Structural and functional characteristics of intestinal bacterial community associated with red spotting disease of Strongylocentroyus intermedius
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摘要:
红斑病是海胆养殖过程中最常见的细菌性疾病之一,具有发病速度快、传染性强、致死率高等特点。为揭示机体患病和肠道菌群间的相关性,基于16S rRNA测序技术,开展了患红斑病中间球海胆 (Strongylocentroyus intermedius) 肠道菌群结构和功能特征研究。结果显示,与健康组海胆相比,患病组海胆肠道菌群可操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTUs) 数量减少,Alpha多样性显著下降 (p<0.05)。门水平上,患病组海胆肠道菌群结构特征表现为变形菌门和拟杆菌门的相对丰度显著上升,以及厚壁菌门的相对丰度显著下降 (p<0.05)。属水平上,Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia、短波单胞菌属 (Brevundimonas)、弧菌属 (Vibrio)、假单胞菌属 (Pseudomonas) 等的相对丰度显著增加 (p<0.05)。功能分析进一步揭示了患病组海胆肠道菌群代谢通路的变化,具体表现为肾素-血管紧张素系统、蛋白质消化、吸收、霍乱弧菌 (V. cholerae) 感染等相关代谢通路丰度显著增加,而叶酸生物合成途径通路丰度显著降低 (p<0.05)。研究表明,红斑病扰乱了中间球海胆肠道微生态平衡,降低了肠道菌群的稳定性。
Abstract:Red spot disease is one of the most prevalent bacterial diseases in sea urchin (Strongylocentrotus intermedius) aquaculture, exhibiting rapid development, high contagion and a considerable mortality rate. We investigated the gut bacterial community composition and function characteristics of sea urchins with red spotting disease by using 16S rRNA sequencing technology, so as to reveal the correlation between diseases and gut bacterial communities. The results demonstrate that compared with the healthy sea urchins, the number of operational taxonomic units (OTUs) and the Alpha index in the gut microbiota of the diseased ones decreased significantly (p<0.05). On phylum level, the relative abundance of Proteobacteria and Bacteroidota in the gut of diseased sea urchin increased significantly, while the relative abundance of Firmicutes was significantly lower (p<0.05). On genus level, the relative abundance of Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia, Brevundimonas, Vibrio and Pseudomonas increased significantly (p<0.05). The analysis of the functional characteristics of the microbial communities reveals that the paths related to the Renin-angiotensin system, protein digestion, and Vibrio cholerae infection in diseased sea urchins increased significantly, while the Folate biosynthesis pathway decreased significantly (p<0.05). The results indicate that the microbial ecological balance and stability were reduced by red spot disease in the gut bacterial community of S. intermedius.
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微卫星(microsatellite)DNA是由1~6个核苷酸为单位多次串联重复的简单序列,又称简短串联重复序列(short tandem repeat,STR)、简单序列重复(simple sequence repeat,SSR) 或简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism,SSLP),是20世纪80年代末发展起来的一种分子标记。微卫星具有高度的多态性[1]和共显性,在真核生物基因组中随机分布,每代变异超过2%[2]。其分析可以分辨一个碱基对的差异[3],且等位基因的条带易于识别和解释,比其它分子标记带来更多的信息量[4]。因此在种群遗传结构分析、种群遗传多样性检测、遗传图谱的构建及生产性状位点的连锁分析与QTL定位分析中得到了广泛的应用[5-7]。
由于不同种类之间的微卫星引物序列通用性较差。因此必须首先从实验生物基因组中获得微卫星DNA序列,设计引物,筛选多态性微卫星标记。然而筛选微卫星座位的工作繁重,其使用受到一定的限制。随着分子生物学技术的发展,相继产生了一些新的微卫星DNA分离方法。本文对几种微卫星位点分离技术进行介绍并对其进行分析比较,为选择适合的方法提供参考。
1. 微卫星位点的分离方法
1.1 生物信息学方法(Data mining)与近缘种交叉扩增(cross amplification)
获得微卫星最简捷的途径就是通过互连网从公共数据库(如EMBL、GenBank、EST数据库等)查找微卫星DNA,如河豚(Fugu rubripes)[8]、中国明对虾(Fenneropenaeus orientalis)[9]和栉孔扇贝(Chlamys farreri)[10]等。徐鹏等[9]利用生物信息学方法从10 446个中国明对虾ESTs序列中筛选微卫星DNA,共发现微卫星序列229个,占整个ESTs数据的2.19%,其中含双碱基重复序列146个和3碱基重复序列58个,分别占在ESTs微卫星序列总数的63.76%和25.33%,大部分为完美型(perfect)的重复序列。根据筛选的微卫星序列设计19对引物并进行多态性检测,在有扩增产物的16对引物中,首次筛选得到8个中国明对虾微卫星标记。其次,利用近缘种的已知微卫星引物进行交叉扩增(cross amplification)筛选也可获得一定的有效微卫星引物。鲁双庆等[11]研究了鲤(Cyprinus carpio)微卫星引物对远缘种黄鳝(Monopteras albus)的适用性。结果显示,31对鲤微卫星引物中有11对引物能对黄鳝DNA模板扩增出特异性带谱。每对引物扩增的等位基因数3~13个,平均每个位点5.6个,显示了较高的多态性。林凯东等[12]首次将鲤的微卫星引物用于草鱼(Ctenopharyngodon idellus)基因组分析。
1.2 小片段DNA克隆法(small DNA fragments cloning)
此方法的基本原理是构建目标生物基因组小片段DNA文库,通过杂交筛选出含有微卫星序列的阳性克隆。首先用限制性内切酶充分消化DNA,琼脂糖凝胶电泳,选取400~900 bp片段克隆,构建基因组文库。然后将重组克隆转移到杂交膜上,采用32P标记的重复序列探针如(AT)n进行杂交,放射自显影,获得阳性克隆、测序,设计PCR引物并进行扩增筛选(图 1)。
孙效文等[13]利用上述方法从鲤鱼文库中筛选2 000个菌落,获得阳性克隆45个,有22个含有微卫星,其中完美型的占63.6%,非完美型的占22.7%,混合型的占13.7%。陈微等[14]用此方法从牙鲆(Paralichthys olivaceus)文库中筛选阳性克隆45个,共得到20个微卫星序列,其中完美型13个,非完美型5个,混合型2个。PANIEGO等[15]也用此方法分离向日葵(Helianthus annnus)微卫星标记。测序503个微卫星克隆,设计了271对微卫星引物。
利用微卫星重复序列作探针筛选基因组文库是一种耗时费力的方法[16]。获得阳性克隆的比例通常较少(0.04%~12%之间)。对于那些基因组中微卫星DNA含量不是很丰富的种类(比如鸟类和植物),或需要大量的微卫星标记用于研究种群遗传结构[17-18]或构建遗传图谱[19]时,用此方法分离微卫星难以满足需要。
1.3 以RAPD为基础的PCR分离微卫星法(RAPD-based PIMA approach)
为了避免基因组文库的构建和筛选的繁琐性,一些国外学者先后报道用随机扩增多态DNA(RAPD)方法去扩增未知的微卫星序列[20-21]。其中用PCR分离微卫星(PCR isolation of microsatellite approach,PIMA)[22]就是用RAPD引物从目标生物基因组中获得随机扩增片段,这些扩增产物克隆到T-载体上,然后用含有重复序列引物和载体引物筛选阳性克隆、测序(图 1,PIMA支路)。RAPD片段比随机基因组克隆含有较多的微卫星重复序列[23-25]。与传统的方法相比,PIMA省略了DNA酶切、片段大小选择以及接头连接这些步骤,虽然实验操作简单但研究报道较少。
1.4 引物伸长法(Primer extension approach)
基因组DNA酶切后,选一定大小的片段插入到质粒(pBluescript)或噬菌体(M13mp18)载体上,然后转化、洗脱获得含有单链环状DNA(ssDNA)并构建文库。以ssDNA为模板,与含有重复序列的寡聚核苷酸或带有生物素标记的重复序列进行伸长反应,获得富含微卫星位点双链DNA的次级文库。最后Southern杂交或PCR筛选阳性克隆并测序(图 2)。
OSTRANDER等[26]和PAETKAU[27]运用引物伸长法分别对犬齿类和鲍鱼基因组文库进行实验,并分别获得40%~50%和最高达100%阳性克隆。OSTRANDER等构建了含60 000克隆的单链DNA文库,对于基因组频率低于1%的特定重复序列有600座位(含所需的重复序列)在富集文库中表现出来。并且该方法对分离富含2个寡核苷酸重复序列如(AC)n比较有效,对分离3个和4个寡核苷酸重复序列是否有效还不肯定。此方法实验步骤繁琐使其适用性受到一定限制。
1.5 选择性杂交法(selective hybridization method)
选择性杂交法第一步与传统方法一样,也是基因组DNA经过酶切后与接头或载体连接,用连有接头的DNA片段与标记的重复序列探针选择性杂交,捕获含有微卫星序列的DNA片段。最后PCR扩增、克隆。对重组克隆可直接测序、PCR筛选或Southern blot筛选(图 3)。
此方法实验步骤简单,报道较多[28-32]。其中酶切片段与接头或载体连接是非常重要的一步,因为连接插入片段的量不足和多联体的形成都会限制下一步的实验。酶切片段大小的选择可以在酶切后[30]或在连接后[31]进行,在连接后选择片段大小有利于去除非特异性连接。重复序列探针与DNA的杂交既可在尼龙膜上[28, 32]也可在包被有链霉亲和素的磁珠上[30-31]进行。LI等[33-34]采用选择杂交法已成功分离出8个皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)微卫星标记。
1.6 磁珠富集法(magnetic beads enrichment method)
磁珠富集法分离微卫星分子标记是一种简单高效的方法[31, 35], 已经应用于一些植物和动物微卫星分子标记的分离[26, 36-37]。实验生物基因组DNA经酶切,连上接头,PCR扩增,与生物素标记的重复序列探针杂交,磁珠富集,构建PCR富集文库(图 4)。然后再进行筛选即可得到微卫星分子标记。可用不同的酶和接头进行酶切、连接。如果按AFLP的方法进行酶切、连接、扩增,再富集,即为FIASCO法(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)[38]。包括单酶切扩增产物富集[38]和双酶切预扩增产物富集[36]。
孙效文等[13]用此方法筛选鲤鱼微卫星标记。获得微卫星314个,完美型占79.0 %,非完美型占14.3 %,混合型占6.7 %,重复次数超过10的有293个,占93.3 %。孙效文等[38]用磁珠富集法分离草鱼微卫星DNA标记。筛选获得阳性克隆132个,86.36 %含有微卫星序列。高国庆等[36]用FIASCO法从AFLP片段中分离花生(Arachis hypogaeal)微卫星DNA标记,结果回收纯化14个片段,测序后发现都含有简单重复序列。从预扩增的AFLP片段中富集SSR可获得较多的含简单重复序列的片段,而选择性扩增的AFLP片段不经富集直接测序的方法效率较低[39]。此方法在其他种类(比如一些鸟类、鱼类、甲壳类和红珊瑚)的富集率在50%~90%[38]。这些研究表明,用生物素-磁珠富集法克隆微卫星效率高,成本低,所获微卫星质量高。
2. 结语
直接克隆法耗时费力且筛选的效率也比较低。引物伸长法虽有所报道,其实验操作繁琐使其适用性受到限制。磁珠富集法是一种高效而简单快速的分离方法,已经应用于一些植物和动物微卫星分子标记的分离。整个过程可在一星期完成。如果利用篮白斑筛选克隆,从理论上讲,每一个白色菌斑都应当含有微卫星序列。但是操作过程中一些因素会影响筛选微卫星效率。最主要的影响因素是磁珠的平衡及洗液和洗涤温度的严格控制。从国内发表的文献上看,目前从基因组分离微卫星的主要方法是小片段克隆法和磁珠富集法以及稍作改进的一些方法。还有一些从基因组中克隆微卫星的方法,但最有效的还是基于PCR扩增的磁珠富集法。
从整体上看,微卫星分子标记在陆生动植物的分离和应用比较早,水产动物起步较晚,大多还处于分离筛选的初级阶段。在国内,只有鲤[41],对虾[9, 42],栉孔扇贝[10]等少数种类已分离出微卫星分子标记。网上基因库可利用的资源也还非常有限,远不能满足研究和应用的需要。而我国是一个渔业大国,水产动物种类多,遗传差异大,在遗传多样性分析、连锁图谱构建、数量性状基因(quantitative trait loci, QTL)定位分析、分子标记辅助育种等方面需要大量的微卫星标记。因此,选择有效的分离方法可以加速水产动物尤其主要养殖种类的微卫星分子标记的筛选及其应用进程。随着水产养殖生物的基因组测序和大规模cDNA测序,生物信息学方法分离微卫星DNA及其在近缘种的扩增筛选将越来越受到重视。
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图 1 中间球海胆肠道菌群多样性分析
注:a. 肠道菌群Alpha多样性指数;b. 肠道菌群Beta多样性分析;c. 肠道菌群样本OTUs分布韦恩图。HG. 健康组;ZG. 患病组。
Figure 1. Diversity analysis of gut bacterial community in S. intermedius
Note: a. Alpha index of gut bacterial community; b. Beta diversity analysis of gut bacterial community; c. Venn diagram of gut bacterial community with OTUs. HG. Healthy sea urchins; ZG. Diseased sea urchins.
表 1 中间球海胆肠道样品16S rRNA测序结果
Table 1 16S rRNA sequencing results of gut bacterial community in S. intermedius
样品
Sample原始序列数
Number of
original sequences有效序列数
Number of
valid sequences有效序列占比
Effective
ratio/%ZG_1 90 532 83 123 91.82 ZG_2 74 820 68 460 91.50 ZG_3 77 709 71 386 91.86 ZG_4 72 610 66 221 91.20 ZG_5 82 318 75 457 91.67 HG_1 75 986 69 356 91.27 HG_2 82 751 76 104 91.98 HG_3 86 256 79 864 92.59 HG_4 84 634 78 123 92.31 HG_5 85 561 78 946 92.27 -
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