Research on fish diversity in Xijiang Rare Fish Provincial Nature Reserve based on environmental DNA technology
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摘要:
为更好地保护西江珍稀鱼类省级自然保护区的鱼类资源，利用基于COI和12S rRNA 2个基因标记的环境DNA技术 (Environmental DNA, eDNA)，对保护区江段的左岸、中间和右岸共计18个采样站位开展了鱼类种类组成及河段不同横向断面的鱼类多样性分析。结果发现，COI和12S rRNA 2个基因共检测出53种鱼类，隶属于4目12科48属；12S rRNA基因检测出47种鱼类，COI基因检测出19种鱼类，2个基因同时检测出的鱼类有13种。基于序列丰度的Alpha多样性分析结果显示，2个基因的结果一致支持保护区江段左岸的鱼类物种数和Chao1丰富度最高，说明左岸具有较高的鱼类多样性。基于12S rRNA基因的Beta多样性结果发现，保护区的左岸、中间和右岸的鱼类组成存在显著性差异。研究结果可为保护区鱼类生物多样性的保护和动态监测提供基础资料与技术支持。
Abstract:To better protect the fish resources in the Xijiang Rare Fish Provincial Nature Reserve, we used the environmental DNA (eDNA) technology to analyze the fish species composition and fish diversity at different cross sections of 18 sampling stations on the left, middle and right banks of the river section. Two molecular markers, i.e. COI and 12S rRNA, were used in this study. The results show that the two genes of 12S rRNA and COI were detected in 53 fish species, belonging to 48 genera, 12 families and 4 orders. Forty-seven and nineteen fish species were examined based on 12S rRNA and COI, respectively. In addition, 13 shared fish species were discovered by using the two gene markers. Alpha diversity analysis based on sequence abundance shows that the two markers unanimously supported the highest number of fish species and the highest richness of Chao 1 index on the left bank of the river section, indicating that the left bank appears to have higher fish diversity than the middle and right banks. Beta diversity analysis based on 12S rRNA shows obvious differences in the fish composition on the left, middle and right banks. The research provides basic data and technical support for the protection and dynamic monitoring of fish biodiversity in this nature reserve.
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Keywords:
- Environmental DNA /
- Fish diversity /
- Nature reserve /
- Xijiang rare fish
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近几十年来，受全球气候变化和人类活动的影响，水体生态系统正遭受着严重的破坏，水生野生动物资源面临巨大威胁[1-3]。我国已把水生野生动物资源保护纳入了法制管理体系和推进生态文明建设的目标任务之中，截至2018年，已建立各级水生生物自然保护区220余处，保护了超过500万公顷的重要栖息地和超过70%的国家重点保护水生野生动物[4]。为了有效保护生物多样性，针对水生野生动物，尤其是对珍稀、濒危物种开展长期的监测和评估至关重要[5]。然而传统的资源调查方法存在破坏性强、费时费力、形态鉴别困难和稀有物种捕获率低等弊端[6]，因此亟需寻求一种行之有效的监测方法来克服传统调查方法的局限性。
环境DNA (Environmental DNA, eDNA) 技术作为传统生物监测方法的辅助手段之一，已经成为一种常规化的水生生物监测方法[7]。eDNA技术从水、土壤、沉积物、冰和空气等环境样本中提取DNA的总和[8]，利用特定于目标物种的特异性引物或广泛适用的通用引物进行聚合酶链式反应 (PCR)，之后通过高通量测序技术和生物信息学工具对环境样本中的物种DNA序列进行识别和分析[9-10]，具有灵敏度高、无破坏性、操作方便快捷、成本低等优点[11-13]，目前已在多个领域得到了广泛应用。Ogram等[14]首次利用eDNA技术研究了沉积物中的微生物种类；Ficetola等[15]首次将eDNA技术用于池塘，成功检测到了入侵物种—美国牛蛙 (Rana catesbeiana)；Sigsgaard等[16]利用eDNA技术监测丹麦沿海鱼类群落季节性变化；程如丽等[17]利用eDNA技术在乌江干流梯级水电库区检测到32种淡水鱼类；李萌等[18]运用eDNA技术在淡水生态系统中对底栖大型无脊椎动物的物种多样性进行了监测，并有效检测了外来入侵物种。eDNA技术已成为评估水生生物多样性的重要手段，在生物多样性监测和生态保护方面展现出巨大的应用前景。
在基于eDNA技术的鱼类资源调查方面，已有少量研究通过开展河流不同深度采样来探究不同梯度水层的鱼类群落结构的组成差异[19-20]。例如，周春花等[19]利用eDNA技术针对不同水层在赣江下游南昌段共检测到114种鱼类；廖敏[20]利用eDNA技术调查了雅砻江锦屏一级库区夏、秋季不同水层的鱼类分布及种类结构。然而关于河流横向水平上的鱼类群落结构的差异研究还相当匮乏，由于不同横截面表现出高度异质性的水文、地质和生物条件，不同鱼类物种的偏好性可能导致不同横断面的鱼类群落结构出现差异[8]。针对河流不同的横向断面开展鱼类多样性调查，不仅有助于了解鱼类种类组成情况，还能够更全面地反映鱼类资源状况。
西江珍稀鱼类省级自然保护区 (111°30'07''E—111°30'53''E、23°20'22''N—23°21'55''N，以下简称“保护区”) 位于广东省肇庆市封开县青皮塘江段。保护区江段全长7 500 m，平均宽度1 250 m，总面积940 hm2。由于航道整治工程建设、过度捕捞、水体污染和产卵场被破坏等影响，保护区江段鱼类资源呈现出明显的衰退趋势，鱼类生物多样性不断下降[21-23]。为有效保护渔业资源，从1992年起保护区江段开始实施繁殖期禁渔保护，2011年起延长了禁渔期时间，渔业资源衰退趋势有所减缓[24]。在当前生态优先、绿色发展的背景下，为了保护鱼类资源，迫切需要掌握保护区内鱼类资源的现状。本研究首次利用eDNA技术对西江珍稀鱼类省级自然保护区的鱼类多样性进行了评估，比较了不同横截面的鱼类群落结构差异，初步探索了保护区内鱼类资源监测和保护的新方法，为制定和执行保护区的渔业管理和生态保护政策奠定了坚实的科学基础。
1. 材料与方法
1.1 采样时间及站点设置
本次调查采样时间为2023年5月。在保护区江段按等距原则设置6个断面，每个断面分左岸 (L1—L6)、中间 (M1—M6) 和右岸 (R1—R6) 进行采样，共18个采样站位，各采样站位具体分布见图1。
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图 1 采样站位示意图注：L1—L6 为左岸区域；M1—M6 为中间区域；R1—R6 为右岸区域。Figure 1. Information of sampling stationsNote: L1–L6 are the left bank area; M1–M6 are the middle area; R1–R6 are the right bank area.1.2 样品采集
采集每个站位的表层、中层和底层水样各1 000 mL，分别置于聚乙烯瓶中。采样前使用10% (w) 次氯酸钠溶液对所有采水设备进行清洗消毒，每次采样时均佩戴无菌手套。采集的水样均在24 h内使用0.45 μm混合纤维素滤膜 (Whatman，英国) 进行真空抽滤，抽滤之前将所有设备进行消毒处理，避免样品之间相互污染。样品在抽滤时，设立1个阴性对照来监测和确定是否存在外源DNA污染[25]。将每个站位采集的表层、中层和底层水样混合后进行抽滤，每个样品抽滤2 000 mL，每个站位抽滤1个样品，共计18个样品。所有样品抽滤后，将滤膜存于无酶冻存管并放入液氮罐中冷冻保存，待运回实验室后转移至 −80 ℃冰箱保存，直至进行DNA提取。
1.3 DNA提取
使用Qiagen公司的PowerWater DNA Isolation Kits试剂盒，遵循试剂盒使用指南分离滤膜中的DNA，并利用1% (w) 琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的纯度和完整性。每份样品均单独进行DNA提取，并设置空白滤膜作为阴性对照。提取完成后，将DNA样本迅速转移至 −20 ℃环境下保存，直至进行PCR扩增。
1.4 目的基因扩增与高通量测序
使用鱼类eDNA宏条形码分析的常用引物Tele02-F (5'-AAACTCGTGCCAGCCACC-3') 和Tele02-R (5'-GGGTATCTAATCCCAGTTTG-3') 扩增线粒体12S rRNA基因序列片段扩增序列长度约200 bp；mlCOlintF (5'-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3') 和jgHCO2198 (5'-TAIACYTCIGGRTGICCRAARAA YCA-3') 扩增线粒体COI基因序列片段，扩增序列长度约313 bp[26]。PCR反应体系为：模板DNA (10 ng·μL−1) 2~5 μL、正反向引物 (5 μmol·L−1) 各0.8 μL、dNTPs 2 μL、5×FastPfu缓冲液4 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、无菌ddH2O将体系补至20 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。为了监控实验过程中可能发生的污染，每次PCR反应均设置无菌水为模板的阴性对照。PCR产物通过2% (w) 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，以确认特异性扩增条带的存在。阴性对照样品中未观察到非特异性条带，表明整个实验流程均未受到外源性鱼类DNA的污染。PCR产物经过凝胶电泳纯化后，送至上海凌恩生物科技有限公司，利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行高通量测序。
1.5 数据处理与分析
将各站位测序的原始结果进行质控和过滤，得到的PE reads首先根据overlap关系拼接成一条序列 (根据正反barcode和引物的方向对序列进行方向校正)。使用Usearch软件结合gold数据库，通过denovo和reference结合的方法去除嵌合体序列，从而得到纯净、高质量的序列数据，以97%的相似度标准对序列进行操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTU) 的聚类分析。然后将每个OTU的代表序列与MitoFish (http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/) 和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/) 数据库进行比对分析和物种分类注释，得到所对应的OTU丰度表。对于能够匹配到相同物种的OTU进行合并处理；未能匹配鱼类物种的序列则剔除。基于OTU聚类与注释的结果，进一步进行物种组成、Alpha多样性 (群落丰富度和多样性) 和Beta多样性 (不同样本间的群落组成差异) 分析。在物种鉴定过程中，基于已有的eDNA相关研究，本研究也设定了identity值需达到97%以上且E-value小于10−5的严格标准[17-19]。对于注释的鱼类结果，结合西江流域鱼类历史数据资料，去除了不太可能属于该水域的鱼类OTU序列。为了确保鱼类分类信息的准确性，参考《珠江鱼类志》[27]和《中国内陆鱼类物种与分布》[28]等。Alpha多样性分析分别选取反映群落丰富度的Chao1指数 (Chao1 index)[29]，以及反映群落多样性的香农指数 (Shannon index)[30]和辛普森指数 (Gini-Simpson index)[31]。在研究Beta多样性时，采用基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析 (PcoA principal coordinate analysis) 方法[32]，探索不同样本生物群落结构的差异性。
2. 结果
2.1 鱼类物种组成
12S rRNA基因测序共获得11 451 079条序列，聚类分析获得9 570个OTU。其中，非目标物种序列7 970 685条，占69.61%；OTU 7 335个，占76.65%。目标物种序列3 480 394条，占30.39%；OTU 2 235个，占23.35%。获得的2 235个OTU经比对和注释共鉴定出47种鱼类，隶属于4目12科44属。其中，鲤形目种类最多 (29种)，占检测鱼类总数的61.7%；鲇形目9种，占19.1%；鲈形目8种，占17.0%；鲀形目1种。保护区的左岸、中间和右岸分别检出40、32和34种鱼类，物种组成及检出序列数见表1和图2。黄尾鲴 (Xenocypris davidi)、鳊 (Parabramis pekinensis)、青鱼 (Mylopharyngodon piceus)、鳙 (Aristichthys nobilis)、鲮 (Cirrhinus molitorella)、䱗 (Hemiculter leucisculus)、鲢 (Hypophthalmichthys molitrix)、赤眼鳟 (Squaliobarbus curriculus)、广东鲂 (Megalobrama terminalis) 和鲤 (Cyprinus carpio) 10个物种在各采样站位中均被检测到。
表 1 基于12S rRNA和COI基因检测的物种名录及序列数Table 1. List of fish species and sequence number of detected based on 12S rRNA and COI genes种类
Species12S rRNA COI 左岸
Left bank中间
Middle bank右岸
Right bank左岸
Left bank中间
Middle bank右岸
Right bank鲤形目 Cypriniformes 鲤科 Cyprinidae 宽鳍鱲 Zacco platypus 54 93 8 171 0 0 0 马口鱼 Opsariichthys bidens● 0 0 0 1 308 1 403 1 677 南方波鱼 Rasbora steineri 0 0 0 709 1 155 693 青鱼 Mylopharyngodon piceus 14 043 436 1 699 0 0 0 草鱼 Ctenopharyngodon idella 4 639 22 577 6 209 594 270 442 鳤 Ochetobius elongatus 6 521 78 12 0 0 0 鳡 Elopichthys bambusa 35 532 12 799 10128 1 699 1 437 498 赤眼鳟 Squaliobarbus curriculus 90 047 28 123 23 347 197 1 0 银飘鱼 Pseudolaubuca sinensis 2 781 20 893 275 0 0 0 鳊 Parabramis pekinensis 4 774 487 494 0 0 0 䱗 Hemiculter leucisculus 853 176 224 336 29 961 0 0 0 细鳊 Metzia formosae● 3 0 0 0 0 0 南方拟䱗 Pseudohemiculter dispar● 0 0 0 543 6 0 海南似鱎 Toxabramis houdemeri 4 0 0 0 0 0 广东鲂 Megalobrama terminalis 3 268 50 479 9 171 12 54 1 海南鲌 Chanodichthys erythropterus 0 0 1 0 0 0 黄尾鲴 Xenocypris davidi 953 229 383 550 20 524 4 070 1 059 95 圆吻鲴 Distoechodon tumirostris● 5 2 2 0 0 0 鲢 Hypophthalmichthys molitrix 36 452 379 14 407 74 406 46 鳙 Aristichthys nobilis 29 337 16 072 22 872 0 0 0 银鮈 Squalidus argentatus 1 6 433 4 0 100 0 福建小鳔鮈 Microphysogobio fukiensis● 1 1 866 0 0 0 0 兴凯鱊 Acanthorhodeus chankaensis● 3 260 0 0 0 0 0 越南鱊 Acheilognathus tonkinensis● 0 0 482 6 52 0 高体鳑鲏 Rhodeus ocellatus 5 521 78 071 1 760 0 25 0 倒刺鲃 Spinibarbus denticulatus 37 1 3 098 0 0 0 虹彩光唇鱼 Acrossocheilus iridescens● 0 23 6 0 0 0 鲮 Cirrhinus molitorella 60 257 55 395 26 860 0 0 0 纹唇鱼 Osteochilus salsburyi 0 18 581 0 0 0 0 鲤 Cyprinus carpio 62 807 63 992 53 396 145 13 158 鲫 Carassius cuvieri 12 1 0 0 0 0 平鳍鳅科 Homalopteridae 平舟原缨口鳅 Vanmanenia pingchowensis● 0 0 9 0 0 0 鲇形目 Siluriformes 鲇科 Siluridae 鲇 Silurus asotus 831 0 0 0 0 0 大口鲇 Silurus meridionalis● 565 0 0 0 0 0 胡子鲇科 Clariidae 革胡子鲇 Clarias gariepinus▲● 1 0 0 0 0 0 甲鲶科 Loricariidae 豹纹翼甲鲇 Pterygoplichthys pardalis▲● 4 853 8 315 0 0 0 长臀鮈科 Cranoglanididae 长臀鮈 Cranoglanis bouderius 0 0 191 0 0 0 鲿科 Bagridae 黄颡鱼 Pelteobagrus fulvidraco 0 0 905 0 0 0 瓦氏黄颡鱼 Pseudobagrus vachelli 0 0 0 1 000 388 376 粗唇鮈 Pseudobagrus crassilabris 947 0 1 303 25 0 0 条纹鮈 Tachysurus virgatus 863 0 0 0 0 0 斑鳠 Hemibagrus guttatus★ 178 4 233 49 0 0 0 鲈形目 Perciformes 鮨鲈科 Percichthyidae 斑鳜 Siniperca scherzeri 1 106 0 0 0 0 0 波纹鳜 Siniperca undulata● 626 2 0 0 0 0 大眼鳜 Siniperca knerii 0 0 0 2 0 0 花鲈 Lateolabrax japonicus 0 0 0 27 133 0 刺臀鱼科 Centrarchidae 大口黑鲈 Micropterus salmoides▲● 1 075 0 0 0 0 0 丽鱼科 Cichlidae 齐氏罗非鱼 Coptodon zillii▲● 8 762 6 784 5 0 530 0 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus▲ 3 927 3 5 660 641 1 192 296 鰕虎鱼科 Gobiidae 金黄舌鰕虎 Glossogobius aureus● 356 2 291 4 0 0 0 粘皮鲻鰕虎 Mugilogobius myxodermus● 1 10 3 0 0 0 波氏吻鰕虎 Rhinogobius cliffordpopei● 6 11 266 82 0 0 0 鲀形目 Tetraodontiformes 鲀科 Tetraodontidae 弓斑东方鲀Takifugu ocellatus 2 013 27 400 10 454 0 0 0 注：▲. 外来物种；★. 国家重点保护水生野生动物；●. 与李捷等[21]2006—2008年保护区调查相比的新增种类。 Note: ▲. Alien species; ★. National key protected aquatic wildlife; ●. New species compared with the conservation area survey conducted by Li et al[21] from 2006 to 2008. COI基因测序共获得9 702 198条序列，聚类分析获得38 372个OTU。其中，非目标物种序列9 678 640条，占99.76%；OTU 38 083个，占99.25%。目标物种序列23 558条，占0.24%；OTU 289个，占0.75%。获得的289个OTU经比对和注释共鉴定出19种鱼类，隶属于3目4科18属。其中，鲤形目种类最多 (13种)，占检测鱼类总数的68.4%；鲈形目4种，占21.1%；鲇形目2种，占10.5%。保护区的左岸、中间和右岸分别检出16、17和10种鱼类，物种组成及检出序列数见表1和图2。
基于12S rRNA和COI基因共检测出53种鱼类，隶属于4目12科48属 (表1)。其中，鲤形目种类最多 (33种)，占检测鱼类总数的61.1%；鲇形目和鲈形目均为10种，各占18.5%；鲀形目1种。检出鱼类种类包含国家II级保护鱼类1种：斑鳠 (Hemibagrus guttatus)；外来入侵物种5种：革胡子鲇 (Clarias gariepinus)、齐氏罗非鱼 (Coptodon zillii)、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)、豹纹翼甲鲇 (Pterygoplichthys pardalis) 和大口黑鲈 (Micropterus salmoides)。其中，齐氏罗非鱼、尼罗罗非鱼和豹纹翼甲鲇在12S rRNA的检测结果中具有较高的序列丰度。
12S rRNA和COI基因共同检测出的鱼类有13种，但是在鱼类检出序列数方面存在较大差异。仅被12S rRNA基因检测到的物种有：序列丰度相对较高的宽鳍鱲 (Zacco platypus)、青鱼、䱗、鳙、倒刺鲃 (Spinibarbus denticulatus) 和鲮，以及序列丰度较低的珍稀濒危鱼类斑鳠和鳤 (Ochetobius elongatus)。马口鱼 (Opsariichthys bidens)、南方波鱼 (Rasbora steineri) 和瓦氏黄颡鱼 (Pseudobagrus vachelli) 仅被COI基因检测到，并显示出相对较高的序列丰度。
2.2 Alpha多样性分析
每个站位的物种数以及Chao1、Shannon、Simpson指数和覆盖度Coverage见表2。各站位的Coverage值介于0.97~1.00，表明测序深度基本覆盖全部OTU数据。基于12S rRNA基因的检测结果发现，左岸的平均物种数和Chao1指数最高，中间的最低 (图3-a—3-b)；独立样本t检验的Chao1指数和物种数t检验结果分别为 t=0.747，df=10，p=0.491和t=1.496，df=10，p=0.692。基于COI基因的检测结果显示，左岸站位的平均物种数和Chao1指数最高，中间的最低 (图3-c—3-d)；独立样本t检验的Chao1指数和物种数t检验结果分别为t=2.487，df=10，p=0.033和t=2.449，df=10，p=0.005，表明左岸Chao1指数和物种数与其他2个采样断面存在显著性差异。
表 2 各区域Alpha多样性指数Table 2. Alpha diversity index of each area区域
Area物种数
Species indexChao1指数
Chao1 index香农指数
Shannon index辛普森指数
Gini-Simpson index覆盖度
Coverage12S rRNA COI 12S rRNA COI 12S rRNA COI 12S rRNA COI 12S rRNA COI L1 26 10 1.94 1.20 1.60 1.60 0.70 0.69 1.00 1.00 L2 28 8 2.11 0.98 1.67 0.34 0.72 0.13 1.00 1.00 L3 31 9 2.32 1.08 1.20 0.51 0.60 0.20 1.00 1.00 L4 27 3 2.02 0.46 1.66 0.41 0.71 0.21 1.00 1.00 L5 24 3 1.79 0.41 1.36 0.70 0.67 0.48 1.00 0.99 L6 32 8 2.41 1.01 1.65 1.17 0.72 0.64 1.00 0.99 M1 28 4 2.22 0.63 2.18 0.89 0.85 0.55 1.00 0.99 M2 27 5 2.16 0.70 2.17 1.15 0.86 0.61 1.00 1.00 M3 21 4 1.63 0.45 1.61 0.79 0.77 0.49 1.00 1.00 M4 24 3 1.86 0.28 1.53 0.55 0.66 0.34 1.00 1.00 M5 29 3 2.27 0.45 1.78 0.71 0.75 0.48 1.00 0.99 M6 23 3 1.81 0.37 1.83 0.71 0.75 0.50 1.00 0.99 R1 25 4 2.35 0.52 1.40 0.89 0.60 0.55 0.99 0.99 R2 29 5 2.54 0.92 1.83 0.88 0.76 0.45 1.00 0.98 R3 24 6 2.12 0.87 1.97 0.54 0.80 0.25 0.99 0.99 R4 24 5 2.11 0.91 1.66 1.11 0.67 0.60 0.99 0.99 R5 21 1 1.72 0 2.24 0 0.85 0 1.00 0.97 R6 17 2 1.39 0.91 1.55 0.64 0.73 0.67 1.00 0.98 注：L1—L6为左岸区域；M1—M6为中间区域；R1—R6为右岸区域。 Note: L1–L6 are the left bank area; M1–M6 are the middle area; R1–R6 are the right bank area. ![]()
图 3 不同横向采样断面平均物种数与Alpha多样性指数注：a和b表示12S rRNA的鉴定结果；c和d表示COI的鉴定结果。Figure 3. Average species number and Alpha diversity indexes of different transverse sectionsNote: a and b represent identification results based on 12S rRNA; c and d represent identification results based on COI.2.3 Beta多样性分析
基于各采样站位eDNA检测的鱼类物种序列丰度数据，采用Bray-Curtis距离矩阵的PCoA分析比较各站位鱼类种类组成的相似性。12S rRNA基因的检测结果显示，保护区左岸、中间和右岸区域鱼类群落结构组成存在显著性差异，而保护区左岸、中间和右岸区域内部鱼类群落结构均具有很大的相似性。COI基因的检测结果发现，保护区左岸、中间和右岸的各采样站位之间距离均较近，暗示鱼类群落结构相似性较高 (图4)。
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图 4 基于12S rRNA (左) 和COI基因 (右) 的各区域eDNA检测鱼类组成相似性Figure 4. Composition similarity of fish detected in each area based on 12S rRNA (Left) and COI gene (Right) of eDNA3. 讨论
3.1 鱼类物种组成
本研究首次运用eDNA技术分析了西江珍稀鱼类省级自然保护区的鱼类生物多样性，共检出鱼类53种。与李捷等[21]在2006—2008年开展的鱼类多样性调查结果 (81种) 相比，本研究检出的鱼类中有35种出现在保护区的调查鱼类名录中，占检测物种的66%，再次验证了eDNA技术在鱼类资源监测中的有效性。但也有一些小型底栖鱼类如棒花鱼 (Abbottina rivularis)、乐山小鳔鮈 (Microphysogobio kiatingensis)、美丽小条鳅 (Micronemacheilus puicher)、壮体沙鳅 (Botia robusta) 等未被检测到，可能是由于这些物种在水环境中释放的DNA量较小。近年来，由于水利工程、航运开发、水体污染和过度捕捞等人类涉水活动的影响[33-34]，江河水生生态环境遭到严重破坏，鱼类生物多样性不断下降[35-36]。与历史调查监测数据相比，本次保护区鱼类调查种类数减少，但检测出的鱼类区系组成与历史调查结果相一致，均表明保护区的鱼类种类组成主要以鲤科为主。其中鲮、赤眼鳟、黄尾鲴、鲤、广东鲂等经济鱼类以及䱗等小型鱼类在各站位均被检出，且具有较高的序列丰度，说明这些物种可能是保护区的主要优势种类，与李捷等[21]2006—2008年及本课题组近些年的调查结果 (未发表) 相似，表明eDNA技术在监测优势类群上具有较高的可信度。
本研究的一个重要发现是在保护区检测到珍稀濒危鱼类—斑鳠和鳤。斑鳠和鳤在西江中下游资源量少，在传统调查中难以被监测到。因此，本研究也证实了eDNA技术在珍稀濒危鱼类的监测中具有巨大的优势，能够有效辅助珍稀濒危鱼类的长期监测工作。另外还监测到5种外来鱼类，分别是尼罗罗非鱼、齐氏罗非鱼、豹纹翼甲鲇、大口黑鲈和革胡子鲶，其中尼罗罗非鱼和齐氏罗非鱼具有较高的序列丰度，表明这2个物种可能具有一定的资源量。已有不少研究证实尼罗罗非鱼和齐氏罗非鱼在珠江流域定殖成功，遍布整个流域并在多个江段发展成为优势类群[37-42]。外来物种的入侵会对保护区土著鱼类的栖息地和生境造成破坏[43]，并通过与土著种竞争成为优势种，进而对本地物种产生影响[15]。因此，在未来的研究中，eDNA技术可以用来监测其他保护区外来物种的入侵状况。
3.2 不同基因检出效率比较
12S rRNA基因检出了宽鳍鱲、青鱼、䱗、鳙、倒刺鲃和鲮等，并具有较高的序列丰度，而COI基因未检测到这些种类，表明COI基因的引物对这些鱼类的检出效率不高，可能是由于本研究使用的COI基因引物对这些鱼类DNA的扩增效率不高。朱书礼等[44]的研究也表明COI基因对广东鲂和鲮的检测效率较低。相反，基于COI基因检出了马口鱼、南方波鱼和瓦氏黄颡鱼，并具有较高的序列丰度，而12S rRNA基因却未检测到这些种类，说明12S rRNA基因的引物可能对这几种鱼类的检出效率不高。总体上，12S rRNA基因引物的鱼类物种检出能力高于COI基因。已有不少研究证实，使用12S rRNA引物对鱼类物种的检出能力优于其他引物[45-47]。COI基因引物对原核生物和非鱼类真核生物DNA的非特异性扩增导致其在涉及鱼类的eDNA研究中应用较为困难[48-49]。在低模板浓度的情况下，非特异性扩增会导致测序结果错误或物种鉴定不准确的问题[49]，这也造成本研究基于不同基因的物种检测结果差距较大。根据eDNA检测的目的不同，选用的基因和引物也有所不同，其中特异性引物用于单物种检测，而通用引物常用于不同类群的评估。在eDNA的相关研究中，COI基因是进行物种特异性检测的常用标记，而12S rRNA基因主要应用于多类群的鱼类多样性评估[11,50]。选取多个目的基因进行PCR，构建多基因克隆文库可以提高eDNA的检测能力。Djurhuus等[51]通过增加多个目的基因进行PCR反应及测序，极大地提高了eDNA的检测能力。
3.3 鱼类多样性分析
基于2个不同基因的Alpha多样性分析结果表明，保护区左岸的平均鱼类物种数和群落丰富度均高于中间和右岸。该保护区江段最主要的特征是：距离右岸50~170 m为深水区，水深约5.2~7.2 m，岸边有些地方有巨石，有的延伸到河中，河中亦分布有较多巨石、暗礁，底质为石头、粗砂砾，旋涡多，水流比较紊乱，泡沫水翻滚，无水草；左岸为水深约0.1~1.5 m的沙底浅滩，江底较为平缓，有许多小型沙丘状凸起，礁石较少，旋涡少，水势较为平缓[52]。保护区左岸鱼类物种检出数及群落丰富度高于中间和右岸的原因可能为：1) 左岸为沙滩缓流生境，上游贺江以及居民区带来的营养物种容易在该江段囤积，使得营养物种丰富，促进更多的鱼类物种聚集于此栖息[44]；2) 该江段是西江航运的重要通道，其中中间江段与右岸由于水深较大，有大量船舶通过，干扰了部分鱼类的生活，可能导致鱼类物种数和丰富度相对较低。
12S rRNA基因的检测结果表明，保护区的鱼类群落结构在左岸、中间和右岸区域各采样站位均具有较大的相似性，然而左岸、中间和右岸的鱼类群落结构组成存在差异。因为在保护区左岸区域鱼类群落中检测到的黄尾鲴和䱗占据了优势地位，与其他种类相比，可能导致了它们在丰度上的明显优势，从而造成了左岸区域虽然鱼类群落丰富度较高、但群落多样性较低的现象。相比之下，COI基因的检测结果显示，保护区左岸、中间和右岸鱼类群落结构具有一定的相似性，这可能与COI基因检测出的鱼类种类数和序列数较少有关。
3.4 eDNA技术的局限性
本研究基于2个分子标记的eDNA技术在保护区江段检测到鱼类53种，相较于传统的捕捞调查 (81种) 仍有较大的差距[21]。在传统捕捞调查中具有一定资源量的鳅科鱼类 [泥鳅 (Misgurnus anguillicaudatus)、美丽小条鳅、中华花鳅 (Cobitis sinensis) 等] 未在本研究中检测到，表明eDNA技术在物种监测中仍存在一定的局限性。造成这种现象的主要原因有：1) 本研究存在调查周期较短、调查季节单一以及涉及断面有限等问题，导致资源量少、季节性出现的鱼类物种可能未被监测到。2) 水体中DNA浓度的稀释以及水样DNA样本的降解，会在一定程度上影响物种检测的效率。已有研究表明，生物体释放到水体环境中的DNA会随时间降解[53-54]。eDNA的持久性受目标物种的密度、生命周期特征、物种相互作用和大小的影响[55-56]。此外，生物因素 (如细菌和真菌的浓度) 和非生物因素 (如核酸酶活性、pH、氧含量、电导率、温度、盐度和紫外线暴露) 也会影响eDNA的稳定性[57-59]。3) eDNA中使用的引物存在特异性，可能导致部分物种扩增失败。已有研究表明，本研究使用的2对引物具有偏好性，容易使个别具有优势的物种过度扩增，而导致一些低丰度或不被偏好的物种难以检测到[60]。因此，为提高eDNA 技术结果的准确性，在完善操作流程的同时，还需要进一步优化通用引物。
4. 结论
eDNA技术在鱼类检测方面展现出高灵敏度、环境友好性、操作便捷性以及较高的种类鉴别准确率和效率等优势，在鱼类多样性的监测和保护领域具有广阔的应用前景。本研究基于12S rRNA和COI引物的eDNA技术调查了西江珍稀鱼类省级自然保护区的鱼类多样性，共检出鱼类53种，较历史资料新增18种，验证了eDNA技术在保护区鱼类检测中应用的有效性和可行性。通过对保护区左岸、中间和右岸的鱼类群落进行Alpha和Beta多样性分析表明，左岸的鱼类丰富度和多样性均较高，左岸、中间和右岸的鱼类群落结构组成存在差异。目前，eDNA技术作为传统鱼类监测方法的辅助手段，2种技术的结合可以更全面地完成保护区鱼类多样性监测任务，将在未来保护区的管理与保护工作中发挥重要作用。
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图 1 采样站位示意图
注：L1—L6 为左岸区域；M1—M6 为中间区域；R1—R6 为右岸区域。
Figure 1. Information of sampling stations
Note: L1–L6 are the left bank area; M1–M6 are the middle area; R1–R6 are the right bank area.
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图 3 不同横向采样断面平均物种数与Alpha多样性指数
注：a和b表示12S rRNA的鉴定结果；c和d表示COI的鉴定结果。
Figure 3. Average species number and Alpha diversity indexes of different transverse sections
Note: a and b represent identification results based on 12S rRNA; c and d represent identification results based on COI.
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图 4 基于12S rRNA (左) 和COI基因 (右) 的各区域eDNA检测鱼类组成相似性
Figure 4. Composition similarity of fish detected in each area based on 12S rRNA (Left) and COI gene (Right) of eDNA
表 1 基于12S rRNA和COI基因检测的物种名录及序列数
Table 1 List of fish species and sequence number of detected based on 12S rRNA and COI genes
种类
Species12S rRNA COI 左岸
Left bank中间
Middle bank右岸
Right bank左岸
Left bank中间
Middle bank右岸
Right bank鲤形目 Cypriniformes 鲤科 Cyprinidae 宽鳍鱲 Zacco platypus 54 93 8 171 0 0 0 马口鱼 Opsariichthys bidens● 0 0 0 1 308 1 403 1 677 南方波鱼 Rasbora steineri 0 0 0 709 1 155 693 青鱼 Mylopharyngodon piceus 14 043 436 1 699 0 0 0 草鱼 Ctenopharyngodon idella 4 639 22 577 6 209 594 270 442 鳤 Ochetobius elongatus 6 521 78 12 0 0 0 鳡 Elopichthys bambusa 35 532 12 799 10128 1 699 1 437 498 赤眼鳟 Squaliobarbus curriculus 90 047 28 123 23 347 197 1 0 银飘鱼 Pseudolaubuca sinensis 2 781 20 893 275 0 0 0 鳊 Parabramis pekinensis 4 774 487 494 0 0 0 䱗 Hemiculter leucisculus 853 176 224 336 29 961 0 0 0 细鳊 Metzia formosae● 3 0 0 0 0 0 南方拟䱗 Pseudohemiculter dispar● 0 0 0 543 6 0 海南似鱎 Toxabramis houdemeri 4 0 0 0 0 0 广东鲂 Megalobrama terminalis 3 268 50 479 9 171 12 54 1 海南鲌 Chanodichthys erythropterus 0 0 1 0 0 0 黄尾鲴 Xenocypris davidi 953 229 383 550 20 524 4 070 1 059 95 圆吻鲴 Distoechodon tumirostris● 5 2 2 0 0 0 鲢 Hypophthalmichthys molitrix 36 452 379 14 407 74 406 46 鳙 Aristichthys nobilis 29 337 16 072 22 872 0 0 0 银鮈 Squalidus argentatus 1 6 433 4 0 100 0 福建小鳔鮈 Microphysogobio fukiensis● 1 1 866 0 0 0 0 兴凯鱊 Acanthorhodeus chankaensis● 3 260 0 0 0 0 0 越南鱊 Acheilognathus tonkinensis● 0 0 482 6 52 0 高体鳑鲏 Rhodeus ocellatus 5 521 78 071 1 760 0 25 0 倒刺鲃 Spinibarbus denticulatus 37 1 3 098 0 0 0 虹彩光唇鱼 Acrossocheilus iridescens● 0 23 6 0 0 0 鲮 Cirrhinus molitorella 60 257 55 395 26 860 0 0 0 纹唇鱼 Osteochilus salsburyi 0 18 581 0 0 0 0 鲤 Cyprinus carpio 62 807 63 992 53 396 145 13 158 鲫 Carassius cuvieri 12 1 0 0 0 0 平鳍鳅科 Homalopteridae 平舟原缨口鳅 Vanmanenia pingchowensis● 0 0 9 0 0 0 鲇形目 Siluriformes 鲇科 Siluridae 鲇 Silurus asotus 831 0 0 0 0 0 大口鲇 Silurus meridionalis● 565 0 0 0 0 0 胡子鲇科 Clariidae 革胡子鲇 Clarias gariepinus▲● 1 0 0 0 0 0 甲鲶科 Loricariidae 豹纹翼甲鲇 Pterygoplichthys pardalis▲● 4 853 8 315 0 0 0 长臀鮈科 Cranoglanididae 长臀鮈 Cranoglanis bouderius 0 0 191 0 0 0 鲿科 Bagridae 黄颡鱼 Pelteobagrus fulvidraco 0 0 905 0 0 0 瓦氏黄颡鱼 Pseudobagrus vachelli 0 0 0 1 000 388 376 粗唇鮈 Pseudobagrus crassilabris 947 0 1 303 25 0 0 条纹鮈 Tachysurus virgatus 863 0 0 0 0 0 斑鳠 Hemibagrus guttatus★ 178 4 233 49 0 0 0 鲈形目 Perciformes 鮨鲈科 Percichthyidae 斑鳜 Siniperca scherzeri 1 106 0 0 0 0 0 波纹鳜 Siniperca undulata● 626 2 0 0 0 0 大眼鳜 Siniperca knerii 0 0 0 2 0 0 花鲈 Lateolabrax japonicus 0 0 0 27 133 0 刺臀鱼科 Centrarchidae 大口黑鲈 Micropterus salmoides▲● 1 075 0 0 0 0 0 丽鱼科 Cichlidae 齐氏罗非鱼 Coptodon zillii▲● 8 762 6 784 5 0 530 0 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus▲ 3 927 3 5 660 641 1 192 296 鰕虎鱼科 Gobiidae 金黄舌鰕虎 Glossogobius aureus● 356 2 291 4 0 0 0 粘皮鲻鰕虎 Mugilogobius myxodermus● 1 10 3 0 0 0 波氏吻鰕虎 Rhinogobius cliffordpopei● 6 11 266 82 0 0 0 鲀形目 Tetraodontiformes 鲀科 Tetraodontidae 弓斑东方鲀Takifugu ocellatus 2 013 27 400 10 454 0 0 0 注：▲. 外来物种；★. 国家重点保护水生野生动物；●. 与李捷等[21]2006—2008年保护区调查相比的新增种类。 Note: ▲. Alien species; ★. National key protected aquatic wildlife; ●. New species compared with the conservation area survey conducted by Li et al[21] from 2006 to 2008. 
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表 2 各区域Alpha多样性指数
Table 2 Alpha diversity index of each area
区域
Area物种数
Species indexChao1指数
Chao1 index香农指数
Shannon index辛普森指数
Gini-Simpson index覆盖度
Coverage12S rRNA COI 12S rRNA COI 12S rRNA COI 12S rRNA COI 12S rRNA COI L1 26 10 1.94 1.20 1.60 1.60 0.70 0.69 1.00 1.00 L2 28 8 2.11 0.98 1.67 0.34 0.72 0.13 1.00 1.00 L3 31 9 2.32 1.08 1.20 0.51 0.60 0.20 1.00 1.00 L4 27 3 2.02 0.46 1.66 0.41 0.71 0.21 1.00 1.00 L5 24 3 1.79 0.41 1.36 0.70 0.67 0.48 1.00 0.99 L6 32 8 2.41 1.01 1.65 1.17 0.72 0.64 1.00 0.99 M1 28 4 2.22 0.63 2.18 0.89 0.85 0.55 1.00 0.99 M2 27 5 2.16 0.70 2.17 1.15 0.86 0.61 1.00 1.00 M3 21 4 1.63 0.45 1.61 0.79 0.77 0.49 1.00 1.00 M4 24 3 1.86 0.28 1.53 0.55 0.66 0.34 1.00 1.00 M5 29 3 2.27 0.45 1.78 0.71 0.75 0.48 1.00 0.99 M6 23 3 1.81 0.37 1.83 0.71 0.75 0.50 1.00 0.99 R1 25 4 2.35 0.52 1.40 0.89 0.60 0.55 0.99 0.99 R2 29 5 2.54 0.92 1.83 0.88 0.76 0.45 1.00 0.98 R3 24 6 2.12 0.87 1.97 0.54 0.80 0.25 0.99 0.99 R4 24 5 2.11 0.91 1.66 1.11 0.67 0.60 0.99 0.99 R5 21 1 1.72 0 2.24 0 0.85 0 1.00 0.97 R6 17 2 1.39 0.91 1.55 0.64 0.73 0.67 1.00 0.98 注：L1—L6为左岸区域；M1—M6为中间区域；R1—R6为右岸区域。 Note: L1–L6 are the left bank area; M1–M6 are the middle area; R1–R6 are the right bank area.
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