫外分光光度计UV-2802PC (上海优尼柯仪器有限公司)、电热恒温培养箱DN0-9162B-III (上海新苗医疗器械制造有限公司)、全温度光照震荡培养箱QHZ-98B (太仓市华美生化仪器厂)。

1.2   菌株培养

将解淀粉芽孢杆菌接种到脑心浸出液培养液中，37 ℃、160 r·min⁻¹摇床培养24 h，作为种子液。按5%接种量接种种子液到脑心浸出液中进行发酵培养，相同条件震荡培养48 h。

1.3   发酵液抗菌活性稳定性分析

取解淀粉芽孢杆菌发酵液分别进行不同温度(4 ℃、40 ℃、70 ℃、100 ℃和121 ℃)、pH (2、5、7、9、11和13)、有机试剂(甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷)和蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K的反应质量浓度为500 μg·mL⁻¹)等条件处理，实验组每组3个平行，对照组不做任何处理。采用牛津杯法抑菌实验^[22]，在杯中加入处理后的活性发酵液，放置37 ℃培养24 h后观察抑菌现象，同时测量抑菌圈。

1.4   脂肽类抑菌物质合成相关基因的克隆

1.4.1   引物设计

扩增mycB、fenB、sfp和ituA的基因引物序列见表1 (由武汉擎科生物工程有限公司合成)。

表  1  引物序列设计

Table  1.  Primer sequence design

基因 gene	引物 primer	序列 (5'−3') sequence	产物大小/bp product size
mycB	MYCB-F	ATGTCGGTGTTTAAAAATCAAGTAACG	2 024
	MYCB-R	TTAGGACGCCAGCAGTTCTTCTATTGA
fenB	FENB-F	CTATAGTTTGTTGACGGCTC	1 400
	FENB-R	CAGCACTGGTTCTTGTCGCA
sfp	SFP-F	ATGAAGATTTACGGAATTTA	675
	SFP-R	TTATAAAAGCTCTTCGTACG
ituA	ITUA-F	ATGTATACCAGTCAATTCC	1 150
	ITUA-R	GATCCGAAGCTGACAATAG

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1.4.2   PCR获得目的基因

利用特异性引物，通过PCR方法扩增目的条带。PCR反应体系如下：1 μL正向引物，1 μL反向引物；1 μL dNTP，0.5 μL LATaq，5 μL 10×LATaq Buffer，40.5 μL ddH₂O，1 μL DNA模板。扩增结束后取3~5 μL PCR产物进行电泳检测。

1.4.3   克隆转化

将PCR产物与目的质粒或T载体连接，转入到XL-gold感受态细胞，将获得的阳性重组子送样测序，测序由武汉擎科生物工程有限公司完成。

1.4.4   序列分析

利用NCBI数据库的BLAST程序对产物序列进行同源性检索，与GenBank数据进行比对分析。

1.5   活性物质的提取与质谱分析

1.5.1   活性物质的提取

将发酵液以6 000 r·min⁻¹离心10 min，收集发酵上清液，再用0.22 μm的滤膜抽滤收集发酵上清液。所得的发酵上清液用6 mol·L⁻¹的盐酸调pH至2.0，放置4 ℃冰箱内过夜。次日以10 000 r·min⁻¹离心20 min，得到酸沉淀，并用pH为2.0的稀盐酸反复洗涤3次。所得的沉淀甲醇反复溶解，抽提3次，合并抽滤液。将所得的提取液于40~45 ℃旋转蒸发除溶剂干燥，即得脂肽粗提物，用甲醇溶解，并检测抑菌活性。

1.5.2   飞行时间质谱分析

将甲醇溶解的脂肽提取物和空白培养基用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)检测分析。色谱条件：色谱柱Symmetry^®C18 (100 mm×2.1 mm×3.5 μm)。梯度洗脱条件为：溶液A水，溶液B乙腈。梯度变化的时间为：溶液B，0~10 min，10%~40%；10~20 min，40%~60%；20~25 min，60%~90%；25~27 min，10%。5 μL进样，流速300 μL·min⁻¹，206 nm波长检测。质谱分析条件为：ESI离子源，正离子模式，离子喷雾电压5 000 V，毛细管电压32 V，离子源温度500 ℃，质量扫描范围(m/z) 500~2 000。

1.6   脂肽抗菌活性测定

在96孔板中，采用二倍稀释法测定抗菌活性，加菌液不加脂肽为阳性对照，不加脂肽和菌液为空白对照，每个梯度3个平行。30 ℃培养18~24 h，观察和计算最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。

1.7   脂肽对嗜水气单胞菌生长曲线的影响

将对数生长期的菌体，按4%的接种量分别接种于8个液体培养基中，分组后继续在37 ℃、160 r·min⁻¹培养，分别于第0、第2、第4、第6、第8、第10、第12、第16、第24和第36小时取样测定光密度值 (OD_{600 nm})，制作出生长曲线。分组情况为：第一组在培养的第0、第2、第4、第6小时加入脂肽使其终浓度为1 MIC；第二组在培养的第4、第6、第8小时加入脂肽使其终浓度为3 MIC；第三组对照组于培养的同时加入无菌水。

1.8   显微特征的观察

将培养至对数生长期的嗜水气单胞菌于4 000 r·min⁻¹离心10 min，除去培养基，用无菌PBS调节菌体浓度约为10⁸ CFU·mL⁻¹，加入1 MIC脂肽，然后将其孵育于37 ℃，3 h后，5 000 r·min⁻¹离心10 min收集菌体，PBS轻轻漂洗，弃PBS加电镜固定液，吹散悬浮于固定液内，室温固定2 h，4 ℃保存。立即取样按照扫描电镜样品制备方法制备样品并观察采图^[23]。

1.9   数据分析

实验数据以“平均值±标准差($\overline X \pm {\rm SD}$)”表示，用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计分析，将数据做单因子方差分析(ANOVA)，当P<0.05时认为差异显著。

2.   结果

2.1   活性发酵液稳定性结果

与pH 7时对比，发酵液在pH 3和13时的抗菌活性显著降低(图1-A，P<0.05)，但同样有明显的抑菌活性，说明活性成分的pH范围很广且具有较好的酸碱稳定性。温度(图1-B)在80 ℃、100 ℃和121 ℃时抗菌活性显著下降(P<0.05)，依然有较强的抗菌活性，说明该抗菌物质具有很好的热稳定性。发酵液在有机溶剂(图1-D)的处理组与对照组抗菌活性并没有显著差异(P>0.05)。活性发酵液经3种酶(图1-C)处理后胃蛋白酶和蛋白酶K能显著降低发酵液抑菌活性 (P<0.05)，但抑菌圈直径仍在2 cm以上，表明抗菌物质对蛋白酶也具有很好的稳定性。

图  1  不同pH (A)、温度 (B)、蛋白酶 (C) 和有机试剂 (D) 对抗菌物质的影响

方柱上不同小写字母表示组间差异显著 (P<0.05)

Figure  1.  Effects of different pH (A), temperature (B), protease (C) and organic reagent (D) on antimicrobial substances

Lowercase letters on the bar indicate significant difference among groups (P<0.05).

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2.2   PCR扩增结果

利用4对引物，分别对解淀粉芽孢杆菌基因组DNA进行PCR扩增，获得ituA、sfP、fenB和mycB 4条目的片段，图2是4对引物扩增结果电泳图。

图  2  脂肽类物质相关基因的PCR检测

Figure  2.  Detection of lipopeptides related genes by PCR

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2.3   核苷酸序列同源性分析结果

序列在NCBI上进行BLAST同源性分析，发现fenB基因序列与解淀粉芽孢杆菌JT84 FenB (KX351428.1)基因同源性为100%。扩增的ituA基因与枯草芽孢杆菌ZK0 ItuD、 ItuA、ItuB和ItuC (KT781920.1)基因同源性为98%，与枯草芽孢杆菌bacillomycin D (AY137375.1)基因的同源性为99%。扩增的mycB基因与解淀粉芽孢杆菌CC178 (CP006845.1)同源性为97%；扩增的sfP基因与解淀粉芽孢杆菌KHG19 (CP007242.1)中的调控基因sfP同源性为98%。根据比对结果推测该菌基因组DNA中含有Surfactin、Iturin、Fengycin和Myeosubtilin的代谢合成序列，Myeosubtilin属于Iturin中的一类，所以猜测该菌株可能产生Surfactin、Iturin和Fengycin这3类脂肽类抗生素。

2.4   抑菌活性检测结果

解淀粉芽孢杆菌发酵液脂肽提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果见图3。抑菌圈的直径可达(24.5±2.5) mm，有较高重复性。而抑菌圈大小与脂肽的浓度、涂布菌体浓度、培养基组成和菌体的结构特点存在一定的相关性，影响抑菌圈的大小。

图  3  脂肽提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果

Figure  3.  Antibacterial effect of lipopeptides extract on A. hydrophila

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2.5   质谱分析结果

通过采用UPLC-Q-TOF-MS检测分析技术对菌株发酵液脂肽提取液和培养基进行组分分析。结合色谱图各个时间段出现的峰对应到质谱图(图4和表2)，根据相对分子质量以及脂肪链的“-CH2-”结构特征，对一系列质谱图单一的峰进行解析，液质检测的一级质谱图中，m/z 500~2 000 范围内主要有：m/z 1 029.611 7、m/z 1 043.507 1、m/z 1 057.627 8、m/z 1 071.647 0、m/z 1 085.543 2，对应的是不同长度的碳链脂肪酸[M+H]⁺峰，推测以上质谱峰可能对应Iturin A、Myeosubtilin、Bacillomycin F及其离子加成峰，但由于之前已经从实验菌株基因组中分别扩增到Iturin A和Mycosubtilin的合成酶基因ituA和mycB，因而推测上述离子所对应的物质可能是Iturin A或Mycosubtilin的同系物。m/z 1 435.694 8 、m/z 1 449.706 9、m/z 1 463.719 1、m/z 1 477.731 9 、m/z 1 491.743 3、m/z 1 505.755 8，对应的是不同长度的碳链脂肪酸[M+H]⁺峰，实验菌株基因组中也扩增到了fenB基因，而只有C14-15Fengycin A才会出现m/z 1 435.694 8 、m/z 1 449.706 9的[M+H]⁺峰，C17 Fengycin B会有m/z 1 505.755 8的[M+H]⁺峰，因此可以确定Fengycin A和Fengycin B都存在。m/z 1 008.592 13、m/z 1 022.606 52、m/z 1 036.584 52、m/z 1 050.633 91，对应的是不同长度的碳链脂肪酸[Surfactin+H]⁺峰，同时也检测到了菌株Surfactin合成酶调控基因sfP，说明产生的抗菌脂肽可能包括Surfactin A、B和C。

图  4  脂肽提取物的UPLC-Q-TOF-MS的MS谱图

Figure  4.  MS spectra of antibacterial crude extracts by UPLC-Q-TOF-MS

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表  2  脂肽提取物的UPLC-Q-TOF-MS分析

Table  2.  Analysis of lipopeptides extracts by UPLC-Q-TOF-MS

出峰时间/min retention time	质量测定值 (m/z) measured mass	离子结形式 parention	脂肽类型 lipopeptide type
7.55~8.55	1 029.6117	[M+H]+	C13 Iturin A
9.48~12.20	1 043.507 1、1 057.6278、 1 071.6470、1 085.543 2	[M+H]+	C14-17 Iturin A或C14 -17 Mycosubtilin
12.29~13.48	1 435.694 8、1 449.706 9	[M+H]+	C14 -15 Fengycin A
15.19~16.48	1 463.719 1、1 477.731 9、 1 491.743 3	[M+H]+	C16-18 Fengycin A或C14-16 Fengycin B
17.65	1 505.755 8	[M+H]+	C17 Fengycin B
24.48~25.53	1 008.592 13、1 022.606 52、 1036.584 52	[M+H]+	C13-15 Surfactin A或C14-16 Surfactin B或C13-15 Surfactin C
26.38	1 050.633 91	[M+H]+	C16 Surfactin A或C16 SurfactinC

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2.6   脂肽抗菌活性测定

通过倍比稀释法测定解淀粉芽孢杆菌脂肽抗嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为137.97 μg·mL⁻¹。

2.7   脂肽对嗜水气单胞菌生长曲线的影响

对照组 (b1) 生长曲线可以看出嗜水气单胞菌的迟缓期较短，2~6 h处于对数期，6 h以后生长速度开始减慢进入稳定期 (图5)。实验组b菌体浓度在第16小时时开始下降，说明菌体发生溶解。当在1 MIC时，随着菌体浓度的升高加入的脂肽抑菌效果随之减弱；当菌液浓度相当时，3 MIC比1 MIC抑菌效果要强，而当菌体浓度OD_{600 nm}>1.5时，增加脂肽浓度其抑菌和杀菌效果均出现了延迟。

图  5  脂肽对嗜水气单胞菌生长曲线的影响

bl. 对照组，a、b、c、d分别于第0、第2、第4和第6 小时加入1倍MIC脂肽；e、f、g分别于第4、第6和第8小时加入3倍MIC脂肽

Figure  5.  Effect of lipopeptide on A. hydrophila growth curve

bl. control; a, b, c, d. 1×MIC lipopeptide was added at 0^th, 2^nd, 4^th, 6^th hour, respectively; e, f, g. 3×MIC lipopeptide was added at 4^th, 6^th, 8^th hour, respectively.

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2.8   显微特征的观察

未观察到对照组(图6-A)嗜水气单胞菌细胞的异常形态，菌体形态大小均匀、边缘整齐，菌体细胞完整清晰，而经脂肽处理后的嗜水气单胞菌细胞表现为细胞边缘不整齐，轮廓变模糊(图6-D)，菌体表面粗糙有塌陷(图6-B)和形态变短变粗，部分菌体出现孔洞，异常菌体形态增多(图6-C)。这说明脂肽能够导致细胞正常形态结构的改变。

图  6  嗜水气单胞菌的扫描电镜图

A. 对照组细胞；B、C、D分别为1 MIC的脂肽处理3 h

Figure  6.  Scanning electron microscopic results of A. hydrophila

A. control; B, C and D were treated with 1 MIC lipopeptide for 3 h

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3.   讨论

本研究参照张荣胜等^[2]对拮抗细菌代谢活性成分分析以及胡陈云等^[24-25]对枯草芽孢杆菌脂肽类物质的研究思路并加以完善，首先了解代谢产物理化性质，推测可能存在的抑菌物质，再用分子生物学手段进一步推测，最后用质谱技术检测其代谢产物分子量，三者相互印证，最终判定解淀粉芽孢杆菌代谢的抑菌物质种类。

通过发酵液的稳定性实验结果，说明解淀粉发酵液所含有的抑菌物质对高温、酸碱、有机溶剂和蛋白酶都具有很好的稳定性。枯草芽孢杆菌B6-1可以产生耐酸、耐碱且热稳定性好的一类物质，后续通过分离鉴定得出该物质属于脂肽类抗生素且具有较好抗菌活性^[26-27]，与本研究初期结果基本一致。综合上述特征并结合前人报道，推测该菌株应该产生了脂肽类抗生素。因此参考邓建良^[28]对脂肽类抗生素合成相关基因的研究设计了4对引物，利用这4对引物再对HE菌株基因组进行PCR扩增，将扩增后的产物克隆、测序和比对，得出HE菌株基因组中存在mycB、fenB、sfP和ituA 4对基因，最后采用脂肽抗生素提取法对发酵液进行活性物质提取，再将活性提取物进行UPLC-Q-TOF-MS检测分析，最终确定了解淀粉芽孢杆菌产生了Surfactin、Iturin和Fengycin这3类脂肽类抗生素，与张荣胜等^[2]和胡陈云等^[24-25]对枯草芽孢杆菌产脂肽类抗生素的种类一致。

根据倍比稀释法测定其HE菌株脂肽提取物的MIC和MBC均为137.97 μg·mL⁻¹。杨丽莉等^[29]用超高效液相色谱法(HPLC)测定枯草芽孢杆菌发酵液脂肽粗提物中脂肽的含量，通过倍比稀释法测定了枯草芽孢杆菌抗菌脂肽对嗜水气单胞菌的MIC为20 μg·mL⁻¹，MBC为32 μg·mL⁻¹。对于两者之间存在较大差异的原因，可以从质谱结果判定，很多未知的分子质量的出现，说明解淀粉芽孢杆菌发酵液通过酸沉淀和甲醇抽提也获得了非脂肽类物质；另外可能由于解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌两者所代谢的脂肽结构类型不同导致抗菌活性有差异，对此尚需更深入的研究；而B. subtilis fmbJ^[30]产生的脂肽经HPLC定量后用倍比稀释法测定其对大肠杆菌的MIC为468.75 μg·mL⁻¹，出现这一现象的原因可能和细菌细胞壁的组成结构有关，不同细菌细胞壁和细胞膜组成的特异性也是不同微生物对脂肽具有不同强度敏感性的原因之一^[30]。据Robinson等^[31]研究发现阳离子抗菌肽抗革兰氏阴性和阳性细菌、真菌以及原生动物的MIC值介于0.25~16 μg·mL⁻¹，各种类型的两性α-螺旋抗菌肽以15个氨基酸残基组成的抗菌肽抗菌效果最好^[32]，而本实验提取到的脂肽为环形脂肽类两性分子，其具有两性的分子结构，虽然抗菌肽的抑菌活性优于抗菌脂肽，但并不影响抗菌脂肽继续开发的价值。

本研究分别从嗜水气单胞菌的迟缓期、对数期和稳定期3个时期选择时间段加入脂肽，以观察脂肽对菌体在不同的生长时期的影响，结果发现在迟缓期的抑制效果最好，其次是对数期，最后是稳定期，本结果也与枯草芽孢杆菌产生的脂肽抗菌效果相似^[33]。扫描电镜显示解淀粉芽孢杆菌产生的脂肽作用于嗜水气单胞菌后其菌体表面出现粗糙、塌陷和孔洞。表明脂肽可以改变菌体细胞膜的通透性，使胞浆内物质外漏，与Raaijmakers等^[10]报道的脂肽抗菌机理基本一致，均为作用于细胞膜从而导致靶细胞死亡。而有关解淀粉芽孢杆菌产生脂肽的其他抗菌机理还需更深入的探究与验证。

4.   结论

通过HE菌株代谢物的稳定性，PCR检测和质谱分析技术确定了解淀粉芽孢杆菌产生了Surfactin、Iturin和Fengycin这3类脂肽类抗生素，该脂肽类提取物对嗜水气单胞菌具有较强的抑制效果，并对其细胞膜有损伤作用。本研究为后期进一步开展该脂肽类物质的分离、纯化和结构鉴定，评价脂肽类抗生素在水产动物体内的残留及解淀粉芽孢杆菌菌剂为水生态环境的安全性等研究奠定了基础。